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Articolo metodologico

Determinazione del tasso di sedimentazione di argilla/cianobatterica fiocco

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DOI:

10.3791/57176

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11 giugno 2018

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In questo articolo

Sommario

L'interazione e la sedimentazione di argilla e cellule batteriche all'interno del Regno marino, osservate in ambienti naturali, può essere studiati meglio in un ambiente di laboratorio controllato. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato, che delinea un nuovo metodo per misurare il tasso di sedimentazione di argilla e cianobatterica fiocco.

Abstract

I meccanismi su cui si fonda la deposizione di grana fine, sedimenti organici ricchi sono ancora largamente dibattuti. In particolare, l'impatto dell'interazione di particelle di argilla con cellule cianobatterica reattive, planctoniche al record sedimentario è meno studiato. Questa interazione è un fattore potenzialmente importante di modelli deposizionali shale. All'interno di un ambiente di laboratorio, i tassi di flocculazione e sedimentazione di questi materiali possono essere esaminati e misurati in un ambiente controllato. Qui, dettagliamo un protocollo per la misurazione del tasso di sedimentazione di miscele cianobatterica/argilla. Questa metodologia è dimostrata attraverso la descrizione di due esperimenti di campione: il primo utilizza caolino (una forma disidratata di caolinite) e Prochlorococcus marinus PCC 7002 (un coccoid cianobatteri marini) e il secondo utilizza il caolino e Synechocystis SP. PCC 6803 (un coccoid cianobatteri d'acqua dolce). Cianobatterica culture sono mescolate con diverse quantità di argilla all'interno di un apparato di serbatoio appositamente ottimizzato per consentire di continuo, in tempo reale video e fotografica della registrazione. Le procedure di campionamento sono dettagliate così come un protocollo di post-raccolta per la misura precisa della clorofilla una da cui può essere determinata la concentrazione di cellule cianobatterica residue in sospensione. In replica sperimentale, viene costruito un profilo che consente di visualizzare il tasso di sedimentazione.

Introduzione

Usare le condizioni ambientali presenti e processi per dedurre passato meccanismi deposizionali è stato a lungo un fondamento della sedimentologia. Mentre moderni deposizionali analoghi, come il Mar Nero, sono stati utilizzati per comprendere la deposizione di depositi organici ricchi, a grana fine, esperimenti di laboratorio hanno il potenziale per fare ulteriori luce sull'origine dei depositi di scisto. Un'area di indagine nella genesi di scisti neri è il tasso di deposizione e il meccanismo di formazione originale. Tradizionalmente, è stato ipotizzato che scisti neri formata in ambienti dove il tasso di sedimentazione, produttività primaria e tassi di respirazione di materia organica promuovono la conservazione della sostanza organica nel sedimento1,2 ,3. Tuttavia, il ruolo di cianobatterica e flocculazione argilla ha in gran parte rimasto unconsidered. Questo meccanismo di flocculazione consentirebbe per rapida deposizione di sedimenti organici ricchi, a grana fine per accadere e non necessitano di ossigeno. Considerando questa premessa, questo protocollo ha due obiettivi: 1) misurare il tasso di sedimentazione di fiocco cianobatterica/argilla e 2) visualizzare il processo di sedimentazione in tempo reale. Questa metodologia, oltre alle analisi geochimiche, è stata utilizzata per dimostrare che flocculazione cianobatterica/argilla può infatti essere un meccanismo importante per shale formazione1. Sebbene originariamente concepita per la modellazione a deposizione di scisto, questo metodo è applicabile ad altre discipline come la biologia e la bonifica ambientale dove l'influenza dell'input di argilla sul metabolismo batterico e la popolazione devono essere misurate.

Numerosi studi sono stati condotti per osservare la flocculazione di cianobatteri e argilla, per mitigare le fioriture algali nocivo2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. Tuttavia, durante la misurazione della concentrazione cellulare nel corso del tempo, questi studi non siano applicate flocculazione cianobatteri/argilla per modellare la deposizione del record roccia. Come tali, questi studi mancano un componente visiva, che può essere critica durante la modellazione passato processi sedimentologici. Inoltre, la maggior parte degli studi utilizza conta cellulare (ad es., Pan et al. 11), che può essere laborioso. Il nostro metodo, con gli avanzamenti recenti nella misura cianobatterica flocculazione, determina i cambiamenti nella concentrazione delle cellule cianobatterica misurando clorofilla un (Chl un) a intervalli di tempo discreti. L'associazione Chl una misurazione con dati visivi è un nuovo approccio, che può essere utilizzato per dedurre le condizioni deposizionali. Le immagini generate è utilizzabile anche per calcolare il tasso di sedimentazione dopo il lavoro da Du et al. 13. la combinazione di dati visivi e numerici rafforza l'affidabilità dei risultati. Inoltre, abbiamo delineare protocolli aggiuntivi, consentendo la sedimentazione di necromassa e argilla devono anche essere rispettate. Questo è importante quando si considera passato sedimentologici ambienti, dove vivono e necromassa co-potrebbe essersi verificato. Differenze nel comportamento di biomassa morta durante la flocculazione (ad esempio, diminuzione della frequenza di flocculazione) potenzialmente avrebbe implicazioni sedimentologiche.

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Protocollo

1. preparazione cianobatterica culture

  1. Preparazione di colture di inoculazione su supporti solidi
    1. Ottenere cellule cianobatterica axeniche dalla American Type Culture Collection o Pasteur Culture Collection. Ad esempio, il Prochlorococcus unicellulari, marine PCC 7002 è stata ottenuta dall'insieme cultura Pasteur, si farà riferimento d'ora in poi come Acinetobacter.
    2. Mantenere le cellule Synechococcus su piastre contenenti terreni solidi (A + liquido media14 e 1,5% agar15). Questi di cui qui di seguito come culture di inoculazione.
    3. Incubare le piastre a 32 ± 2 ° C con luce continua fornito a 30 – 50 µmol fotoni m-2 s-1,15,18.
    4. Ripetere i passaggi da 1.1 – 1.3 e sostituire un + supporto con BG-1116 nel passaggio 1.1.2 per specie d'acqua dolce cianobatterica, come Synechocystis SP. PCC 680316,17, denominata di seguito Synechocystis. Vedere tabelle 1 – 4 per la composizione dei media A + e BG-11.
  2. Preparazione di colture liquide: ogni esperimento serbatoio richiede una cultura cianobatterica 400 mL.
    1. Raccogliere un 250 mL e due L 1 flacone erlenmeyer resistente al calore.
    2. Sciacquare ogni boccetta con una soluzione di acido cloridrico (HCl) di 4 M (30 mL di soluzione di HCl per ciascuna beuta), poi con acqua distillata.
      Attenzione: l'acido cloridrico è corrosivo e tossico. Garantire che un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti resistenti agli acidi sono indossati mentre si utilizza la soluzione di HCl 4 M. Eseguire questo passaggio in un lavandino di laboratorio e seguire le normative locali per lo smaltimento della soluzione di HCl 4 M
    3. Riempire il pallone da 250 mL con 50 mL di liquido media (A + o BG-11). Riempire un pallone da 1 L con 400 mL di liquidi (A + o BG-11) e l'altro L 1 pallone con 600 mL di media (A + o BG-11).
    4. Sigillare ogni recipiente con un tappo di gomma piuma permeabile del gas e coprire il collo di boccetta e tappo di gomma piuma con carta stagnola.
    5. Etichetta e autoclave le beute a 121 ° C e 100 kPa per 25 min. consentono le beute raffreddare a temperatura ambiente.
    6. Preparare una cappa a flusso laminare di sterilizzazione della superficie con alcol al 70%.
    7. Raccogliere un ciclo di inoculazione di filo, un bruciatore di Bunsen, il pallone di mezzi liquidi raffreddato da 50 mL (dal punto 1.2.5) e la cultura di inoculazione (dal punto 1.1). Posizionare questi elementi nella cappa flusso sterilizzato.
    8. Sterilizzare l'ansa per inoculazione filo brevemente utilizzando la fiamma di un becco Bunsen e lasciare che si raffreddi.
    9. Trascina il loop di fresco lungo la superficie della cultura inoculazione per raccogliere le cellule cianobatterica.
    10. Rimuovere il tappo di gomma piuma e stagnola dal pallone da 250 mL (senza toccare il tappo di gomma piuma) e sterilizzare il cerchio del matraccio Erlenmeyer passandola brevemente attraverso la fiamma.
    11. Inclinare il pallone così i media è vicino al collo del pallone e inserire l'ansa per inoculazione ricoperto di cellule nel pallone. Una volta che il ciclo è sommerso in media, mescolare l'ansa per inoculazione per rimuovere le cellule.
    12. Rimuovere l'ansa per inoculazione e risterilizzare il labbro del pallone utilizzando la fiamma del bruciatore di Bunsen.
    13. Sostituire il tappo di schiuma e stagnola sulla beuta (senza toccare il tappo di gomma piuma).
    14. Sterilizzare l'ansa per inoculazione brevemente all'interno la fiamma del bruciatore di Bunsen.
    15. Preparare una camera di crescita (di cui la camera di crescita) dove la temperatura è mantenuta a 30 ° C15,18 e intensità della luce è di 30 – 50 µmol fotoni m-2 s-1,15,18 . Umidità non è attivamente controllato.
    16. Consentire la cultura inoculato 50ml Incubare agitando a 150 rpm nella camera di crescita, con una temperatura mantenuta di 30 ° C. Tenere la bocca del pallone coperto durante l'agitazione per controllare le perdite per evaporazione e prevenire la contaminazione.
    17. Consentire la costruiscono cianobatterica a crescere per 96 h. Una cultura di successo dovrebbe apparire verde brillante e avere una densità ottica (OD) a 750 nm di 0,4 – 0,6.
    18. Una volta che la cultura è cresciuta sufficientemente, posizionare la cultura di 50 mL e il pallone da 1 L contenente 400 mL di liquido media (dal punto 1.2.5) nella cappa a flusso laminare. Garantire che la cappa a flusso è sterilizzato seguente punto 1.2.6.
    19. Ripetere il passaggio 1.2.10 per entrambi boccette all'interno di una cappa a flusso laminare.
    20. Versare la cultura 50ml in 400 mL di media nella beuta di 1 L e risterilizzare il labbro del pallone da 1 L con la fiamma del bruciatore di Bunsen.
    21. Al posto della schiuma e lamina ghiera, allegare un apparato di bubbling sterile costituito da un tappo di gomma piuma, pipetta, tubi in plastica, filtro in linea e sventare copertura fino alla foce del pallone.
    22. Agitare il matraccio 1 L a 150 giri/min a 30 ° C con l'apparato della vasca di gorgogliamento attaccato ad una pompa di aria, che circola una miscela di aria umidificata attraverso la soluzione15,18 a 300 mL/min.
    23. Consentire la capacità di crescere all'interno della camera di crescita a 30 ° C per 120 – 168 h. Una cultura di successo dovrebbe apparire verde brillante e avere un OD750 nm di 0,4 – 0,6.
    24. Ripetere il passaggio 1.2 per produrre una cultura del controllo, che non sarà mescolata con l'argilla.
    25. Esperimenti utilizzando biomassa morta richiedono un ulteriore passaggio. Autoclave L 1 pallone cultura per 60 min a 121 ° C e lasciar raffreddare a temperatura ambiente.

2. sperimentale istituito

  1. Posizionare una vasca rettangolare acrilica (lunghezza di 20 cm), larghezza di 5,1 cm e altezza di 30 cm davanti a una banca di luci fluorescenti (nove lampade T8, almeno 2.600 lumen; Figura 1) 19.
  2. Posizionare un foglio di plastica trasparente, bianco tra la banca di luci e il serbatoio per diffondere la luce, che brilla attraverso il serbatoio. Questo set-up è stato adattato da Sutherland et al. 19
  3. Mark l'acrilico serbatoio ad un'altezza di 10 cm, misurata verticalmente dalla base. Tutte le misurazioni dovrebbero essere fatte a questa altezza nella colonna d'acqua per garantire la coerenza di ogni campionamento.
  4. Inserire una fotocamera su un treppiede, 1 m davanti al serbatoio per registrare ogni esperimento. Una videocamera è raccomandata in quanto può essere estratta dal file video, e utilizzando il software di modellazione matematica, file video possono essere utilizzati per modellare sedimentazione dynamics19.
  5. Posizionare un panno nero sopra la banca leggera, serbatoio e fotocamera per schermare l'esperimento da fonti di luce esterne (Figura 1).

3. flocculazione protocollo sperimentale

  1. Raccogliere la cultura 400ml (punto 1.2), un grande cilindro graduato e 600 mL di terreno di crescita supplementare in un pallone da 1 L (punto 1.2.5).
  2. Diluire la cultura 400 mL (concentrazione iniziale delle cellule di 4 – 6 mg/mL) con supporto di crescita ulteriore (A + o BG-11) a volume finale di 1L utilizzando il cilindro graduato. Aggiungere questa soluzione nel serbatoio acrilico.
  3. Preparare 2 mL provette microfuge etichettatura e ponendoli in una posizione conveniente vicino al carro armato acrilico. Misura 50 g di argilla per l'esperimento.
  4. Iniziare la registrazione dei video. Nel caso di esperimenti multipli, un cartello con l'identificatore di esperimento possa essere temporaneamente tenuto prima della macchina fotografica.
  5. Utilizzando una pipetta, prelevare un campione di 1 mL e metterlo in una provetta con etichetta microfuge. Utilizzare questo esempio per determinare il conteggio iniziale delle cellule cianobatterica misurando la OD750 nm valori. Prendere tutti i campioni in triplice copia per garantire risultati accurati.
  6. Versare rapidamente l'argilla (50 g) nel serbatoio con vigorosa agitazione utilizzando un bastone di agitazione per 10 – 15 s.
  7. Avviare il timer e prelevare il campione iniziale 1 mL per Chl una determinazione utilizzando una pipetta P1000 (campione tempo0).
  8. Prelevare ulteriori campioni a intervalli di tempo appropriati (ad es., 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min e 240 min).
  9. Una volta che l'esperimento è finito, salvare il file video, spegnere la videocamera e trattare tutti i campioni per Chl una determinazione (passaggio 4).
  10. Sterilizzare in autoclave la soluzione rimanente argilla/cianobatterica. A seconda della specie cianobatterica, regolamenti locali e criteri di laboratorio, smaltire la soluzione utilizzando metodi appropriati. Pulire il serbatoio con acqua e sapone, sciacquare con acqua distillata e asciugare a aria.
  11. Preparare un esperimento di controllo con nessun argilla aggiunto. Prelevare campioni allo stesso tempo punti. Questi dati possono essere confrontati agli altri dati sperimentali per confermare che tassi di sedimentazione sono aumentati a causa della flocculazione con argilla, non il risultato di decantazione naturale.
  12. Se la biomassa morta viene utilizzato durante l'esperimento, utilizzare la stessa procedura sperimentale. Tuttavia, la procedura di smaltimento della soluzione non richiede trattamento in autoclave.

4. l'elaborazione e la valutazione del campione

  1. Determinare Chl una concentrazione in ogni campione di cella utilizzando una procedura per l'ultima volta da Owttrim16. Una volta raccolti, appallottolare le celle da ogni campione per 3 min a 13.000 x g usando una microcentrifuga a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il terreno in eccesso utilizzando una pipetta P1000 e aggiungere 1 mL di metanolo al 100% (20 ° C). Vortexare il campione a tutta velocità per 1 minuto risospendere il pellet cellulare.
    Attenzione: Il metanolo è tossico ed infiammabile. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e tenere metanolo lontano da fonti di ignizione.
  3. Incubare i campioni a-20 ° C per 24 h facilitare l'estrazione di Chl un.
  4. Dopo l'incubazione, i detriti cellulari il pellet come descritto in 4.1, trasferire il surnatante verde a una cuvetta utilizzando una pipetta e disponga la provetta nello spettrofotometro. Lasciare il campione riposare nello spettrofotometro per 1 min garantire che qualsiasi argilla rimanente all'interno del campione si deposita e non interferire con la misurazione.
  5. Determinare una concentrazione di Chl spettrofotometricamente misurando l'assorbanza a 665 nm e 652 nm e OD a 750 nm. La Chl una concentrazione viene determinata utilizzando la formula Chl un = 16,29 x (un665 - OD750) - 8,54 x (un652 - OD750) 20. CHL una concentrazione viene utilizzata come proxy per la concentrazione delle cellule. Inoltre, un fattore di conversione di 7,4 x 1010 cellule/L = 10 g/L21 può essere utilizzato per calcolare la concentrazione cellulare in grammi di alcune specie cianobatterica.
  6. Trama Chl un valori calcolati rispetto al tempo.

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Risultati

Quando esposti ad argilla, cellule cianobatterica sono portate fuori sospensione22. Ciò è dimostrato nei risultati rappresentativi dati qui. Per determinare l'effetto di argilla sulle popolazioni cianobatterica e osservare la sedimentazione tariffe, due esperimenti sono stati condotti durante il quale Prochlorococcus marinus e Synechocystis sono stati esposti a caolino di 50 g/L (tabella 5-6, Figura 2

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Discussione

Flocculazione catalizzata dalla interazione cellula cianobatterica-argilla ha attirato molto interesse nei settori dell'ecologia e ingegneria2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine finanziamenti dalle scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (05448, 165831 e 213411).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
cianobatteri (in questo studio: Synechococcus sp. PCC 7002 e Synechocystis sp. PCC 6803)Pasteur Culture CollectionPCC 7002 o PCC 6803utilizzato per inoculare le piastre
agarThermo ScientificCM0003utilizzato per riempire due piastre
Petri (batteriologia standard, 100 x 15 mm)Sarstedt82.1473.0012 richiesto
1 L di pallone di Erlenmeyer resistente al calorePyrex4980-1251 pallone di
al calore da 250 mldi Pyrex4980-2501 ansa di
inoculazione di Nichrome con manicoFisher Scientific14-956-1031 carta
stagnolaReynolds Wrap foglio di alluminio89079-06750 cm richiesti; utilizzato per coprire il tappo di schiuma e il collo dei palloni di Erlenmeyer
terreno di coltura (ad es. A+)1050 mL richiesto; prodotto utilizzando la composizione descritta nelle tabelle 1-4
Bruciatore BunsenFisher ScientificS959411 tubo
di plasticaFisher ScientificS5045911 m richiesto; utilizzato per creare l'apparato di gorgogliamento
tappo in spugnaJaece Industries Inc14-127-40E1 obbligatorio; foro praticato al centro per pipetta; utilizzato per la costruzione del foglio acrilico dell'apparato di gorgogliamento
 Home DepotOptix foglio acrilico trasparente modello # MC-102S1 richiesto; utilizzato per costruire un serbatoio in acrilico (20 x 30 x 5,1 cm)
adesivo siliconico impermeabiletrasparente Home DepotLoctite modello in silicone trasparente # 9085701 richiesto; utilizzato per costruire un serbatoio in acrilico (20 x 30 x 5,1 cm)
fotocamera o videoregistratorePanasonicHC-V770 videocamera HD1
treppiedeMagnusVT-3001 panno
neroprimomart EAN 0726670162199; Codice articolo 680254blacknappedfr1 richiesto; panno duvetyne light block-out; circa 152 x 213 cm per coprire l'esperimento del serbatoio resistente al
calore pipetta sierologicacorning incorporato C70851013-671-101G1 richiesto; utilizzato per creare le fiale di campioni dell'apparecchio di gorgogliamento
 DynalonS30467almeno 12 (varierà con l'intervallo di tempo scelto)
pipetta in vetro resistente al caloreFisher ScientificCorning Incorporated C708510, 13-671-101G1 richiesto; utilizzato per creare l'apparato di gorgogliamento; Anche la pipetta sierologica in polistirene funzionerebbe, ma dovrebbe essere collegata al tubo e al tappo dopo che il resto dell'apparecchio è stato sterilizzato in autoclave.
microcentrifugaEppendorf22 62 120-3  1 obbligatorio; Prodotti comparabili possono essere utilizzati se in grado di centrifugare provette per microfuge da 1,5 -2 mL a 13.000 x g
macchina a vortice (Vortex-Genie 2)Scientific Industries, IncSI-02361 richiesto
100% metanoloFisher ScientificA412-500 SDSalmeno 12 mL (1 mL per campione) richiesto; Attenzione: Infiammabile, tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza. Non utilizzare o conservare vicino a fonti di accensione. Possono essere utilizzate fonti alternative.
cuvette (1,6  mL, polistirene)Sarstedt67.742almeno 12
spettrofotometroFisher Scientific222-2716001 richiesto; Potrebbe essere utilizzato anche Pharmacia Biotech Novaspec l.
lampadine HomeDepotmodello # 451807; internet #205477895; negozio SKU #10010615386-8 lampadine necessarie per fornire luce per gli esperimenti del serbatoio
pipetta (Pipetman Classic P1000GilsonF123602utilizzata per raccogliere campioni
37 % di acido cloridricoSigma-Aldrich258148Attenzione: corrosivo e tossico. Indossare camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti resistenti agli acidi durante l'uso. Preparato a 4 N prima dell'uso mediante diluizione in acqua deionizzata in una cappa chimica.
Tappo in schiuma (piccolo)CanlabT 1385
Tappo in schiuma (grande)CanlabT 1387Richiede alcuni tappi intatti e alcuni con un unico foro attraverso il centro
30 ° C incubatore/sala di crescita con illuminazione1 richiesto
70 % di etanoloFisher ScientificBP820150030 mL richiesti; Attenzione: tossico e infiammabile. Indossare camice da laboratorio e occhiali di sicurezza
filtro dell'aria idrofobico (Midisart 2000, 0.2 µ m)Sartorius178051 argilla richiesta
(ad es. caolino)Fisher Scientific MFCD00062311almeno 50 g di
provette microfuge richieste (2 mL, polipropilene)Sarstedt72.695.500Possono essere utilizzati prodotti comparabili. Almeno 12 (varierà in base all'intervallo di tempo scelto)
1000 µ L puntali per pipetteSarstedt70.7621 richiesto
diErlenmeyer resistente richiesto richiesto richiesto richiesto continua

Riferimenti

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