Articolo metodologico

Formazione di covalente del DNA addotti da agenti cancerogeni enzimaticamente attivati e farmaci In Vitro e la loro determinazione di 32P-postlabeling

DOI:

10.3791/57177

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20 marzo 2018

1Department of Biochemistry, Charles University

In questo articolo

Sommario

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Valutare la potenza dei prodotti chimici ambientali e farmaci, per essere enzimaticamente addotti bioactivated per intermedi generando covalente del DNA, è un campo importante nello sviluppo del cancro ed il relativo trattamento. Metodi sono descritti per l'attivazione di composto per formare che complessi del DNA, così come le tecniche per la loro rilevazione e quantificazione.

Abstract

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Complessi covalenti del DNA formata da sostanze chimiche o farmaci con potenza cancerogena sono giudicati come uno dei fattori più importanti nella fase di inizio di processi cancerogeni. Questo legame covalente, che è considerata la causa della tumorigenesi, ora viene valutato come un dogma centrale della carcinogenesi chimica. Qui vengono descritti metodi che impiegano le reazioni catalizzate dal citocromo P450 e gli enzimi di biotrasformazione aggiuntive per indagare la potenza di sostanze chimiche o farmaci per la loro attivazione ai metaboliti che formano questi DNA addotti. Le procedure sono presentate che descrive l'isolamento delle frazioni cellulari che possiedono enzimi di biotrasformazione (campioni microsomiali e citosolici con citocromi P450 o altri enzimi di biotrasformazione, vale a dire, perossidasi, NADPH: citocromo P450 ossidoriduttasi, NAD (P) h: ossidoriduttasi o xantina ossidasi). Inoltre, vengono descritti metodi che può essere utilizzato per l'attivazione metabolica delle sostanze chimiche analizzate da questi enzimi come pure quelli per isolamento di DNA. Inoltre, i metodi appropriati in grado di rilevare e quantificare il DNA derivato chimico/droga addotti, cioè, diverse modifiche della tecnica P-postlabeling 32e occupazione di radioattivo etichettato analizzati prodotti chimici, sono indicato nel dettaglio.

Introduzione

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Il metabolismo degli xenobiotici (sostanze chimiche ambientali o farmaci) si verifica in due fasi1. Fasi I e II mirano a rendere i composti originariamente idrofobici (non solubili in acqua) più idrofila (solubile in acqua), rendendoli così facilmente excretable tramite urine, feci e sudore. Fase I (funzionalizzazione) reazioni comprendono l'ossidazione, riduzione, e idrossilazione catalizzata da enzimi come la citocromo P450s (P450s, CYPs), perossidasi (cioè., ciclossigenasi, COX), aldo-cheto riduttasi (AKRs) e microsomico monossigenasi contenente flavina (protocolli). Fase I comprende anche reazioni di riduzione, mediate da una varietà di riduttasi cioè microsomico NADPH: citocromo P450 reduttasi (POR) e citosolica NAD (P) h: ossidoriduttasi (NQO1), xantina ossidasi (XO) e aldeide ossidasi (AO)1 . Nella seconda fase (coniugazione), i gruppi funzionali che sono stati fissati nella fase I sono utilizzati a coniugare piccole molecole polari per aumentare ulteriormente la polarità. Esempi di enzimi che intende partecipare alla reazione di fase II sono sulfotransferasi (SULTs), N, O- acetiltransferasi (NAT), methyltransferases come catecolo -O- metiltransferasi (COMT), glutatione S- transferasi (GSTs) e uridina difosfato glucuronosiltransferasi (UGT)1. La classificazione degli enzimi di fase I o II è, tuttavia, non rigidi, e alcuni enzimi probabilmente possono essere raggruppati in due categorie.

Gli enzimi P450 (EC 1.14.14.1) sono l'eme contenente proteine presenti in vari organismi, che sono implicate nella biotrasformazione di molte sostanze chimiche, che catalizza la loro conversione3,4. Gli enzimi P450 catalizzano idrossilazione di molti substrati, con una reazione in cui un atomo di ossigeno è introdotta nella molecola degli xenobiotici, mentre il secondo atomo di ossigeno è ridotto per formare acqua dalla reazione che richiede due elettroni [l'equazione (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH +H2O+ NADP+ (1)

Gli enzimi P450 localizzati sulla membrana del reticolo endoplasmatico delle cellule di mammiferi (sistemi di P450 microsomici) sono membri del sistema multienzimatico monoossigenasi, che contiene ulteriormente riduttasi NADPH: citocromo P450 (POR) e citocromo b5 , il substrato dell'enzima definito come NADH: citocromo b5 reduttasi. Una generalmente accettata la teoria ipotizza che il donatore dei due elettroni necessari per P450 è il sistema di NADPH/POR. Tuttavia, citocromo b5 potrebbe anche agire come un donatore di elettroni per P450, vale a dire come un donatore dell'elettrone riducendo P450 durante la seconda riduzione del suo ciclo di reazione, dove agisce insieme al NADH: citocromo b5 reduttasi2,3,4.

Mammiferi utilizzano vari enzimi P450 (ad esempio, gli enzimi delle famiglie 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 e 27) per la sintesi di importanti composti endogeni, quali gli steroidi e li usa per il catabolismo di prodotti naturali2,3 . Gli altri enzimi CYP mammiferi, come ad esempio umano CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 e 3A4, metabolizzare prodotti chimici esogeni che sono utilizzati come farmaci. 5 , 6 gli enzimi più importanti che catalizza il metabolismo dei farmaci sono CYPs della sottofamiglia 3A, soprattutto CYP3A4. Le conversioni degli xenobiotici, quali pro-cancerogeni e pro-sostanze tossiche, sono mediate da umano CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 e 3A42,5. La maggior parte di questi CYPs sono presente nel fegato (eccetto CYP1A1 e 1B1). Tuttavia, il CYPs sono espressi anche in parecchi organi extraepatici. Tali P450s potrebbe essere di grande importanza, soprattutto quando essi partecipano bioactivation metabolismo delle sostanze chimiche (farmaci) per intermedi reattivi in questi organi7. P450s vari sono indotte da diversi composti che sono loro substrati, anche se questo non è necessariamente il caso.

Molti enzimi P450 giocano un ruolo nella tossicità chimica (droga). Possono convertire i xenobiotici non solo in loro metaboliti di disintossicazione, ma anche attivarli a specie reattive, che modificare macromolecole endogene che inoltre presentano diverse proprietà biologiche, causando spesso la loro tossicità. DNA, lipidi e proteine potrebbero essere gli obiettivi per la loro modificazione di reattivi elettrofili e radicali generati dai prodotti chimici attivati. Nel caso del DNA, risolvendo parecchie risposte gene importante ed i loro meccanismi sono già noti2,3,4,5.

I cambiamenti nel DNA possono provocare una diminuzione nel controllo della crescita cellulare, e questo fenomeno è considerato come il fattore predominante che conducono allo sviluppo di processi cancerogeni. La generazione di covalente del DNA addotti con prodotti chimici avendo potenza cancerogena è giudicato come uno dei passi più importanti nella fase di inizio di cancerogeni elabora8,9,10,11. È stato dimostrato che le relazioni tra la formazione di DNA addotti e tumorigenesi verificarsi, mentre una diminuzione della quantità di DNA addotti è responsabile di chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. la formazione di cancerogeno o droga-derivati complessi del DNA dipende dalle singole basi di DNA ed è influenzata dalle sequenze di queste basi nel DNA. Le riparazioni del DNA addotti dipendono dalla loro posizione (sul filo del DNA trascritto o non trascritto) e tipi di nucleotidi modificati sequenze8,11,12,15, 16.

In questo articolo, descriviamo le procedure che utilizzano la conversione enzima-catalizzate di sostanze chimiche (farmaci) per indagare la loro potenza deve essere attivato in metaboliti che modificati del DNA (DNA di generazione addotti). Per legame covalente del DNA, di solito composto in esame dovrebbe essere attivato sia da reazioni ossidativa o riduttive, a seconda delle diverse droghe. Ossidativo o riduttiva l'attivazione dei prodotti chimici testati è mediata da un sistema enzimatico P450-dipendente presente nella frazione microsomica del subcellulare o tramite riduzione con riduttasi presente sia nei microsomi (POR, NADH: citocromo b5 reduttasi, enzimi P450) e in frazioni subcellulari citosoliche cellulari (NQO1, XO, AO, perossidasi). Metaboliti reattivi da allora in poi si legano al DNA che formano il DNA addotti. Perché sia ossidativa e riduttive le reazioni sono importanti per attivare parecchie droghe per queste specie reattive, sono descritte le procedure sperimentali che impiegano il sistema enzimatico di ossidazione/riduzione. Inoltre, i metodi appropriati in grado di rilevare e quantificare questi DNA addotti sono descritte in dettaglio.

Due procedure indipendenti per determinare se la sostanza chimica, attivato da sistemi enzimatici, è associato al DNA sono raccomandati: 32P-postlabeling tecnica e che utilizzano composto radioattivo etichettato (ad es., 3H o 14 C). Per il primo pilota, 32P-postlabeling test di screening è raccomandato. La determinazione del contenuto di DNA nelle soluzioni, precisamente valutata, deve precedere entrambi i metodi.

32P-postlabeling tecnica utilizza l'idrolisi enzimatica del DNA modificato da sostanze chimiche non radioattivo (cancerogeno/droga) a 3 ´-phosphodeoxynucleosides, ulteriore fosforilazione con fosforo radioattivo (32P) a 5 minuti- OH posizione e la separazione del prodotto chimico-deossinucleotidi addotti dal normale deossinucleotidi (non modificato) da cromatografia17 (Figura 1). DNA modificato dal composto chimico è idrolizzato da una miscela di endonucleasi, nucleasi di micrococcal ed esonucleasi, noto come milza fosfodiesterasi. La miscela di DNA idrolizzato contenente sia normale (non modificato) e modificato desossiribonucleosidi 3 ´-monofosfati sono reagito con [γ -32P] ATP in presenza di elemento portante (non radioattivo) ATP e T4 polinucleotide chinasi a pH 9,5 per modulo 5 ´- 32P-labeled 3 ´, a 5 minuti-bisphosphates (procedura "standard" nella Figura 1). Il pH alcalino utilizzato è in grado di ridurre al minimo l'attività enzimatica della chinasi di polinucleotide T4 a dephosphorylate desossiribonucleosidi 3 ´-monofosfati in posizione 3 ´. Separazione e risoluzione di 32P-labeled addotti da deossinucleotidi con etichetta che non vengono modificati da sostanze chimiche avviene mediante cromatografia su strato sottile di scambio anionico multidirezionale (TLC) su polyethyleneimine (PEI) cellulosa (Figura 2 ). Nei passaggi di eluizione prima e la seconda (in direzione di D1 e D2), con etichetta normale deossinucleotidi (non modificato), come pure [32P] fosfato è eluito fin dall'inizio della piastra TLC-PEI-cellulosa utilizzando soluzioni di acqua dell'elettrolita su un breve pezzo di carta cromatografica applicato sulla parte superiore della piastra di TLC, considerando che i desossinucleotidi contenenti prodotti chimici associati che esibiscono proprietà idrofobe (cancerogeno/droga-addotti) sono tenute all'inizio della piastra di PEI-cellulosa per essere inoltre risolto con vari sistemi solvente nelle direzioni D3 e D4 (Figura 2). Localizzazione di addotti viene eseguita mediante autoradiografia schermo migliorato; addotti i separati vengono rilevati come macchie scure riconoscibili sulle pellicole di raggi x. Le aree di macchie sono asportate dalla piastra e utilizzate per quantificare la radioattività da scintillazione liquida o Cerenkov contando. Un fosforo di deposito metodo che è stato adattato per mappare e quantificare il DNA di imaging addotti su cromatogrammi rilevati da 32P-postlabeling analisi ora è anche usata. 18 macchina the Instant Imager è spesso utilizzato per tale rilevazione e quantificazione del DNA addotti. Questo metodo fornisce più di 10 volte maggiore sensibilità per rilevazione 32P che la tecnica dello schermo migliorato autoradiografia19.

Quantità di DNA addotti sono determinati come valori di parente adducono etichettatura (RAL), calcolata utilizzando l'equazione (2) come segue:

CPM. addotto in deossinucleotidi
RAL =---(2)
attività specifica di 32P-ATP (in cpm. / pmol) x pmol deossinucleotidi

I valori di RAL sono il rapporto dei tassi totali di desossinucleotidi pollici addotti sopra i tassi di conteggio del totale [pollici addotti e normale (non modificato) deossinucleotidi] deossinucleotidi20,21. Tuttavia, questo calcolo si basa sulla parità etichettatura efficienze di addotti e normale deossinucleotidi22. La procedura classica ("standard") del 32P-postlabeling tecnica è adatta per vari DNA adduce (ingombranti e/o non ingombranti addotti), tuttavia, la sua sensibilità non è soddisfacente per rilevare addotti trovato in basse quantità nel DNA. Utilizzando questa procedura, la quantità di un addotto in 107 invariato deossinucleotidi nel DNA (0,3 fmol addotto / µ g del DNA) è rilevabile.

Una varietà di modifiche di questa classica 32P-postlabeling procedura sono stati utilizzati per elevare la sensibilità della tecnica. Fino a 10-100 volte maggiore sensibilità della determinazione degli addotti da 32P-etichettatura è stato raggiunto utilizzando limitando i livelli di ATP [γ -32P] (la procedura di intensificazione). 23 , 24 un'ulteriore procedura fornendo che un aumento della sensibilità del metodo 32P-postlabeling utilizza un'incubazione contenente DNA digerito addotti con nucleasi P1 (da Penicillium citrinum)21 (Figura 1). Questo enzima preferisce dephosphorylate desossiribonucleosidi non modificato 3 ´-monofosfati, considerando che i desossinucleotidi con prodotti chimici associati (pollici addotti nucleotidi) sono essenzialmente non i substrati di questo enzima. Pertanto, trifosfati defosforilata 3 ´-monofosfati (cioè, desossiribonucleosidi) non sono fosforilati da chinasi di polinucleotide T4 dal fosfato [32P] da γ -32P] ATP. Tuttavia, alcuni di nucleotidi dove i prodotti chimici sono vincolati (pollici addotti deossinucleotidi), come arylamine addotti sostituito a C8 della deossiguanosina, può bedephosphorylated da questo enzima. Al contrario, la maggior parte altri addotti (ad es., addotti sostituito al N2 di deossiguanosina) non sono defosforilata di nucleasi P1. Questa modifica di 32P-postlabeling rende questo metodo notevolmente più sensibile, aumentando la sua sensibilità di più di tre ordini di grandezza. Inoltre, questa versione di 32P-postlabeling fornisce un metodo dove maggiore quantità di DNA (5-10 µ g) e un eccesso di carrier-gratuita ATP [γ - 32P] può essere utilizzato.

Un altro metodo per arricchire l'addotti, descritto da Gupta25, utilizza il fisico-chimiche proprietà di deossinucleotidi ingombranti addotti, che può essere estratto in n-butanolo in presenza di una fase trasferimento agente tetrabutilammonio cloruro (TBA) (Figura 1) prima del [32P] fosfato etichettatura, considerando che non modificati deossinucleotidi sono scarsamente estratte da questo solvente organico. Tuttavia, meno idrofobo addotti, consistente per esempio di desossinucleotidi modificato con moiety ingombranti non aromatici o alchil piccoli residui, non sono effettivamente estratti con n-butanolo. Perciò, essi sono essenzialmente non rilevabile quando vengono analizzati da questa modifica di 32P-postlabeling metodo.

Entrambe le versioni precedentemente accennate di 32P-postlabeling aumento la sensibilità e la quantificazione di DNA addotti enormemente (fino a tre ordini di grandezza), essendo in grado di rilevare uno del complesso ogni 109,10 normale nucleotidi (0,3 - 3 amol / µ g del DNA). Questi due metodi sono raccomandati test chimici per la loro efficienza legare covalentemente al DNA e, di conseguenza, essi sono descritti in questo lavoro nei dettagli.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i regolamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio (311/1997, Ministero dell'agricoltura, Repubblica Ceca), che è in conformità con la dichiarazione di Helsinki.

1. isolamento delle frazioni microsomiche e citosoliche epatiche

  1. Preparare le frazioni subcellulari epatiche (microsomi ricchi di enzimi P450 o citosol ricco di riduttasi o solubile perossidasi) dai ratti tramite centrifugazione differenziale semplice (105.000 x g).
    Nota: Il pellet e il surnatante sono presi come microsomi e citosol, rispettivamente.
    1. Lavare i campioni del fegato (1-10 g) due volte con tampone di 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 contenente 150 mM buffer di KCl (buffer 1) (volumi maggiori di 10 volte del peso del tessuto, vale a dire 10-100 mL) e tagliare i tessuti in piccoli pezzi (di circa le dimensioni di 2 x 2 mm).
    2. Omogeneizzare il tessuto in presenza di questo buffer (> 3 mL/g di peso/volume) in omogeneizzatore a 4 ° C per 5 min e scartare i pezzi non omogeneizzato residuali del tessuto di filtrazione utilizzando carta da filtro. Centrifugare l'omogeneizzato a 600 x g per 10 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in un'altra provetta di centrifugazione.
    3. Ri-omogeneizzare il pellet nel buffer 1 (1 mL / 1 g di tessuto), ripetere il punto 1.1.3. e scartare il pellet. Centrifugare i surnatanti riuniti a 15.000 x g per 20 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un'altra provetta di centrifugazione.
    4. Centrifugare il supernatante a 105.000 x g per 60 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante (citosol) e memorizzarlo in aliquote (1-10 mL) a-80 ° C. Caratterizzano il cytosol per la quantità di proteina usando il metodo descritto da Bradford26.
    5. Risospendere il pellet in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,4 (> 2 mL/g di peso/volume), centrifuga a 105.000 x g per 60 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Ri-omogeneizzare il pellet (microsomi) in tampone Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 contenente 150 mM KCl e 20% glicerolo (< 5 mL/g di peso/volume) in omogeneizzatore a 4 ° C. Memorizzi microsomi nelle 0,5 - 1 mL aliquote a-80 ° C. Caratterizzano i microsomi per il contenuto delle proteine usando il metodo descritto da Bradford26.
    6. Determinare la concentrazione del citocromo P450 in microsomi.
      Nota: La concentrazione degli enzimi P450 nei microsomi è misurata come descritto da Omura e Sato27, determinare l'assorbimento del complesso di P450 ridotto con monossido di carbonio (CO). Monossido di carbonio è un composto tossico e deve essere maneggiato con cura e in un cappuccio.

2. le incubazioni di Test prodotti chimici (sostanze cancerogene/droghe) con il DNA in presenza di sistemi enzimatici

  1. Incubazione di test prodotti chimici (sostanze cancerogene/droghe) con il DNA in presenza di sistemi enzimatici ossidativi che contiene i citocromi P450
    1. Preparare miscele di incubazione contenente, in un volume finale di 0,75 mL a 4 ° C, i seguenti composti e sistemi enzimatici.
      1. Mescolare 100 mM di tampone fosfato, pH 7.4, (0,375 mL) con sistema di generazione di NADPH (10mm MgCl2, 10 mM D-glucosio 6-fosfato, 10mm NADP+, 1 U/mL D-glucosio 6-fosfato deidrogenasi) o 10 mM NADPH (75 µ l).
      2. Aggiungere in questa microsomi di miscela o puro P450 ricombinanti in Supersomes, che sono microsomi isolati da cellule di insetto trasfettate con un costrutto di baculovirus contenente il cDNA di enzimi P450 ricombinanti, 50 pmol P450 enzimi in 50 µ l microsomico o supersomal preparazioni - frazioni microsomiche epatiche isolate in laboratorio o da una fonte commerciale.
      3. Aggiungere del DNA del timo di vitello 1 mg (0,3 mL di soluzione di riserva - 3,3 mg/mL in acqua distillata) e agitare un agitatore vortex per 5 s.
      4. Infine, aggiungere 7,5 µ l 0,1 mM prova ellipticine droga dissolto in DMSO e µ l 42,5 distillata acqua per raggiungere un volume di miscela di incubazione da 0,75 mL. Prodotti chimici di uso etichettati con 3H o 14C o prodotti chimici privi di etichetta, a seconda della procedura per la rilevazione del DNA di addotti.
      5. Agitare un agitatore vortex per 5 s. Incubare in provette aperte a 37 ° C per 30-60 min.
      6. Anche preparare due incubazioni di controllo allo stesso modo, ma (i) senza un sistema di attivazione (microsomici campioni) o (ii) con esso, ma senza la sostanza in esame.
  2. Incubazioni di prova prodotti chimici (sostanze cancerogene/droghe) con il DNA in presenza di sistemi enzimatici riduttive
    1. Preparare miscele di incubazione contenente, in un volume finale di 0,75 mL a 4 ° C, i seguenti composti e sistemi enzimatici.
      1. A 4 ° C, mescolare 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, contenente 0,2% Tween 20, (0,375 mL), soluzione di 10 mM di cofattore dell'enzima riduttiva NQO1 (NADPH) (75 µ l), frazione citosolica (frazioni citosoliche epatiche - isolate in laboratorio o nel caso di utilizzo il citosolico frazioni isolate dai singoli donatori umani che sono stati ottenuti dall'origine commerciale contenente 1 mg di proteina (50 µ l)).
      2. Aggiungere del DNA del timo di vitello 1 mg (0,2 mL di soluzione di riserva - 3,3 mg/mL di acqua distillata) e agitare un agitatore per 5 s.
      3. Infine, aggiungere 7,5 µ l 0,1 mM test chimici (disciolto in acqua distillata, metanolo, etanolo o DMSO, a seconda della solubilità del composto) e µ l 42,5 distillata acqua per raggiungere un volume di 0,75 mL per la miscela di incubazione. Prodotti chimici di uso etichettati con 3H o 14C o prodotti chimici privi di etichetta, a seconda della procedura per la rilevazione del DNA di addotti (Vedi sotto).
      4. Eliminare la miscela di reazione con argon per 1 min. Agitare su un agitatore per 5 s. Incubare in tubi chiusi a 37 ° C per 30-60 min.
      5. Anche preparare due incubazioni di controllo allo stesso modo, ma (i) senza un sistema d'attivazione (frazioni citosoliche) o (ii) con esso, ma senza sostanze chimiche di prova.
  3. Estrazione di miscele di incubazione con solventi organici per eliminare l'eccesso di sostanze chimiche di prova
    1. Mescolare la miscela di incubazione in una provetta con un tappo con lo stesso volume di acetato di etile (o etere etilico o esano) con l'aggiunta di questi solventi. Agitare il contenuto del tubo su un agitatore fino a ottenere un'emulsione.
    2. Centrifugazione (3 min) a 1.600 x g in una centrifuga a temperatura ambiente. Se fasi organiche ed acquose non sono correttamente separati, girare ancora una volta per un più lungo periodo o ad una maggiore velocità di centrifugazione.
    3. Rimuovere la fase superiore, organica, raccolta con una pipetta. Se piccoli volumi (< 400 µ l) sono utilizzati, di utilizzare una pipetta automatica misura con una punta adatta. Messo da parte questa fase organica.
    4. Ripetere i passaggi da 2.3.1., 2.3.2. e 2.3.3. Rimuovere i solventi residui organici da un flusso di gas azoto (almeno 5-10 min di rimozione sono necessari).
  4. Isolamento di DNA da incubazioni
    1. Estrazione di DNA da soluzioni con fenolo/cloroformio e relativa precipitazione con etanolo
      1. Eliminare le proteine per isolare il DNA da miscele di incubazione di estrazione di proteine da soluzioni di DNA con fenolo, fenolo/cloroformio (1:1) e cloroformio dalla procedura illustrata di seguito.
      2. Unire la miscela di incubazione con la stessa quantità di fenolo o fenolo/cloroformio (1:1) in un falco o tubo Eppendorf con un tappo. Mescolare il composto fino a ottenere un'emulsione.
      3. Centrifugazione (3 min) a 1.600 x g in una centrifuga a temperatura ambiente. Se fasi organiche ed acquose non sono separate correttamente, far girare ancora una volta per un periodo più lungo o ad una maggiore velocità di centrifugazione.
      4. La fase superiore dell'acqua con una pipetta di trasferimento ad un nuovo tubo in polipropilene. Se piccoli volumi (< 400 µ l) sono utilizzati, di utilizzare una pipetta automatica misura con una punta adatta. Rimuovere l'interfaccia proteina insieme la fase organica.
      5. La fase acquosa superiore si combinano con la stessa quantità di una miscela di fenolo e cloroformio (1:1). Riprodurre passaggi 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. La fase acquosa superiore si combinano con la stessa quantità di cloroformio e ripetere i passaggi 2.4.1.2. -2.4.1.4. Recuperare il DNA da precipitazione con 2 volumi di etanolo freddo (-20 ° C). Determinare il volume della soluzione del DNA.
      7. Adattare la concentrazione di cationi monovalenti tramite l'aggiunta di cloruro di sodio 5 M per la finale le concentrazioni di 0,1 M. mescolare energicamente. Combinare con 2 volumi di etanolo freddo (-20 ° C) e mescolare bene. Raffreddare fino a-20° C.
      8. Conservare a-20 ° C fino a quando il DNA è precipitato. Quando il DNA è frammentato durante le incubazioni (ad es., da formazione di radicali dell'ossigeno durante la reazione di attivazione enzimatica) o durante la procedura di isolamento alla dimensione del DNA che è piccola (< 1 kb) o quando il DNA è presente in piccole quantità (< 0,1 mg / mL), il tempo di raffreddamento deve essere aumentata ed ha fatto diminuire la temperatura a-70 ° C.
      9. Centrifuga (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C in una centrifuga. Se il DNA è presente a basse concentrazioni o sotto forma di piccoli frammenti, girare ancora una volta per un periodo più lungo (30 min). Scartare il surnatante.
      10. Per rimuovere qualsiasi soluti (o tracce residue del test chimici) che potrebbero essere presenti nel precipitato DNA, DNA di lavaggio con etanolo al 70% ed etere etilico. Lavare precipitato DNA con il freddo (-20 ° C) etanolo al 70%. Centrifuga (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C in una centrifuga. Scartare il surnatante.
      11. Ripetere il passaggio 2.4.1.10. Lavare precipitato DNA con il freddo (-20 ° C) etanolo al 70%. Centrifuga (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C in una centrifuga. Scartare il surnatante.
      12. Ripetere il passaggio 2.4.1.10. Mettere il tubo in un stato verticale su carta assorbente per eliminare il surnatante residuo. Lavare la pallina di DNA aggiungendo 1 mL di etere etilico a scartare i potenziali residui del test chimici da DNA isolato. Centrifuga (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C in una centrifuga. Scartare il surnatante.
      13. Dissolva la pallina del DNA nel volume appropriato (di solito in 100-400 µ l per ottenere una concentrazione di DNA di 0,5 - 1 µ g / µ l) di acqua distillata (o cloruro di sodio citrato di sodio e 1,5 mM 0.15 mM). La soluzione di DNA può riposare tutta la notte a 4 ° C, o può essere riscaldata a 37 ° C per 10-30 min aumentare la dissoluzione del DNA.
      14. Prima di stoccaggio, è possibile separare il DNA in piccole aliquote (10-20 µ l), perché ripetuti di congelamento e scongelamento delle soluzioni di DNA potrebbe risultato una diminuzione del complesso concentrazioni. Conservare a-80 ° C o più freddo.
        Nota: Determinazione spettrofotometrica del DNA: il metodo semplice e preciso, che è ampiamente usato per misurare la quantità di DNA in una preparazione se il campione è puro (cioè, senza significative quantità di contaminanti quali proteina, fenolo o altro acidi nucleici), è la misura spettrofotometrica della quantità di DNA di UV irradiazione assorbita dalle basi (Vedi le procedure descritte in precedenza)28.
  5. Formazione del complesso di procedure per la rilevazione del DNA
    1. 32 Analisi P-postlabeling
      Nota: Idrolisi di DNA utilizza l'idrolizzato preparato in questa fase per l'analisi di addotti (2.5.1.) così come di normale (non modificato) deossinucleotidi (2.5.7.).
      1. Sciogliere nucleasi di micrococcal (MN) in acqua ad una concentrazione di ~ 450 unità (U) / mL. Dializzare contro acqua distillata e regolare a 300 U/mL. Dializzare soluzione fosfodiesterasi (SPD) della milza e regolare a 4 U/mL.
      2. Mescolare MN e SPD a concentrazioni finali 150 mU / µ l MN e 2,5 mU / µ l SPD (soluzione MN/SPD). Prendere la soluzione di DNA contenente 12,5 µ g ed evaporare a secchezza in un evaporatore. Si dissolve in 6,5 µ l di acqua distillata.
      3. Aggiungere 5,0 µ l di soluzione di MN/SPD (concentrazione finale di MN è 60 mU / µ l, la concentrazione finale di SPD è di 1 mU / µ l) e 1,0 µ l di tampone di digestione (concentrazione finale del succinato del sodio è di 20 mM, la concentrazione finale di CaCl2 è di 8 mM). Il volume finale della miscela è 12,5 µ l. Mix e consentire reazioni per 3 h a 37 ° C.
      4. Rimuovere 2,5 µ l (trasferimento in un'altra provetta) per ulteriore diluizione e l'analisi di desossinucleotidi non modificato (2.5.7.)
    2. Procedura di arricchimento di nucleasi P1
      1. Aggiungere il restante 10.0 µ l di idrolizzato, 0,65 µ l tampone sodio acetato (concentrazione finale, 40 mM), 0,65 µ l ZnCl2 soluzione (concentrazione finale 0,1 mM), 1.25 µ l di soluzione di NP1 (concentrazione finale, 0.385 µ g / µ l) e 0,45 µ l di acqua distillata. Il volume finale della miscela è 13 µ l.
      2. Lasciare che la miscela di reagire per 30 min a 37 ° C e terminare la reazione con aggiunta di 3 µ l di soluzione di Tris.
    3. n-procedura di arricchimento di butanolo
      1. Il restante 10.0 µ l di idrolizzato di DNA, aggiungere 215 µ l di soluzione di formiato di ammonio 11,6 mM, pH 3,5 e 25 µ l 10 mM TBA cloruro soluzione. Estrarre con 250 µ l n-butanolo (saturato con acqua) mescolando vigoroso. Centrifugazione (3 min) a 1.600 x g da livelli separati e togliere il superiore n-strato di butanolo. Estrarre ancora una volta con 250 µ l n-butanolo (saturato con acqua), spin, togliere il superiore n-butanolo strato e si combinano con Estratto di ex.
      2. Aggiungere 400 µ l acqua (saturi con n-butanolo) a questo estratto e mescolare energicamente. Girare per livelli separati ed eliminare lo strato acquoso inferiore. Ripetere questa procedura di lavaggio utilizzando 400 µ l di acqua (saturi con n-butanolo). Aggiungere 3 µ l di 250 mM Tris-HCl soluzione pH 9.5, la n-strato di butanolo. Evaporare il n-butanolo a secco in un evaporatore a temperatura ambiente.
      3. Disciogliere il residuo in 100 µ l n-butanolo, evaporare a secchezza nuovamente e disciogliere il residuo in acqua di 16,0 µ l.
    4. Etichettatura degli addotti
      1. Aggiungere 1 µ l di soluzione tampone bicina (etichettatura buffer) e 4,5 µ l di una miscela contenente 100 µ ci [γ -32P] ATP, 45 pmol di ATP freddo e 10.0 U di T4-PNK (T4-phosphonucleotide chinasi) a 16,0 µ l di soluzione da mix di arricchimento NP1 o butanolo. Le concentrazioni finali dei reagenti sarà il seguente: bicina 20 mM, 10 mM MgCl2, 10mm ditiotreitolo, spermidina 0,5 mM e PNK-0,5 U / µ l T4, ATP di 3 µM. Il volume totale della miscela è di 20 µ l.
      2. Lasciare che la miscela di reagire per 30 min a temperatura ambiente. Applicare l'intero campione (cioè. 20 µ l) sulla piastra di PEI-cellulosa TLC (2.5.6.).
    5. Valutazione dell'efficacia di NP1 o n -butanolo migliorando le procedure
      1. Lavare il fondo del tubo con acqua di 50 µ l. Mescolare vigorosamente per 30 s e spin (1 min) a 1.600 x g in una centrifuga per stabilire c' non è nessuna contaminazione sul coperchio. Spot 5 µ l su una piastra di TLC PEI-cellulosa (20x20 cm). Cromatografi utilizzando così una soluzione 280mm (NH4)24 e 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. Separazione di TLC di desossinucleotidi pollici addotti
      1. Pre-lavare i piatti di TLC con acqua distillata. È consigliabile soprattutto per piatti fatti in casa.
        Nota: Questo lavaggio dovrebbe essere eseguito per rimuovere il colore giallo da piastre, un colore che può elevare lo sfondo, in particolare presso il fronte del solvente.
      2. Spot la totalità del campione sulla piastra di PEI-cellulosa TLC e avviare cromatografia (2.5.4.); clean-up di addotti viene eseguita mediante lo sviluppo della piastra in direzione D1 e D2 (Figura 2).
      3. Sviluppare la lastra in una direzione di D1 (Figura 2). Tampone di fosfato di sodio uso 1,7 M, pH 6.8, per garantire che il DNA addotti sono restanti all'inizio della piastra TLC. Analogamente, sviluppare la lastra in senso D2 utilizzando questo buffer. Per informazioni sui possibili buffer per le procedure, vedere soluzioni descritte per la risoluzione di diversi tipi di addotti tra20,28.
        Nota: Lo sviluppo della piastra in una direzione di D2 può essere omesso.
      4. Lavare la lastra in acqua deionizzata dopo cromatografia per circa 5 min in due vasche consecutive. Dopo di che, asciugare le piastre.
      5. Sviluppare le piastre in D3 e D4 direzione utilizzando tampone formiato litio di 3,5 M, pH 3.5, contenenti 0,5 e 8,5 M urea per D3 direzione tampone M Tris-HCl, pH 8.0, contenenti urea LiCl e 8,5 M di 0,8 M per D4 direzione (Figura 2). I solventi devono essere adeguati per sviluppare le macchie addotto sopra la piastra di TLC. Per informazioni sui possibili buffer per le procedure di sviluppo D3 e D4, vedere le soluzioni descritte per la risoluzione di diversi tipi di addotti23,24,25,28.
      6. Per evitare problemi in D4, dopo lo sviluppo in una direzione di D4 e un lavaggio ad acqua, sviluppare le piastre (lungo D4) a 1,7 M di fosfato di sodio, pH 6.0 (solitamente assegnate come sviluppo in direzione D5), nella parte superiore di uno stoppino di carta (12 x 11,5 cm).
        Nota: La direzione di D5 può anche essere omesso. In questo caso, è necessario aprire il serbatoio del TLC quando il solvente ha raggiunto la cima del TLC e consentire una corsa per fino a 60 min. Questo metodo è ancora meglio rispetto all'aggiunta di uno stoppino (il metodo frequentemente utilizzato in molti laboratori per eliminare eventuali problemi in D4).
    7. Quantificazione dei deossinucleotidi (non modificato) normale dopo idrolisi
      1. Diluire una parte aliquota dell'idrolizzato (da 2.5.1. descrivendo l'idrolisi del DNA) con acqua distillata, (cioè., 2,5 µ l della miscela digestione da 2.5.1. regolato a 250 µ l e 10 µ l di questa soluzione regolata a 150 µ l).
      2. Prendere un 5 µ l (10 pmol normale deossinucleotidi) aliquota di questo digest, aggiungere 2,5 µ l di tampone Tris-HCl 10 mM, pH 9.0 ed etichetta come in 2.5.4. (il volume finale della miscela è di 10 µ l). Lasciare per agire per 30 min a temperatura ambiente.
      3. Prendere un 4 µ l aliquota della miscela e diluire a 750 µ l con 10 mM Tris-HCl, pH 9.0. Mix e spin per stabilire che non c'è nessuna contaminazione del coperchio. Applicare 5 µ l su una zolla di PEI-cellulosa TLC. Sviluppare la lastra TLC in una soluzione di 280 mM (NH4)2così4 e 50 mM NaH2PO4, pH 6.5. Lasciare per asciugare dopo TLC.
      4. Utilizzare autoradiografia che viene eseguita per circa 45 min a temperatura ambiente per localizzare i quattro deossinucleotidi non modificato bis-fosfati. Tagliare spot per la quantificazione di scintillazione liquida o Cerenkov contando.
    8. Calcolo del parente addotto etichettatura (RAL)
      1. Determinare i valori di conteggi nei punti addotto ed i conteggi nella parte aliquota di deossinucleotidi (normale) non modificato con etichetta.
        Nota: Quest'ultimo deve essere determinato su 180.000 conta meno materiale di quella precedente, una figura che è il fattore di conversione da applicare al conteggio di desossinucleotidi non modificato (normale) per valutare i valori RAL dei livelli addotto. RAL di DNA adduce è calcolata secondo l'equazione (2) sopra indicato.
    9. Rilevazione di associazione del test agenti cancerogeni o droghe di DNA usando farmaco radioattivo etichettato
      1. Valutare la 3H o radioattività 14C di DNA modificato con prodotti chimici contando di scintillazione liquida.
      2. Aggiungere 10-50 µ l di soluzione di DNA a 3 mL di una soluzione di scintillazione del flaconcino di scintillazione. Mescolare bene. Misurare la radioattività utilizzando il contatore di scintillazione.

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Risultati

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Utilizzando i protocolli descritti qui per l'utilizzo dell'enzima-catalizzate attivazione (cioè, P450, perossidasi, reduttasi) per indagare la potenza dei prodotti chimici (sostanze cancerogene/droghe) per essere metabolizzato a intermedi conseguente loro covalente associazione a DNA (generazione del DNA addotti), siamo stati in grado di risolvere (i) un nuovo meccanismo dell'azione farmacologica di ellipticine l'agente anticancro (per vedere recensione,29...

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Discussione

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In questa carta, è dimostrato una metodologia ampiamente accessibile per studiare la potenza dei prodotti chimici bioactivated per intermedi metabolici, con conseguente generazione di covalente del DNA di essere addotti. Questo è un tema cruciale, perché valutazione delle droghe della loro attivazione enzimatica a metaboliti generando covalente del DNA o la potenza dei prodotti chimici ambientali complessi è un campo importante nello sviluppo del cancro ed il relativo trattamento. La modifica del DNA dagli agenti cancero...

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Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla di divulgare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da Fondazione ceca per la scienza (GACR, grant 17-12816S).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TrisSigma-Aldrich252859
Cloruro di potassioSigma-AldrichP9541
Acetato di sodioSigma-AldrichS2889
FenoloRoth0032.8
Fenolo/Cloroformio/IsoamilalcolRothA156.1
EtanoloPenta70390-11000
DNA del timo di vitelloSigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-glucosio 6-fosfatoSigma-Aldrich7647001
D-glucosio 6-fosfato deidrogenasiSigma-AldrichG6378
SupersomiCorning Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Microsomi epatici umaniCorning Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
IpoxantinaSigma-Aldrich77662
2-IdrossipirimidinaSigma-AldrichH56800
Acetato di etileSigma-Aldrich437549
Etere dietilicoSigma-Aldrich179272
Nucleasi micrococcica da Staphylococcus aureusSigma-AldrichN3755
Milza fosfodiesterasi da milza di vitello, Tipo IICalbiochem524711
Nucleasi P1 da Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
BicinaSigma-Aldrich163791
DL-DitiotreitoloSigma-AldrichD0632
SpermidinaSigma-AldrichS2626
Cloruro di tetrabutilammonioSigma-Aldrich86870
n-butanoloSigma-Aldrich437603
T4-polinucleotide chinasiUSB Corp70031Y
[γ-32P]ATPHartman Analytic GmbHFP-201
Lastre TLC in cellulosa impregnata di PEIMacherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400PackardG120337
ElliptticineSigma-Aldrich285730
3-nitrobenzantronopreparato (sintetizzato) come mostrato nella ref. 40

Riferimenti

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