Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l'imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l'invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.
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Articolo metodologico
Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sepsi è un tipo di infezione grave che può causare insufficienza d'organo e tessuto danni. Anche se i tassi di mortalità e morbilità associata a sepsi trattamento estremamente alto, nessun diretto o meccanismo di organo è stato esaminato in dettaglio in tempo reale. Il fegato è l'organo chiave che gestisce le tossine e le infezioni nel corpo umano. Nel presente documento, abbiamo mirato a eseguire imaging videomicroscopia del fegato del mouse dopo induzione di endotoxemia al fine di monitorare la motilità delle cellule immuni, quali neutrofili e macrofagi del fegato capsulari (LCMs). Di conseguenza, abbiamo progettato un nuovo metodo chirurgico per l'esposizione del fegato con la chirurgia mini-invasiva. Topi sono stati iniettati intraperitonealmente con il lipopolysaccharide (LPS), un comune dell'endotossina. Utilizzando il nostro nuovo approccio chirurgico per l'esposizione e l'imaging videomicroscopia del reclutamento del mouse del fegato, che abbiamo trovato che dei neutrofili in proteina fluorescente verde-LysM LPS-trattati (GFP) mouse del fegato è stato aumentato rispetto a quello in tampone fosfato fegato di salino-trattati. Dopo il trattamento LPS, il numero dei neutrofili è aumentato significativamente con tempo. Inoltre, con successo, utilizzando topi CX3Cr1-GFP, visualizzato macrofagi residenti del fegato chiamati LCMs. Pertanto, per studiare l'efficacia di nuovi reagenti per controllare la mobilità immuni in vivo, determinare la motilità e la morfologia dei neutrofili e LCMs nel fegato possono permetterci di identificare effetto terapeutico in organo fallimento e tessuto danni causati da attivazione di leucociti nella sepsi.
Introduzione
Il fegato è l'organo metabolico principale nei mammiferi; Esso agisce come una torre di controllo per energia, ormoni e disintossicazione1. Grazie alla sua importanza, i ricercatori hanno condotto molti esperimenti in vitro e in vivo per delucidare i cambiamenti nel fegato durante l'infiammazione. La microscopia intravital è stata usata per catturare immagini in diretta dal fegato2 . Infatti, fegato vari metodi di formazione immagine sono stati introdotti2,3,4,5,
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Protocollo
Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida istituzionali Animal Care e uso Comitato di Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteina fluorescente LysM-verde (GFP; gfp / +) topi8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +) topi9 a 8-12 settimane di età sono stati usati per l'imaging di videomicroscopia. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell'autoclave e disinfettato con alcol al 70%.
1. custom-designed mouse fegato imaging camera con strumenti di supporto
- Fegato di topo imaging della camera di
- Fare un alloggiamento delle seguenti dimensioni per fega....
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Risultati
Una camera semplice e molto stabile di imaging è stata ideata. Il fondo della camera era ricoperta di silicone, che ha impedito lo scivolamento del mouse corpo e organi. Inoltre, perché il silicio ha la giusta quantità di elasticità, potrebbe impedire danni attesi indotto dalla pressione della diapositiva coperchio (Figura 1A, C). Secondo, tessuto-cassaforte collante (Vet bond) è stato applicato al fine di risolvere il fegato estratto sul let.......
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Discussione
Il fegato è stato studiato attivamente da molti gruppi3,10, a causa dell'importanza della sua funzione. Per esempio, Heymann et al ha suggerito un metodo delicato utilizzando dell'agarosi. Anche se questo metodo è stato trovato per essere altamente precisi, l'impostazione di agarosio richiede tempo. Tuttavia, con la nostra metodologia, tutte le procedure possono essere effettuate entro 30 min, minimizzando altri fattori di confusione. In secondo luogo, il fegato .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dalla nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziata dal governo della Corea (MSIP; grant n. 2016R1A2B4008199 a Y-M. H.) e il Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI14C1324).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Camera progettata su misura | per celle vive | Dimensioni progettate su misura | |
| Vetrino di copertura in metallo | per celle | Dimensioni progettate su misura | |
| Vetro di copertura | Microscopia elettronica Scienze | #72204-03 | |
| Kit di elastomeri siliconici Sylgard 184 | Pallone Dow Corning | ||
| Erlenmeyer | DURAN | 21 216 36 | |
| Piastra per coltura cellulare (tipo piatto) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Essiccatore | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | Per realizzare dighe semipermanenti | |
| Riscaldatori flessibili in gomma siliconica Omega | SERIE SRFR/SRFG, M1250/0800 | ||
| Alimentatore CC | Toyotech | DP30-03A | |
| Soluzione | Fatto in casa | ||
| Lipopolisaccaridi (LPS) da Salmonella enteria sierotipo enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL Polipropilene provetta conica ad alta trasparenza | FALCON | 14-959-49B | |
| 0,45 μ m filter (Filtro per siringa Minisart) | Sartorius | 16555k | |
| Micro provetta da 1,5 ml, ambra | Axygen | MCT-150-X | Per siringa da 1 ml che blocca la luce |
| Vaccino coreano | KV-S01 | ||
| Siringa da 3 ml | Vaccino coreano | KV-S03 | |
| Siringa da 10 ml | Vaccino coreano | KV-S10 | |
| Siringa da insulina da 0,3 ml | Becton Dickinson | 324900 | |
| Crema depilatoria 100 mL | Body natur | ||
| Cotton fioc | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Piastra riscaldante | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Controllore DC su misura |
| Live Cell Instruments | CU-301 | ||
| Forbici per microdissezione | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Forbici | Roboz | RS-5882 | |
| Pinze | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Programma per LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| di analisi | Volocity | PerkinElmer |
Riferimenti
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional co....
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Ristampe e permessi
