Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l'efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.
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Articolo metodologico
Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Capsula del polisaccaride di Cryptococcus neoformans è il fattore di virulenza primario e uno dei più comunemente studiato gli aspetti di questo lievito patogeno. Capsula dimensione può variare ampiamente tra i ceppi, ha la capacità di crescere rapidamente quando presentare a condizioni stressanti o basse nutriente ed è stata correlata positivamente con virulenza del ceppo. Per questi motivi, la dimensione della capsula è di grande interesse per i ricercatori di c. neoformans . La crescita della capsula c. neoformans è indotta durante le prove fenotipiche per comprendere gli effetti dei diversi trattamenti sulle differenze tra ceppi di lievito o dimensione. Qui descriviamo uno dei metodi standard di capsula induzione e confrontare due metodi accettati di colorazione e diametro capsula di misura: (i) inchiostro di India, un mordente negativo, usato in congiunzione con microscopia chiara convenzionale e (ii) Co-colorazione con coloranti fluorescenti della parete cellulare e capsula seguita da microscopia confocal. Infine, vi mostriamo come misura di diametro capsula da campioni di inchiostro di India-macchiato può essere automatizzato utilizzando analisi computazionale delle immagini.
Introduzione
Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l'agente causativo di dermatosi da criptococco1,2, 3. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di....
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Protocollo
Nota: C. neoformans è un agente patogeno di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) e i ricercatori che lavorano con esso devono prendere le dovute precauzioni. Procedure dettagliate su come sicuro lavoro con agenti patogeni BSL-2 può essere scoperto sul Center for Disease Control (CDC) sito Web, ma è importante notare che tutte le persone che vengono a contatto con il c. neoformans devono essere adeguatamente addestrate nella gestione gli agenti patogeni e dovrebbe sempre indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE), generalmente in lattice o nitrile guanti. Ulteriormente, rotori su centrifughe devono essere sigillati per evitare la n....
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Risultati
Per illustrare la capsula induzione, macchiatura delle cellule, imaging e tecniche di misurazione, abbiamo utilizzato tre ceppi di c. neoformans: ceppo il laboratorio comune, ben caratterizzato, H99S30e due ceppi clinicamente isolati di precedentemente diametro capsula sconosciuto, B18 e B5231.
Il flusso di lavoro di induzione capsula, colorazione e acquisizione di immagin.......
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Discussione
Per decenni, la capsula è stata degli obiettivi principali della ricerca per micologi e clinici interessati a c. neoformans e dermatosi da criptococco dovuto il relativo ruolo come fattore di virulenza principali per l'agente patogeno. Usando la microscopia per misurare differenze di dimensioni capsula tra ceppi e in crescita differente condizioni possono fornire informazioni importanti per l'agente patogeno e le sue risposte ai vari stimoli (cioè, diverse condizioni ambientali, possibili trattamenti fa.......
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Dichiarazioni
L'autore, Hoyin Lai, è il product manager di DRVision che pubblica il software di analisi di immagine automatizzato, Aivia.
Ringraziamenti
Ringraziamo il programma di dottorato di scienze biologiche molecolari (MOBI) e il dipartimento di biologia a Middle Tennessee State University (MTSU) per fornire i finanziamenti per questo studio. Il progetto è stato inoltre finanziato in parte da una sovvenzione di progetti speciali per D.E.N. dalla Fondazione MTSU.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Induzione della capsula | |||
| C. cellule neoformans | Il ceppo di laboratorio clinico, H99S, è stato un gentile dono del Dr. John Perfect (Duke University). I ceppi clinici, B18 e B52, sono stati doni gentili dal Dr. Greg Bisson (Università della Pennsylvania). | ||
| Brodo di destrosio peptone di lievito (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Questo è prodotto in laboratorio utilizzando la ricetta standard (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/alto glucosio con L-glutammina, senza piruvato di sodio | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| piastre a 6 pozzetti | Falcon | CL5335-5EA | |
| Incubatrice a scuotimento | Thermo Scientific | Incubatore a CO2 MaxQ6000 | |
| Fisher Scientific | Centrifuga | ||
| Isotemp Thermo Scientific | Legend XTR | ||
| Staining | |||
| Microcentrifuga | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| Inchiostro di china | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor bianco | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 anticorpo di topo anti-GXM coniugato ad Alexafluor 488 | Un gentile dono dal Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS con l'1% di albumina sierica bovina (BSA) | PBS è la stessa ricetta sopra elencata (riga 4) con l'aggiunta dell'1% di BSA e la sterilizzazione con filtro. | ||
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Vetrini per microscopio Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Vetrini coprioggetti | Corning | 2855-18 | # 1,5 spessore |
| Smalto trasparente o altro sigillante | |||
| Acquisizione dell'immagine Olio da | |||
| immersione | Cargille | 16484 | |
| Microscopio ottico con obiettivo ad immersione in olio | Zeiss | Zeiss Axio A1 con obiettivo Plan - NEOFLUAR 100x ad immersione in olio NA 1.30 | |
| Fotocamera per microscopio ottico Fotocamera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD | |
| Microscopio confocale con obiettivo ad immersione in olio | Zeiss | LSM 700 confocale a scansione laser dotato di un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 ad immersione in olio DIC M27.& nbsp; | |
| Zen | 2009 | ||
| Fotocamera per microscopio confocale | Nikon | Nikon Ti-Eclipse con illuminatore a epifluorescenza Intensilight (Nikon), fotocamera per microscopio CoolSNAP MYO (fotometria), obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60x NA 1.40 (Nikon) e cambio di ingrandimento 1.5x. | |
| Software per l'imaging a campo largo | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Software per l'editing di immagini | Photoshop (Adobe) | ||
| Software per microscopi per la misurazione manuale | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Software per l'analisi delle immagini per la misurazione automatizzata | Aivia (DRVision Tecnologie) | ||
| Foglio di calcolo Excel | (Microsoft) |
Riferimenti
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev....
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Ristampe e permessi
