Articolo metodologico

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

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DOI:

10.3791/57191

⸱

6 febbraio 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l'imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l'invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.

Abstract

La sepsi è un tipo di infezione grave che può causare insufficienza d'organo e tessuto danni. Anche se i tassi di mortalità e morbilità associata a sepsi trattamento estremamente alto, nessun diretto o meccanismo di organo è stato esaminato in dettaglio in tempo reale. Il fegato è l'organo chiave che gestisce le tossine e le infezioni nel corpo umano. Nel presente documento, abbiamo mirato a eseguire imaging videomicroscopia del fegato del mouse dopo induzione di endotoxemia al fine di monitorare la motilità delle cellule immuni, quali neutrofili e macrofagi del fegato capsulari (LCMs). Di conseguenza, abbiamo progettato un nuovo metodo chirurgico per l'esposizione del fegato con la chirurgia mini-invasiva. Topi sono stati iniettati intraperitonealmente con il lipopolysaccharide (LPS), un comune dell'endotossina. Utilizzando il nostro nuovo approccio chirurgico per l'esposizione e l'imaging videomicroscopia del reclutamento del mouse del fegato, che abbiamo trovato che dei neutrofili in proteina fluorescente verde-LysM LPS-trattati (GFP) mouse del fegato è stato aumentato rispetto a quello in tampone fosfato fegato di salino-trattati. Dopo il trattamento LPS, il numero dei neutrofili è aumentato significativamente con tempo. Inoltre, con successo, utilizzando topi CX3Cr1-GFP, visualizzato macrofagi residenti del fegato chiamati LCMs. Pertanto, per studiare l'efficacia di nuovi reagenti per controllare la mobilità immuni in vivo, determinare la motilità e la morfologia dei neutrofili e LCMs nel fegato possono permetterci di identificare effetto terapeutico in organo fallimento e tessuto danni causati da attivazione di leucociti nella sepsi.

Introduzione

Il fegato è l'organo metabolico principale nei mammiferi; Esso agisce come una torre di controllo per energia, ormoni e disintossicazione1. Grazie alla sua importanza, i ricercatori hanno condotto molti esperimenti in vitro e in vivo per delucidare i cambiamenti nel fegato durante l'infiammazione. La microscopia intravital è stata usata per catturare immagini in diretta dal fegato2 . Infatti, fegato vari metodi di formazione immagine sono stati introdotti2,3,4,5,6. Tuttavia, al fine di sviluppare un approccio chirurgico più semplificato e raggiungere la stabilizzazione dell'organo bersaglio e le cellule immunitarie, abbiamo progettato un semplice protocollo che possa guidare i ricercatori per ridurre al minimo il loro sforzo per videomicroscopia imaging.

In questo studio, abbiamo introdotto una camera di imaging stabile e romanzo e la tecnica chirurgica che possa essere utilizzata per ridurre al minimo il sanguinamento e possibili infezioni. Abbiamo confermato che il fegato è rimasta intatto per più di 2 h. Con questo metodo, abbiamo identificato correttamente morfologie di LCMs7 e neutrofili sotto condizione settica. Poiché questo metodo minimizza fisici e biologici fattori confondenti quali infiammazione tremante e imprevisto durante la procedura chirurgica, prevediamo che questo metodo potrebbe essere utilizzato per osservare le reazioni acute di cellule immunitarie nel fegato in risposta a i reagenti come LPS.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida istituzionali Animal Care e uso Comitato di Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteina fluorescente LysM-verde (GFP; gfp / +) topi8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +) topi9 a 8-12 settimane di età sono stati usati per l'imaging di videomicroscopia. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell'autoclave e disinfettato con alcol al 70%.

1. custom-designed mouse fegato imaging camera con strumenti di supporto

  1. Fegato di topo imaging della camera di
    1. Fare un alloggiamento delle seguenti dimensioni per fegato di topo di immagine (Figura 1): camera interna (lunghezza × larghezza 160 mm × 30 mm altezza di 120mm), alloggiamento esterno (100 mm lunghezza × larghezza 100 mm × 24 mm altezza), bulloni (Ф 3 × 30 mm di altezza), noci (Ф 4 mm) e i dadi a forma di ala (Ф 4 mm).
    2. Misurare l'agente indurente ed elastomero base in rapporto 1:9 per fare un totale di 120 g di silicone.
    3. Mettere il composto di silicone liquido in una beuta da 250 mL e mescolare bene. Quindi mettere il pallone in un essiccatore e rimuovere le bolle d'aria per circa 1 h sotto vuoto attraverso la pompa.
    4. Versare la miscela di silicone liquido in una camera del mouse personalizzati alta come 10 mm di altezza e lasciarlo cura per un paio di giorni (Figura 1A).
  2. Preparazione dei vetrini di copertura ed il fegato fissaggio letto
    1. Sulla cornice metallica, fissare il vetro di copertura utilizzando colla siliconica. Lasciare asciugare per 1 giorno (Figura 1B).
    2. Al fine di tenere efficacemente l'acqua distillata per l'obiettivo d'immersione in acqua, una struttura di blocco acqua semipermanente è essenziale. Fare 1 mm colla siliconica di arrotondamento e si induriscono durante la notte.
    3. Mescolare l'agente indurente e l'elastomero base e poi versarlo in una piastra a 6 pozzetti ad un'altezza di circa 8-10 mm. eseguire il processo di indurimento come descritto in 1.1.2-1.1.4.

2. preparazione del LPS

  1. Preparare sterile 1 × tampone fosfato salino (PBS) per diluire la polvere di LPS da Salmonella enterica sierotipo enteritidis. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4).
  2. Pre-riscaldare PBS in bagnomaria a 37 ° C e aprire con cautela il flacone della polvere LPS (25 mg).
  3. Tramite un aiuto di dispensare, versare il PBS sterile (5 mL) nel flacone polvere LPS e mescolare delicatamente o sospendere la soluzione per preparare la soluzione di riserva.
    Nota: Dopo polvere LPS è liquefatto, Vortex dure può causare bolle. Evitare di fare bolle per minimizzare la perdita quando si effettuano le aliquote in provette da 1,5 mL.
  4. Conservare la soluzione stock di LPS a − 20 ° C e diluirla in una soluzione di LPS di 1 mg/mL per iniezione.
  5. Iniettare la soluzione di LPS di 1 mg/mL (20 mg/kg) nel peritoneo di un mouse non anestetizzato usando una siringa da 1 mL. Per l'animale di controllo, iniettare lo stesso volume di PBS.
  6. Attendere per 2 h per risposta infiammatoria sufficiente.

3. preparazione del dextrano del Texas-rosso a macchiare i vasi sanguigni

  1. Preparare due provette coniche da 15 mL e 10 mL di PBS sterile.
  2. Diluire la polvere rosso-Texas destrano (25 mg) in 3 mL di PBS e mescolare bene. Trasferire il composto in una provetta conica 15 mL vuota.
  3. Trasferire il restante PBS (7 mL) nella provetta conica 15 mL contenente la miscela di destrano (3 mL).
  4. Collegare un siringa filtro da 0,45 µm fino alla punta di una siringa da 10 mL. Il filtro siringa dovrebbe sostituire l'ago.
  5. Filtrare la miscela di destrano (10 mL). Premere in modo uniforme la siringa al fine di evitare di versare.
  6. Dispensare 500 µ l di soluzione del dextrano 2,5 mg/mL nel tubo di 1,5 mL di luce-bloccata e conservarlo a − 20 ° C. Una volta scongelato, conservarlo a 4° C.

4. processo chirurgico

  1. Disinfettare la tabella di chirurgia e tutti gli strumenti usando alcool al 70% prima della chirurgia. Impostare gli strumenti per la chirurgia del fegato, quindi regolare la piastra riscaldante a 37 ° C (Figura 2A, B).
  2. Per l'anestesia, intraperitonealmente iniettare i topi con 30 mg/kg di tiletamina/zolazepam e 10 mg/kg di xilazina. Queste soluzioni possono essere mescolate e diluite in PBS per iniezione simultanea. Confermare amputate premendo delicatamente la punta del mouse.  Procedere passo successivo quando non c'è nessun riflesso.
  3. Applicare piccole quantità di unguento oculare per prevenire la secchezza della retina di topo.
  4. Rimuovere i peli del corpo intorno alla zona di addome usando crema depilatoria (Figura 2).
  5. Iniettare 200 µ l di soluzione di Texas-Red del dextrano (concentrazione di 2,5 mg/mL) tramite la vena caudale o retro-orbitale iniezione utilizzando una siringa da insulina (Figura 2D).
  6. Delimitare la zona di destra sottocostale con un pennarello. La linea dovrebbe essere disegnata dal processo xifoideo fino alla fine della nervatura. Tagliare l'epidermide con pinze e le forbici (Figura 2E, F).
  7. Aprire la cavità addominale con delle micro-forbici, pinze ed esporre il fegato con attenzione. Lobo laterale sinistra dovrebbe essere implementato utilizzando tamponi di cotone (Figura 2, H).
  8. Versare 500 µ l di PBS sterile sulla cavità addominale per prevenire la secchezza del fegato.
  9. Posizionare il mouse nella posizione destra-decubitus in una camera di misura e applicare una piccola quantità di colla del tessuto per il letto di silicio. Quindi, fissare con attenzione il fegato utilizzando tamponi di cotone (Figura 2I).
    Nota: Poiché il tessuto del fegato è estremamente friabile, non meccanicamente estrarre il fegato. Delicatamente stenderla con tamponi di cotone.
  10. Pochi secondi dopo, bagnare il fegato nuovo con 500 µ l di PBS sterile per evitare l'essiccamento fuori del fegato. Posizionare il telaio in metallo sul fegato e fissarlo saldamente con i dadi (Figura 2J).

5. videomicroscopia imaging del fegato con microscopia del due-fotone

  1. Eseguire software ZEN (Carl Zeiss) per accendere il laser, impostare la lunghezza d'onda 880 nm, e set verde e canali rossi. Regolare la potenza del laser secondo l'intensità di fluorescenza (Figura 3A). Informazioni sul filtro di emissione è come segue: verde/Alexa488, 500-550 nm e rosso/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Posizionare la camera sul palco imaging e posizionare il 20X obiettivo per l'immersione in acqua, vicino al vetro di copertura.
  3. Fissare il riscaldatore della gomma di silicone sotto il corpo del mouse di mantenere la temperatura del corpo (Figura 3B).
  4. Goccia di 500 µ l di acqua distillata sul telaio metallico e poi tirare la lente dell'obiettivo vicino al fegato (Figura 3).
  5. Regolare la messa a fuoco e determinare la profondità e l'ora dell'area di imaging.
  6. Formazione immagine di condotta.
  7. Per l'imaging a lungo termine, iniettare mezza dose della miscela tiletamina/zolazepam e xilazina ogni ora durante la formazione immagine. Durante questa fase è essenziale mantenere la temperatura corporea dei topi a 37 ° C. Sempre tenere d'occhio per il mouse, poiché tempo amputate differisce da ogni mouse.
    Nota: Questo metodo non è adatto per il recupero dopo chirurgia e imaging. Sacrifichiamo eticamente il mouse immediatamente dopo la chirurgia.
  8. Controllare i pedali riflessi per ogni 30 min per stabile amputate.

6. analisi dei dati

  1. Aprire il software di analisi di dati Volocity e quindi importare i dati grezzi in biblioteca nel software.
  2. Rimuovere il rumore dall'immagine per adattarsi alla situazione e uno snapshot.
    Nota: Per ottenere immagini fluide, utilizzare il filtro di 'Bene' o 'Mediana'. Inoltre, è possibile utilizzare la funzionalità di 'Aumento di contrasto' per rendere le immagini sfocate o scure più chiare.
  3. Montare gli elementi modificati al 100% e l'esportazione come file JPEG o TIFF per immagini istantanee e file AVI per i filmati.

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Risultati

Una camera semplice e molto stabile di imaging è stata ideata. Il fondo della camera era ricoperta di silicone, che ha impedito lo scivolamento del mouse corpo e organi. Inoltre, perché il silicio ha la giusta quantità di elasticità, potrebbe impedire danni attesi indotto dalla pressione della diapositiva coperchio (Figura 1A, C). Secondo, tessuto-cassaforte collante (Vet bond) è stato applicato al fine di risolvere il fegato estratto sul let...

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Discussione

Il fegato è stato studiato attivamente da molti gruppi3,10, a causa dell'importanza della sua funzione. Per esempio, Heymann et al ha suggerito un metodo delicato utilizzando dell'agarosi. Anche se questo metodo è stato trovato per essere altamente precisi, l'impostazione di agarosio richiede tempo. Tuttavia, con la nostra metodologia, tutte le procedure possono essere effettuate entro 30 min, minimizzando altri fattori di confusione. In secondo luogo, il fegato ...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dalla nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziata dal governo della Corea (MSIP; grant n. 2016R1A2B4008199 a Y-M. H.) e il Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI14C1324).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camera progettata su misuraper celle viveDimensioni progettate su misura
Vetrino di copertura in metalloper celleDimensioni progettate su misura
Vetro di coperturaMicroscopia elettronica Scienze#72204-03
Kit di elastomeri siliconici Sylgard 184Pallone Dow Corning
ErlenmeyerDURAN21 216 36
Piastra per coltura cellulare (tipo piatto)HYUNDAI Micro Co.H31006
EssiccatoreADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABPer realizzare dighe semipermanenti
Riscaldatori flessibili in gomma siliconica OmegaSERIE SRFR/SRFG, M1250/0800
Alimentatore CCToyotechDP30-03A
SoluzioneFatto in casa
Lipopolisaccaridi (LPS) da Salmonella enteria sierotipo enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Polipropilene
provetta conica ad alta trasparenza		FALCON14-959-49B
0,45 μ m filter (Filtro per siringa Minisart)Sartorius16555k
Micro provetta da 1,5 ml, ambraAxygenMCT-150-XPer siringa da 1 ml che blocca la luce
Vaccino coreanoKV-S01
Siringa da 3 mlVaccino coreanoKV-S03
Siringa da 10 mlVaccino coreanoKV-S10
Siringa da insulina da 0,3 mlBecton Dickinson324900
Crema depilatoria 100 mLBody natur
Cotton fiocABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
Piastra riscaldanteLive Cell InstrumentsPH-S-10Controllore DC su misura
Live Cell InstrumentsCU-301
Forbici per microdissezioneHarvard Apparatus72-5418
ForbiciRobozRS-5882
PinzeRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN software (Black Edition)Carl ZeissProgramma per LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
di analisiVolocityPerkinElmer
Strumenti Strumenti vive salina tamponata con fosfato Programma

Riferimenti

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
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  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
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