Method Article

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l'efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capsula del polisaccaride di Cryptococcus neoformans è il fattore di virulenza primario e uno dei più comunemente studiato gli aspetti di questo lievito patogeno. Capsula dimensione può variare ampiamente tra i ceppi, ha la capacità di crescere rapidamente quando presentare a condizioni stressanti o basse nutriente ed è stata correlata positivamente con virulenza del ceppo. Per questi motivi, la dimensione della capsula è di grande interesse per i ricercatori di c. neoformans . La crescita della capsula c. neoformans è indotta durante le prove fenotipiche per comprendere gli effetti dei diversi trattamenti sulle differenze tra ceppi di lievito o dimensione. Qui descriviamo uno dei metodi standard di capsula induzione e confrontare due metodi accettati di colorazione e diametro capsula di misura: (i) inchiostro di India, un mordente negativo, usato in congiunzione con microscopia chiara convenzionale e (ii) Co-colorazione con coloranti fluorescenti della parete cellulare e capsula seguita da microscopia confocal. Infine, vi mostriamo come misura di diametro capsula da campioni di inchiostro di India-macchiato può essere automatizzato utilizzando analisi computazionale delle immagini.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l'agente causativo di dermatosi da criptococco1,2, 3. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di tubercolosi ogni anno e più ogni mese rispetto a qualsiasi epidemia di Ebola su record1. La via più comune di esposizione si verifica da inalazione di spore essiccate che sono molto comuni in ambiente7. Entrando i polmoni, ci sono diversi fattori di virulenza che contribuiscono al successo di c. neoformans in individui infettati. Capsula del polisaccaride è considerata fattore di virulenza primaria di microbo, come acapsular ceppi non sono virulenti8.

Capsula da criptococco si compone di tre componenti principali: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteine (MPs)9. Mentre i parlamentari sono una componente relativamente minore parete cellulare-collegata della capsula, sono immunogenici e può favorire una risposta pro-infiammatoria principalmente9,10. Al contrario, GXM e GalXM compongono la massa della capsula (> 90% in peso) e hanno effetti immunosopressivi11. Oltre ai suoi effetti immunomodulatori, l'ingrandimento veloce della capsula in vivo crea una barriera meccanica ad ingestione di host cellule fagocitiche (cioè, neutrofili e macrofagi)12. La capsula di c. neoformans e sua sintesi sono complessi, ma nel complesso, aumentato diametro capsula è correlato con una maggiore virulenza6,13,14. Detto questo, è importante per i ricercatori di c. neoformans essere in grado di quantificare rapidamente e con precisione misurazioni capsule.

Sia la cella di c. neoformans e sua capsula polisaccaridica sono strutture dinamiche e mostrano cambiamenti nel tempo di15. La capsula può cambiare in Assemblea in risposta ai cambiamenti nell'host ambiente16,17,18, dimensioni e densità. Basso contenuto di ferro o livelli di nutrienti, l'esposizione del siero, il pH fisiologico umano e aumentata di CO2 sono noti per avviare la crescita capsula16,18,19,20. Ulteriormente, i ricercatori hanno dimostrato cambiamenti strutturali con conseguente differenze significative in immunoreactivity durante un'infezione, un vantaggio di c. neoformans rispetto suo ospite di prestito21,22. Questo è noto perché l'architettura della capsula c. neoformans è stato analizzato in una varietà di modi. La microscopia elettronica, ad esempio, ha rivelato che la capsula ha una matrice eterogenea con uno strato interno di elettrone-densi sotto un strato esterno, più permeabile23. Dispersione della luce e l'uso di pinzette ottiche hanno permesso che i ricercatori più ulteriormente per delucidare sue strutture macromolecolari24. Analizzando i risultati da entrambe misure di dispersione della luce statica e dinamica, sappiamo che la capsula del polisaccaride ha una complessa struttura ramificazione23. Pinzette ottiche sono state utilizzate per testare la rigidità della struttura, nonché a valutare la reattività dell'anticorpo24. Tuttavia, di gran lunga il più delle volte autonomo analisi della capsula c. neoformans è la misurazione delle sue dimensioni.

Per quantificare la capsula dimensione, i ricercatori usano quello che dovrebbe essere una semplice misurazione: il diametro lineare della capsula. Microscopi digitali vengono utilizzati per catturare immagini di celle multiple di c. neoformans (generalmente centinaia) macchiati con l'inchiostro di India o tinture fluorescenti. La dimensione di ogni corpo cellulare e capsula circostante è misurata. I dati vengono compilati e il diametro medio della capsula è calcolato sottraendo il diametro del corpo cellulare dal diametro a cellula intera (corpo cellulare + capsule). Fino a questo punto, queste misurazioni sono state fatte manualmente. Mentre in genere preciso, questo metodo ha svantaggi per i ricercatori. Grandi insiemi di dati può richiedere giorni o anche settimane per analizzare a mano. E poiché queste misurazioni vengono effettuate manualmente, soggettività e l'errore umano può influenzare il risultato.

Analisi automatizzata delle immagini computazionale sono diventato uno strumento indispensabile per i ricercatori in molti settori della biologia cellulare molecolare, consentendo l'analisi più veloce e più affidabile del biologico immagini 25,26,27. Tecniche di analisi di immagine precisa sono necessari per estrarre informazioni quantitative dalle quali spesso sono insiemi di dati complessi e immensi. Tuttavia, alcune misure, soprattutto la misura della capsula di c. neoformans , sono stati difficili da automatizzare. Identificare con precisione l'interfaccia tra la parete delle cellule e la capsula, che generalmente appare come un anello scuro quando immaginata da microscopia di contrasto di fase, può essere fastidioso per risolvere utilizzando una semplice soglia. Ulteriormente, le cellule di c. neoformans nella cultura tendono ad ammassarsi e segmentazione accurata delle cellule è necessaria per misurazioni accurate.

Lo scopo di questo progetto era di (i) illustrare uno dei protocolli standard per induzione capsula in c. neoformans, (ii) confronto e contrasto dell'inchiostro di India e fluorescenza colorazione come si riferiscono a capsula misure di diametro, (iii) sviluppare semplice, metodi computazionali per misurare diametro capsula utilizzando immagini di inchiostro macchiato celle utilizzando un software di analisi di immagine e, (iv) valutano i vantaggi ei limiti di misurazione diametro capsula manualmente e utilizzando il software di automazione. Troviamo che i due metodi di colorazione fluorescenti etichettatura della parete cellulare e capsula, mentre richiede più tempo, fornito i risultati più coerenti tra esperimenti. Tuttavia, entrambi i metodi ci ha permesso di distinguere correttamente tra laboratorio e clinica c. neoformans ceppi che esibiscono diverse capsule dimensioni. Inoltre, siamo stati in grado di automatizzare la misura del diametro capsula da India inchiostro macchiato immagini e scoperto che questo era una valida alternativa alla misurazione manuale della capsula.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: C. neoformans è un agente patogeno di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) e i ricercatori che lavorano con esso devono prendere le dovute precauzioni. Procedure dettagliate su come sicuro lavoro con agenti patogeni BSL-2 può essere scoperto sul Center for Disease Control (CDC) sito Web, ma è importante notare che tutte le persone che vengono a contatto con il c. neoformans devono essere adeguatamente addestrate nella gestione gli agenti patogeni e dovrebbe sempre indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE), generalmente in lattice o nitrile guanti. Ulteriormente, rotori su centrifughe devono essere sigillati per evitare la nebulizzazione dei campioni e tutte le cadute ripulite immediatamente utilizzando una soluzione di candeggina al 10%28.

1. capsula induzione

Nota: Se non specificato diversamente, tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti a temperatura ambiente.

  1. Cultura di c. neoformans in brodo di lievito peptone destrosio (YPD) (pH 6,5 + /-0.2) e incubare a 37 ° C con agitazione fino a quando sono in fase di log (circa 18-36 h).
  2. Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a 21 ° C e lavare tre volte con tamponato fosfato salino (PBS).
  3. Utilizzare un emocitometro (o un contatore di cellule automatizzato) per contare le celle e risospendere a 2 x 105 cellule/2 mL in media essenziali minimi di Dulbecco (DMEM).
  4. Per indurre la capsula, incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 18 h.
    Nota: La combinazione di assenza di sostanze nutritive nei media e la presenza di CO2 stimola la crescita capsula c. neoformans .
  5. Post-incubazione, raccogliere le cellule centrifugazione (come sopra) e rimuovendo tutti, ma 5-10 µ l di supernatante. Allo stesso tempo, raccogliere un campione di ONU-indotta delle cellule corrispondenti per ogni sforzo deve essere misurata. Utilizzare questi come controlli negativi.
    Nota: Il pellet cellulare sarà molto piccolo e può essere difficile da vedere. Prestare attenzione quando aspirare il surnatante.
  6. Macchiare con l'inchiostro di India (sezione 2.1) o coloranti fluorescenti (sezione 2.2).

2. colorazione

  1. Colorazione con solo inchiostro di India
    1. Per macchiare il lievito con l'inchiostro di India, risospendere il pellet nel surnatante restante e aggiungere 4μL (circa metà) della sospensione cellulare e 4μL di inchiostro di China su un vetrino per microscopio. Delicatamente mescolare ed evitare la formazione di schiuma.
    2. Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
  2. Colorazione con solo le tinture fluorescenti
    1. Per macchiare il lievito con un colorante fluorescente, risospendere il pellet cellulare in 50 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).
    2. Incubare la cultura con un volume uguale di Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e capsula mAb 18B7 (Vedi Tabella materiali) coniugato con AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) per 30 min a 37 ° C.
    3. Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a post-incubazione 21 ° C e aspirare il surnatante.
    4. Risospendere le cellule in 10 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).
    5. Pipettare 8 µ l di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio.
    6. Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
  3. Colorazione con inchiostro di China e tinture fluorescenti
    1. Per confrontare più direttamente l'efficacia di inchiostro di India di colorazione a quella di coloranti fluorescenti, co-macchia stessa popolazione cellulare con entrambi i tipi di macchia. A tale scopo, prima di incubare le cellule con una capsula fluorescente e la macchia di parete cellulare, come da procedura 2.2.1 - 2.2.3.
    2. Successivamente, Pipettare volumi uguali (4 µ l) della sospensione cellulare fluorescente macchiato e inchiostro di China su una lastra di vetro. Mescolare delicatamente.
    3. Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.

3. immagine acquisizione/microscopia

  1. Cellule di imaging colorato con inchiostro.
    1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a luce standard (ingrandimento 100 X).
    2. Immagine un minimo di 50 cellule per condizione.
      Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo, come questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato). Per questi esperimenti, le immagini sono state acquisite a una profondità di 16 bit con tempi di esposizione ottimizzati per massimizzare il contrasto dell'immagine riducendo al minimo la sfocatura causata da piccoli movimenti delle cellule.
  2. Cellule di imaging tinto con coloranti fluorescenti
    1. Per realizzare l'immagine delle cellule mediante microscopia a fluorescenza, aprire il software di imaging di microscopio e selezionare l'appropriato eccitazione e emissione lunghezze d'onda per i fluorofori utilizzati (CFW e AF488 sono eccitati utilizzando il 405nm e 488 nm luci, rispettivamente). Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
    2. Immagine un minimo di 50 cellule per condizione.
      Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo in quanto questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato).
    3. Acquisire una serie di immagini dello stack z delle cellule per garantire che si ottiene il massimo diametro capsula per ogni cella all'interno di un determinato campo.
      1. Del software di controllo del microscopio, fare clic sulla barra "z-stack" per aprire il pannello di controllo "z-stack", quindi selezionare l'opzione "Primo/ultimo" nell'angolo superiore sinistro del pannello.
      2. Utilizzare il controllo di fine-fuoco il microscopio per mettere a fuoco a un livello che è di sotto del punto più largo di una cellula di lievito singolo e le capsule per tutti entro il campo di vista corrente e fare clic su "Primo Set".
      3. Utilizzare il controllo di fine-fuoco per mettere a fuoco sopra il punto più largo del corpo cellulare della cellula stessa e della capsula per tutte le celle all'interno del campo di vista corrente e fare clic su "Imposta l'ultimo".
      4. Quindi, fai clic su "Avviare esperimento" nella scheda "Acquisizione" per acquisire lo z-stack per la posizione corrente. Ripetere il processo in più posizioni fino a quando sono state acquisite immagini dello stack z di un minimo di 50 cellule.
        Nota: Per questi esperimenti, il foro stenopeico confocale è stato impostato su 1.0 AU e una sovrapposizione z-serie di 10-20 fette che coprono 0,7 µM ogni sono stati acquisiti presso le posizioni selezionate. AU = unità arioso.
    4. Successivamente, è possibile convertire ogni serie z-stack in proiezioni di massima intensità (MIP) utilizzando software di analisi di immagine appropriata.
      Nota: La massima intensità a ogni piano dell' immagine impilata29del progetto MIPs. Creazione di MIPs permette di produrre una rappresentazione 2-D di immagini che corrispondono alla massima della cella e capsula diametro all'interno dello stack 3D acquisito.
  3. Cellule di imaging macchiato con l'inchiostro di India e tinture fluorescenti
    1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale o widefield (ingrandimento 40x) (63 X o 100 X ingrandimento). Per le cellule colorate con inchiostro di China e tinture fluorescenti, catturare immagini utilizzando un microscopio di widefield equipaggiato con un palco comandato da calcolatore e obiettivo a immersione in olio.
      Nota: Il microscopio in uso dovrebbe essere controllato utilizzando un software di imaging CFW. la fluorescenza che è eccitato attraverso un filtro di eccitazione di 340-380 nm e la luce emessa deve essere rilevata attraverso un filtro di barriera di 435-485 nm riflettuto da uno specchio dicroico 400 nm. AF488 fluorescenza possa essere eccitato attraverso un filtro di eccitazione 465-495 nm, e la luce emessa può essere rilevato attraverso un filtro di barriera 515-555 nm riflettuto da uno specchio dicroico 505 nm.
    2. Immagine un minimo di 50 cellule di ogni metodo di macchiatura per patologia.

4. misura manuale della capsula

  1. Per le cellule colorate con inchiostro di China o macchie fluorescenti, utilizzare un software di misurazione di cella al diametro manualmente di capsula e cella di misura (Vedi Tabella materiali). Per fare questo, andare su "File" > "Apri immagine" > "Misura" e utilizzare il cursore per disegnare una linea retta attraverso il punto più largo della cella intera (diametro totale).
  2. Successivamente, fare nuovamente clic su "Misura" e disegnare una linea retta attraverso il corpo cellulare (diametro corpo cellulare).
    Nota: Le misure sono salvati automaticamente sulle celle.
  3. Ripetere questo processo per tutte le celle (minimo 50/gruppo).
  4. Per salvare le immagini una volta che sono misurati, fare clic su "File" > "Salva come" e il nome le immagini in modo appropriato.
  5. Selezionare i file appena misurati ed esportare dati in un software di foglio di calcolo.
  6. Calcolare il diametro medio capsula utilizzando l'equazione: ([diametro totale] - [Diametro corpo cellulare]).

5. automatici di misurazione della capsula

Nota: Per il successo di misura automatici, utilizzare immagini a 16 bit con un elevato livello di contrasto e che sono correttamente a fuoco insieme a un software di analisi di immagine appropriata (Vedi Tabella materiali). Quando imaging c. neoformans per capsula misurazione, è importante concentrarsi sull'anello scuro al confine tra la parete delle cellule e la capsula. Questo permette al software di delineare correttamente la cella e la capsula.

  1. Inverti e creare una copia di tutti i India inchiostro macchiato immagini cellulare utilizzando un appropriato software di fotoritocco (Vedi Tabella materiali). Per effettuare questa operazione, fare clic su "File" > "Apri" per aprire India inchiostro macchiato immagini e quindi su "controllo" + "I" per invertire l'immagine. Fare clic su "File" > "Salva con nome" per salvare l'immagine invertita.
  2. Per importare l'originale e invertito immagini nel software, fare clic su "File" > "Importa sequenza" > "Carica immagine" > "Definisci sequenza (manualmente)" > "Dimensioni (canale)" > "Importare" > "Applica".
    Nota: I corpi delle cellule di c. neoformans e capsule possono essere identificati e mascherato utilizzando algoritmi specifici - indicati come 'ricette' - inclusi nel software.
  3. Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' l'immagine invertita per rilevare e mascherare il corpo della cella, quindi fare clic su "applica". Nell'immagine invertita, l'anello scuro che definiscono i margini della cella c. neoformans diventa più luminoso della capsula circostante.
  4. Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' sull'immagine invertita per segmentare i corpi delle cellule di c. neoformans dalle loro capsule, quindi fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Corpo cellulare" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".
    Nota: La ricetta è costituito da più passaggi di elaborazione: sfondo rimozione, rilevamento di oggetti, separazione di oggetto e il filtro di sottoinsieme.
  5. Successivamente, utilizzare la ricetta 'Proliferazione' sull'immagine originale per rilevare e mascherare la capsula e fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Capsula" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".
  6. Utilizzando la ricetta, 'Capsula partizione', creare una nuova maschera sull'immagine originale per partizionare capsule adiacente uno da altro. Per effettuare questa operazione, fare clic su "Capsula partizione" dal menu a discesa di ricetta. Nella finestra di partizione capsula, scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Capsula" (5,5) per capsula regione. Scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Corpo cellulare" per le celle Crypto (5,4). Scegliete "Originale" per il canale di ingresso e "Crea maschera per capsula partizionate. Fare clic su "applica
    Nota: La ricetta crea delle cellule e diametro capsula, definita come la media degli assi più lungo e più breve attraversando il centro della cellula e capsula e misure di zona da maschere di rilevamento. Trovare l'uscita che si trova sotto la scheda di foglio di calcolo in questo software. Ripetere questo processo per tutte le immagini (minimo 50 cellule/gruppo). Parametri di ricetta potrebbero essere sintonizzati per ottimizzare la rilevazione di singole immagini o ottimizzati per il rilevamento di batch di immagini multiple. Ulteriori misurazioni è calcolabile con la ricetta per la completa caratterizzazione della cella e morfologia della capsula.
  7. Esportare dati in un software di foglio di calcolo di scelta per ulteriori analisi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per illustrare la capsula induzione, macchiatura delle cellule, imaging e tecniche di misurazione, abbiamo utilizzato tre ceppi di c. neoformans: ceppo il laboratorio comune, ben caratterizzato, H99S30e due ceppi clinicamente isolati di precedentemente diametro capsula sconosciuto, B18 e B5231.

Il flusso di lavoro di induzione capsula, colorazione e acquisizione di immagin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per decenni, la capsula è stata degli obiettivi principali della ricerca per micologi e clinici interessati a c. neoformans e dermatosi da criptococco dovuto il relativo ruolo come fattore di virulenza principali per l'agente patogeno. Usando la microscopia per misurare differenze di dimensioni capsula tra ceppi e in crescita differente condizioni possono fornire informazioni importanti per l'agente patogeno e le sue risposte ai vari stimoli (cioè, diverse condizioni ambientali, possibili trattamenti fa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'autore, Hoyin Lai, è il product manager di DRVision che pubblica il software di analisi di immagine automatizzato, Aivia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il programma di dottorato di scienze biologiche molecolari (MOBI) e il dipartimento di biologia a Middle Tennessee State University (MTSU) per fornire i finanziamenti per questo studio. Il progetto è stato inoltre finanziato in parte da una sovvenzione di progetti speciali per D.E.N. dalla Fondazione MTSU.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Induzione della capsula
C. cellule neoformansIl ceppo di laboratorio clinico, H99S, è stato un gentile dono del Dr. John Perfect (Duke University).  I ceppi clinici, B18 e B52, sono stati doni gentili dal Dr. Greg Bisson (Università della Pennsylvania).
Brodo di destrosio peptone di lievito (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Questo è prodotto in laboratorio utilizzando la ricetta standard (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/alto glucosio con L-glutammina, senza piruvato di sodioGE Life SciencesSH30022.01
piastre a 6 pozzettiFalconCL5335-5EA
Incubatrice a scuotimentoThermo Scientific Incubatore a CO2 MaxQ6000
Fisher ScientificCentrifuga
Isotemp Thermo ScientificLegend XTR
Staining
MicrocentrifugaThermo ScientificLegend Micro 21R
Inchiostro di chinaFisher Scientific14-910-56
Calcofluor biancoSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 anticorpo di topo anti-GXM coniugato ad Alexafluor 488Un gentile dono dal Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)
PBS con l'1% di albumina sierica bovina (BSA)PBS è la stessa ricetta sopra elencata (riga 4) con l'aggiunta dell'1% di BSA e la sterilizzazione con filtro.
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA9418
Vetrini per microscopio SuperfrostFisher Scientific12-550-143
Vetrini coprioggettiCorning2855-18# 1,5 spessore
Smalto trasparente o altro sigillante
Acquisizione dell'immagine  Olio da
immersioneCargille 16484
Microscopio ottico con obiettivo ad immersione in olioZeissZeiss Axio A1 con obiettivo Plan - NEOFLUAR 100x ad immersione in olio NA 1.30
Fotocamera per microscopio ottico FotocameraZeissZeiss Axiocam ErCD
Microscopio confocale con obiettivo ad immersione in olioZeissLSM 700 confocale a scansione laser dotato di un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 ad immersione in olio DIC M27.& nbsp;
Zen2009
Fotocamera per microscopio confocaleNikonNikon Ti-Eclipse con illuminatore a epifluorescenza Intensilight (Nikon), fotocamera per microscopio CoolSNAP MYO (fotometria), obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60x NA 1.40 (Nikon) e cambio di ingrandimento 1.5x.
Software per l'imaging a campo largoNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Software per l'editing di immaginiPhotoshop (Adobe)
Software per microscopi per la misurazione manualeAxiovision (Carl Zeiss)
Software per l'analisi delle immagini per la misurazione automatizzataAivia (DRVision Tecnologie)
Foglio di calcolo Excel(Microsoft)
non tossico

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640(2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261(2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

Related Articles