Quantificazione di site-specific Protein lisina acetilazione e stechiometria Succinylation usando la spettrometria totale di acquisizione dati-indipendente

Sommario

Qui, presentiamo imparziale quantificazione di occupazione acetilazione e/o succinylation site-specific protein (stechiometria) di un intero proteoma attraverso un'analisi raziometrici endogeno modifiche modifiche introdotte dopo quantitativa Acilazione chimica utilizzando anidridi con etichetta isotopo stabile. In combinazione con spettrometria di massa sensibile acquisizione dati-indipendente, sito accurata occupazione misurazioni sono ottenute.

Abstract

Modificazione post-traduzionale (PTM) di residui di lisina della proteina di_ƐN - acilazione induce cambiamenti strutturali in grado di regolare dinamicamente funzioni della proteina, per esempio, modificando l'attività enzimatica o mediando interazioni. Quantificazione precisa di occupazione acilazione della proteina site-specific, o di stechiometria, è essenziale per comprendere le conseguenze funzionali di stechiometria di basso livello globale sia individuali ad alto livello acilazione stechiometria di lisina specifico residui. Altri gruppi hanno segnalato misura della stechiometria di acetilazione di lisina confrontando il rapporto degli isotopi di precursore del peptide da endogeno, naturale abbondanza acilazione ed esogeno, pesante isotopo-labeled acilazione introdotto dopo quantitativa chimico acetilazione delle proteine usando acetica con etichetta isotopo stabile. Questo protocollo descrive un approccio ottimizzato con diversi miglioramenti, tra cui: (1) una maggiore efficienza chimica acilazione, (2) la capacità di misurare succinylation proteina oltre a acetilazione e (3) migliorata la precisione quantitativa a causa interferenze ridotte mediante quantificazione ioni frammento da acquisizioni dati-indipendente (DIA) invece di precursore dello ione segnale dall'acquisizione dati-dipendente (DDA). L'uso delle aree dei picchi estratti dagli ioni frammento per quantificazione anche in modo univoco consente la differenziazione della stechiometria di livello di sito acilazione da proteolitici peptidi contenenti più di un residuo di lisina, che non è possibile utilizzando ioni precursore segnali per la quantificazione. Visualizzazione dei dati in Skyline, un ambiente di proteomica quantitativa di open source, consente per la revisione e controllo dei dati conveniente. Insieme, questo flusso di lavoro offre imparziale, precisa e accurata quantificazione di occupazione di acetilazione e succinylation di lisina site-specific di un intero proteoma, che può rivelare e prioritizzare acilazione biologicamente rilevanti siti.

Introduzione

N_Ɛ- acilazione di residui di lisina della proteina è un importante regolatore della funzione della proteina. Acetilazione di lisina e altri acylations, come succinylation, malonylation e glutarylation, sono pensati per regolare il metabolismo, segnalazione delle cellule e altri processi cellulari^1,2,3,4 , e hanno implicazioni nei disordini metabolici⁵. Numerosi studi hanno trovato che le modifiche dell'acilico di lisina subiscono grande piega-cambiamenti in condizioni diverse in tessuti di mammiferi e cellulari linee^5,6,7,8 , nonché batteri^9,10,11, tuttavia, queste modifiche relativa piega non fornire intuizioni la proporzione delle proteine totali per volta. Gli studi che segnalano misure di occupazione del sito di acilazione rimangono scarse^12,13,14, nonostante la rilevanza e bisogno per tali studi in quanto forniscono più dettaglio relativo piega cambiano. Ad esempio, un cambiamento di 10 volte può rappresentare un aumento di occupazione del sito da 0,01 a 0,1%, 1 al 10% o persino 10 al 100%. Sono necessarie per interpretare il significato biologico di acilazione e prevedere impatto per quanto riguarda la grandezza delle proteine strutturale, stechiometria accurate misurazioni e, eventualmente, modifiche funzionali.

Un precedente metodo per quantificare il numero di persone: sito utilizza pesante dell'isotopo stabile chimica etichettatura dei residui di lisina non modificato seguite da spettrometria di massa per misurare il rapporto tra acetilazione endogeno "leggero" rispetto ai esogeno, chimicamente-labeled "pesante" acetile-lisina utilizzando precursore dello ione intensit๲. Un altro studio recente di Zhou et al. ¹³ descritto un approccio simile per valutare la stechiometria di acetilazione di lisina che anche impiegato un'acetilazione chimica completa di tutti i residui di lisina non modificato in proteine con isotopo stabile di etichettatura, ma utilizzato frammento dello ione intensità misurata dal DDA. Nakayasu et al. ¹⁴ usato un simile approccio DDA, ma invece utilizzato il rapporto di ioni immonium leggeri e pesanti acetile-lisina per quantificazione. Quantificazione basata sugli ioni frammento, immonium o sequenza ioni (MS2), nella maggior parte dei casi i risultati in meno interferenze di segnale rispetto all'elaborazione ioni precursori peptide intatto (MS1). Tuttavia, quantificazione degli ioni frammento da spettri generati dal DDA MS/MS può soffrono di carenze di campionamento stocastico, dove gli ioni di alta-abbondanza precursore sono più probabili di essere selezionato per MS/MS e quindi, portare ad un campione parziale e incompleto di ioni di precursori.

Questo romanzo del flusso di lavoro⁴ (Figura 1) utilizza concettualmente un isotopo stabile chimico etichettatura approccio sviluppato originariamente da Baeza et al. ¹², tuttavia il flusso di lavoro è successivamente accoppiato con DIA per raccogliere sia precursore e più abbondanza di ioni frammento sopra la massa rilevabile gamma^15,16 fornire calcoli accurati stechiometria.

Le aree dei picchi da frammentano ioni che contengono il sito di acilazione di interesse, o 'differenziazione degli ioni frammento', vengono utilizzati per quantificare il numero di persone: sito acilazione (Figura 2). Ioni frammento che non contengono la modifica hanno valori identici leggeri e pesanti m/z e sono utilizzati per identificazione del peptide, ma non per la quantificazione. Skyline software¹⁷ viene utilizzato per estrarre le aree dei picchi precursore e frammento. La presenza di più ioni frammento contenente un sito determinato acilazione fornisce flessibilità se le interferenze vengono rilevate in alcuni degli ioni frammento. Visualizzazione dei dati in Skyline permette per ispezione critica dei rapporti di ioni frammento di luce pesanti. Oltre alle analisi manuale dei dati, un pacchetto di R open source scritto in-House, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), è stato sviluppato, che utilizza i precursore dello ione e frammento dello ione dati raccolti attraverso DIA e quantifica site-specific acilazione stechiometria da peptidi contenenti più residui di lisina, una caratteristica non è possibile con intensità solo ione precursore misure⁴.

Questo protocollo viene illustrato anche l'utilizzo di endoproteinase Glu-C, che è specifico per la scissione del C-terminale a residui di acido aspartico e glutammico, anziché tripsina o proteasi Arg-C, come quest'ultimo spesso genera molto grande e potenzialmente moltiplicare acilato proteolitici peptidi derivanti dalla scissione di tripsina bloccati a residui di lisina acilata. Il prodotto chimico procedura di etichettatura è stato ampliato anche uso di anidride succinico (Figura 1), consentendo in tal modo la quantificazione di succinylation stechiometria succinylation. Oltre ai miglioramenti per la preparazione del campione, l'implementazione di frazionamento del peptide da pH offline, base, fase inversa (bRP) separazione dei peptidi ulteriormente diminuita interferenze di quantificazione, consentendo migliori de-convoluzione di Acilazione stechiometria nei campioni di intero proteoma. Insieme, questo metodo presenta e mette in evidenza diversi vantaggi: (1) maggiore efficienza di acilazione di chimica; (2) misurazione della stechiometria succinylation proteina oltre a acetilazione; e (3) una migliore quantificazione precisione. La quantificazione di miglioramento è dovuto le interferenze in diminuzione nei segnali di ioni frammento dal diametro di bRP rispetto al segnale precursore DDA, come pure l'attuazione del pre-frazionamento del peptide off-line.

Protocollo

1. quantitativamente acetilano Succinylate proteine utilizzando isotopo-etichetta e/o acetico o anidride succinico

1. Preparare 3 repliche di 100 µ g di campione della proteina albumina di siero bovino (BSA) in parallelo, ad una concentrazione di 1 µ g / µ l (totale di 100 µ l), utilizzando la soluzione di bicarbonato (TEAB) urea e triethylammonium (8m urea, 200mm TEAB, pH 8).
   Nota: È importante utilizzare buffer privo di ammine. I campioni di proteine utilizzati qui nella sezione risultati rappresentativi sono BSA, quantitativamente succinylated BSA, e miscele della stessa producendo BSA campioni con definite succinylation occupazione a 0%, 1%, 10%, 50% e 100%, rispettivamente (ogni campione sarà preparato in 3 replicati). Questo protocollo è stato eseguito anche utilizzando lisati di proteina da Escherichia coli e il mouse del fegato⁴. Il protocollo può essere applicato anche ad altri lisati di cellule o tessuti.
2. Ridurre 100 µ l di campione di BSA (100 µ g) con 8 µ l di 250 mM dithiothreitol (DTT) per raggiungere una concentrazione finale di 20 mM DTT e incubare il campione a 37 ° C per 30 min con agitazione a 1.400 giri/min.
3. Alchilata campione ridotto BSA con 21,6 µ l di 200mm iodoacetamide per raggiungere una concentrazione finale di 40 mM iodoacetamide e incubare il campione al buio a temperatura ambiente per 30 min.
   Nota: È importante avere la concentrazione iodoacetamide leggermente più di 2 volte della concentrazione DTT affinché tutti ridotti i tioli della proteina sono alchilati.
4. Procedere con la preparazione di anidride acetica -d₆ (punto 1.4.1) o succinico anidride acetica -d₄ (punto 1.4.2) necessari per la chimica (quantitativa) acetilazione o succinylation dei campioni.
   1. Determinare la molarità (M) dell'aliquota 1 g di anidride acetica acquoso -d₆ soluzione dal peso molecolare (108.13 g/mol) e densità (1,143 g/mL a 25 ° C).
      Nota: Il pacchetto di 1 g contiene 9.248 µmol di anidride acetica -d₆ in 875 µ l di volume, ottenendo una soluzione 10,57 M utilizzata per a-acetilazione dei campioni.
   2. Preparare una soluzione di 5 M di succinico anidride acetica -d₄ sciogliendo la polvere in DMSO anidro immediatamente prima della reazione di idrolisi del reagente di evitare. Sciogliere 0,24 g di succinico anidride acetica -d₄ nel 461 µ l di DMSO anidro per ottenere una soluzione di 5 M.
5. Eseguire acetilazione chimica quantitativa o succinylation aggiungendo rispettivamente 60 µmol di anidride acetica -d₆ (6 µ l della soluzione 10,57 M) o succinico anidride acetica -d₄ (12 µ l della soluzione 5 M) e incubare la campione a 4 ° C per 20 minuti su un Vortex.
   Nota: A causa di acidità delle anidridi, proteine possono precipitare. Prendete nota e regolare come descritto al punto 1.6.
6. Aggiungere 10 µ l di 7,25 M NaOH dopo l'incubazione per aumentare il pH a ~ 8 per eliminare eventuali prodotti secondari O-acilazione. Vortex brevemente e controllare il pH del campione di spotting e 1 µ l su carta pH.
   Nota: Potrebbe essere necessario aggiungere più di 10 µ l di 7,25 M NaOH per raggiungere pH 8. Inoltre, proteine potenzialmente precipitate dovrebbero ri-sciogliere.
7. Ripetere la procedura di regolazione per acilazione e pH 1.5 e 1.6 per un totale di tre volte. Controllare i valori di pH e annotare il volume di soluzione di base a ripetizione. Lavoro rapidamente nelle suddette chimica acilazione passi, perché le anidridi si idrolizzano e perdere reattività.
8. Dopo la regolazione d'etichettatura finale della reazione e il pH, aggiungere 10 µ l di soluzione di idrossilammina del 50% per ripristinare O-acilazione reazioni secondarie.

2. Digest ha reagito campioni proteici utilizzando Glu-C Endoproteinase

1. Diluire la concentrazione di urea a 0.8 M utilizzando 50mm TEAB, pH 8 e normalizzare il volume di campione.
2. Digerire i campioni della proteina aggiungendo endoproteinase Glu-C presso un 01:50 proteasi per rapporto di proteine substrato (w/w) e incubare i campioni durante la notte a 37 ° C con agitazione a 1.400 giri/min.
3. Acidificare e dissetare i campioni di digestione della proteina con l'aggiunta di acido formico al 1% in volume.
4. Dissalare i campioni utilizzando cartucce di estrazione in fase solida del bilancio idrofilo-lipofilo. Utilizzare una cartuccia adsorbente 30mg per materiale campione, massimo 5mg per cartuccia^4,18.
   Nota: È importante tenere l'assorbente all'interno della cartuccia bagnato durante tutto questo processo di dissalazione. Quando necessario, spegnere la pompa del vuoto per rallentare il passaggio del campione attraverso la cartuccia o solvente.
   1. Inserire le cartucce nelle porte sul collettore di aspirazione di blocco 24 porte vetro e accendere la pompa del vuoto. Lasciare porte inutilizzate innevate. Lasciare una o due porte ONU-capped per mantenere la pressione bassa il vuotometro se necessario.
   2. Bagnare ogni cartuccia due volte con 800 µ l di 80% acetonitrile (ACN)/0.2% formico acid/19.8% acqua. Garantire il livello del solvente rimane 2 – 3 mm sopra il livello del sorbente. Garantire che il vacuometro sul collettore di legge 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 in Hg).
   3. Equilibrare ogni cartuccia tre volte con 800 µ l di acido formico 0,2% in acqua. Garantire che il vacuometro sul collettore di legge 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 in Hg).
   4. Caricare i campioni del peptide per la cartuccia. Garantire il vacuometro sul collettore di legge 6,77 – 8,47 kPa (2 – 2,5 in Hg), e portata non superi 1 mL/min.
   5. Lavare ogni cartuccia tre volte con 800 µ l 0,2% acido formico in acqua. Garantire che il vacuometro sul collettore di legge 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 in Hg).
   6. Rimuovere la cartuccia dal collettore di aspirazione e stabilirsi in una microprovetta 1,5 mL.
   7. Eluire peptidi una volta con 800 µ l di acqua di 80% ACN/0.2% acid/19.8% formico e lasciare incubare con il solvente sorbente per 2 – 3 min.
   8. Utilizzare una pipetta a solvente di spingere attraverso lo strato assorbente all'interno della cartuccia. Ripetere per la seconda eluizione di 400 µ l 80% ACN/0.2% acid/19.8% formico acqua nella stessa microprovetta 1,5 mL.
5. Asciugare l'eluato mediante centrifugazione vuoto (centrifugazione tasso fissata a 268 x g), in genere per 3 h.
   Nota: Se necessario, secchi eluato campioni possono essere conservati congelati a-20 ° C fino al momento di procedere con il frazionamento.

3. frazionare peptidi usando in linea Basic-pH controfase HPLC

1. Risospendere il per-acilato e campioni di Glu-C digerito (preparati come descritto nelle sezioni 1 e 2) in 200 µ l di tampone A (Formiato di ammonio 10 mM in acqua, pH 10), mescolare il campione per 10 minuti in un miscelatore vortex a 4 ° C e centrifugare a 17.500 x g per 10 min a camera te privo.
   Nota: L'esempio di peptide risultante è pronto per essere collegato frazionato da pH elevato separazione^19,20.
2. Programma il metodo di frazionamento HPLC non in linea a seconda della strumento e software utilizzati. Il metodo seguente è specifico per un sistema di pompa HPLC binario compreso un rivelatore a doppia lunghezza d'onda UV, un autocampionatore, un collezionista di frazione e una colonna C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm granulometria) che tollera pH 10.
3. 40 frazioni ogni per 2,1 min per ogni frazione di raccogliere e combinare ogni frazione quarto, con conseguente quattro frazioni raccolte finale⁴. Un maggior numero di frazioni raccolte può essere utilizzato per ridurre ulteriormente la complessità di campione a scapito del tempo di raccolta di dati di spettrometria di massa.
4. Asciugare le frazioni raccolte in un liofilizzatori, risospendere i campioni secchi del peptide in 1 mL di acido formico di 50% ACN e 1% in acqua e trasferire in un contenitore più piccolo del campione. Essiccare il campione trasferito tramite centrifugazione vuoto (centrifugazione tasso fissata a 268 x g), in genere per 1 h.
   Nota: La bassa pressione di vapore di formiato di ammonio possono ostacolare la completa asciugatura. Se quantità significative di sale di ammonio formiato rimangono come sale precipitato dopo l'essiccazione, ripetere l'estrazione in fase solida.
5. Risospendere i campioni in 20 µ l di acido formico 0,2% in acqua con miscela standard di conservazione indicizzata tempo (iRT) del peptide.
   Nota: I campioni sono ora pronti per l'analisi mediante spettrometria di massa.

4. DIA analisi dei campioni frazionati Peptide

1. Analizzare i campioni utilizzando un metodo DIA LC-MS/MS, che può essere registrato secondo lo spettrometria di massa strumenti disponibili. L'analisi è stata eseguita utilizzando un sistema HPLC 2D nano-LC online collegato ad un spettrometro di massa quadrupole ortogonale time-of-flight (QqTOF).
   1. Programma software dello strumento in modo che miscele di peptidi vengono trasferite su un chip di pre-colonna C18 (200 µm x chip di 6mm C18-CL, 3 µm, 300 Å) e lavare a 2 µ l/min per 10 min con il solvente di caricamento (₂H O/0.1% acido formico) per la dissalazione.
   2. Separare i peptidi cromatograficamente su un chip di cm C18-CL 75 µm x 15 (3 µm, 300 Å) con una portata di 300 nL/min con un gradiente di h 2 utilizzando la tipica (e LC-sistema specifico) acquosa e solvente ACN buffer⁴.
   3. Generare un metodo DIA finestra delle variabili, dove le finestre di intervallo di massa di larghezza variabile (da 5 a 90 m/z) sono passate dal quadrupolo Q1 nella cella di collisione in passi incrementali sopra la gamma completa di massa (m/z 400-1.250).
      Nota: Il tempo di ciclo di 3.2 s include una scansione di ioni precursore di 250 ms seguita da 45 ms tempo di accumulo per ciascuno dei 64 SWATH segmenti^21,22.
2. Identificare peptidi usando un'analisi parallela dei campioni da DDA MS e costruzione delle librerie spettrali, o in alternativa, i peptidi possono essere identificati direttamente dai dati DIA utilizzando PIQED software²³, che gestisce tutte le fasi tecniche di elaborazione dei dati, identificazione e importazione in Skyline per la successiva quantificazione.

5. esempio dati analisi Tutorial

1. Scarica il software di Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) e creare un account PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).
   Nota: Per esercitazioni dettagliate che descrivono l'uso di Skyline con dati, vedere (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Altri algoritmi software possono essere utilizzati invece per estrarre le aree dei picchi ioni frammento leggeri e pesanti dalle acquisizioni DIA, come SWATH aperta²⁴, SWATH 2.0 plugin in PeakView²⁵e Spectronaut²⁶.
   1. Scaricare il file di dati di Skyline per i risultati rappresentativi succinylated BSA (Figura 3) da Panorama pubblica: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Nella pagina Web di Panorama, andare alla tabella "Mirate MS Runs" e scaricare il file sky.zip scegliendo il collegamento DOWNLOAD sul lato destro. Estrarre la cartella. zip scaricato e fare doppio clic sul file per aprirlo in Skyline skyline.sky. Controllare la struttura di destinazione agli ioni frammento del peptide (pannello di sinistra) e i quattro cromatogrammi da percentuali definite di luce succinylation (pannelli di destra).
   2. Selezionare dal menu "Visualizza", andare su "le aree dei picchi | Replicare il confronto". Sul lato destro della finestra verrà visualizzato il pannello di "Peak zone – replicare confronto" contenenti grafici a barre. Nel pannello le aree dei picchi, pulsante destro del mouse e selezionare "transizioni | Singolo", che mostra l'area di picco di ioni frammento per lo ione frammento selezionato. Infine, il pulsante destro del mouse nel pannello "Le aree dei picchi" e selezionare "ordine | Documento".
   3. Nel pannello di albero di destinazione sul lato sinistro della finestra, fare clic destro sul peptide "E.LCKVASLRE. T | Rapporti a | Oneheavy", che calcola il rapporto tra ioni leggeri segnale sul segnale di ioni pesanti, leggero/pesante.
      Nota: Questo non è lo stesso rapporto di stechiometria sito occupazione di Light/(Heavy+Light).
   4. Si noti che la struttura di destinazione ora riporta i rapporti L/H a destra degli ioni frammento di luce.
2. Determinare la "differenziazione frammenti ionici" che contengono il sito di acilazione di interesse.
   Nota: Come mostrato nella Figura 3, con questo esempio esatto, gli ioni di differenziazione sono stati determinati come y₇ (più votate), y₈, b₃e b₄. Si noti che gli ioni frammento non-differenziante mostrano un rapporto di 1 nella struttura di destinazione.
   1. Nella struttura di destinazione pannello di sinistra, sotto il 588.30 + + nodo secondario del peptide E.LCKVASLRE. T, cliccare sul y7 differenziando ioni frammento
      K [y₇ ] – 902.49 + (rank1) [5]
      Si noti la crescente altezza di picco e la zona.
   2. Nella struttura di destinazione pannello di sinistra, sotto il 588.30 + + nodo secondario del peptide E.LCKVASLRE. T, fare clic su₅ y non-differenziante agli ioni frammento un [y₅ ] – 575.31 + (rank 6) [1]. Osservare che la y₅ frammento dello ione cromatogrammi e aree dei picchi rimangono nella stessa gamma per tutti i campioni.
   3. Nel pannello di albero di destinazione, sfogliare altri differenziazione (rapporto diverso da 1) e non-differenziazione (rapporto 1) frammento ioni e notare i cambiamenti e le evoluzioni nel picco bar grafico e cromatogrammi.
   4. Determinare le aree di picco esatta per le coppie di leggeri e pesanti degli ioni differenziazione per calcolare la stechiometria (per ulteriori dettagli vedi anche Meyer et al. ⁴). fare clic sulla "vista | Griglia del documento"e la griglia del documento si aprirà. In alto a sinistra della griglia del documento, fare clic su "vista | Risultati di transizione"per vedere una tabella di multi-colonna con informazioni di ioni frammento, come sequenza del Peptide, precursore mz, nome di replicare, ecc.
   5. Modificare il formato del report di "ruotare" nuovamente cliccando su "Visualizzazioni" nella griglia documento e selezionando "Modifica visualizzazione" per aprire la finestra Personalizza visualizzazione. In basso a sinistra della finestra "Personalizza visualizzazione", controllare il "nome di replicare Pivot" e selezionare "Ok" per chiudere la finestra Personalizza visualizzazione. Osservare che ora la finestra della tabella "Documento griglia: transizione risultati" ha ri-arrangiati raggruppare il nome replicare, tempo di ritenzione, Area, Background, colonne di vetta classifica da replicare (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
   6. Per il peptide "E.LCKVASLRE. T"nella tabella"Documento griglia: transizione risultato", trovare la colonna"Precursore Mz", la colonna"Ioni frammento"e la colonna di 1pct_light_sw1 zona (1% succinylation). Osservare che ci sono ioni di due precursori per questo peptide, luce (precursore Mz di 588.30 nelle prime 8 righe) e pesanti (precursore Mz di 590.32 nelle ultime 8 righe).
   7. Nella colonna "Ioni frammento", è possibile trovare le due righe per lo ione del frammento y8 corrispondente per la luce e gli ioni pesanti precursore. Dalle stesse righe nella colonna Area 1pct_light_sw1, registrare le aree y8 per la luce (15.820) e pesante (1.426.461).
3. Utilizzando questi valori di area di picco, calcolare la stechiometria succinylation, o la proporzione modificati, secondo la seguente formula e ottenere un rapporto di stechiometria di 0,01, o 1% succinylation, cui corrisponde la percentuale di luce succinylation in questo definito miscela:
   
4. Calcolare il rapporto di stechiometria per 10% succinylation utilizzando i valori di zona y8 picco di ioni frammento differenziazione dalla colonna di zona di 10pct_light_sw1, 144.953 (luce) e 1.188.041 (pesante), per ottenere un rapporto di 0,10, o 10% succinylation.
5. Calcolare il rapporto di stechiometria per succinylation 100% utilizzando i valori di zona y8 picco di ioni frammento differenziazione dalla colonna di zona di 100pct_light_sw1, 954.513 (luce) e 16.407 (pesante), per ottenere un rapporto di 0,98, o 98% succinylation.
6. Allo stesso modo, calcolare il rapporto di stechiometria per 1% succinylation utilizzando i valori di zona b3 picco di ioni frammento differenziazione dalla colonna di zona di 1pct_light_sw1, 55.697 (luce) e 3.149.119 (pesante), per ottenere un rapporto di 0,01, o 1% succinylation.
7. Continuare a usando la formula per tutti gli ioni frammento differenziazione, i calcoli del rapporto stechiometria ioni sia y e b, per ottenere il succinylation di lisina stechiometria valori per miscele succinylation 1, 10, 50 e 100%.

Risultati

Dopo l'acquisizione di dati, differenziazione MS2 frammenti ionici sono stati determinati con i peptidi proteolitici acilato, successivamente estratti ioni cromatogrammi (XIC) sono state trasformate in Skyline e la luce corrispondente e le aree dei picchi pesanti sono state esportate che erano infine utilizzato per calcolare l'occupazione del sito. La Figura 2A Mostra un illustrazione concettuale di come il precursore-ione XIC può apparire con entrambi i segnali del peptide leggeri e pesanti, e Figura 2B presenta un esempio di frammento corrispondente ione XICs con codifica a colori (rosso = luce; blu = pesante ) per la differenziazione degli ioni frammento contenente le modifiche di acilazione di lisina.

La figura 3 Mostra i dati risultanti da un esperimento di occupazione, come descritto in precedenza analizzando i rapporti pre-definiti di leggero/pesante succinylated BSA generato internamente alle 1, 10, 50, o 100% e la determinazione di succinylation occupazione dello stesso. Importazione di dati di occupazione DIA in Skyline consente una visualizzazione semplice della struttura di destinazione, visualizzazione di sequenze peptidiche e ioni frammentati per gli ioni leggeri e pesanti precursore (Figura 3A). Dati da DIA-MS di ogni rapporto definito succinylated BSA immanently ha rivelato le differenze relative di rapporto dello ione di luce pesanti y₇ , lo ione di frammento differenziazione più alto in classifica dal match identificati peptide-spettri (indicato in rosso, Figura 3B). La figura 4 Mostra una panoramica dei risultati elaborati dal calcolo occupazione MS2 che ha confermato l'occupazione di percentuali di succinylation della proteina input, qui composto da BSA pre-succinylated. Lisina misurato succinylation occupazione per 20 succinylated proteolitici peptidi ottenuti da BSA commerciale pre-succinylated, succinylated alle percentuali definite (ad es., a 0, 1, 10, 50 e 100%) sono riportati nella tabella 2. Per ciascuno dei 20 peptidi proteolitici BSA, ordinati per il più alto, differenziando MS2 ioni frammento è stato utilizzato per calcolare l'occupazione di succinylation (Ksucc) di lisina, come L/(L+H) in %. Nel complesso, la quantificazione di MS2-basato ha mostrato molto buona precisione nella determinazione di acilazione occupazione anche a basso stoichiometries.

Figura 1: flusso di lavoro stechiometria. (A) proteine vengono incubati tre volte con anidride acetica -d₆ a acetilano residui di lisina non modificato. Successiva, acetilate proteine vengono digerite con endoproteinase Glu-C, seguito da frazionamento di HPLC dei peptidi proteolitici mediante cromatografia fase inversa basic-pH. Infine, i peptidi sono analizzati mediante LC-MS utilizzando DIA con larghezze finestra variabile precursore. (B), il flusso di lavoro stesso è utilizzato per determinare la stechiometria succinylation come descritto in (A), tranne il reagente di acilazione pesante viene modificata in succinica anidride acetica -d₄. Figura adattata da Meyer et al. ⁴ (J. em. Soc. Mass Spectrom., scelta aperta). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: esempio di possibili dati ottenuti e calcoli di stechiometria. (A) luce (L) e (H) MS1 precursore degli ioni pesanti contenente una lisina acetilato differiscono da 3 unità di massa. XICs vengono generati per buste isotopiche leggeri e pesanti, indicati in rosso e blu, rispettivamente. (B) quantificazione da MS2 ioni frammento XICs da acquisizioni DIA possono essere eseguito utilizzando 'differenziazione' ioni frammento leggeri e pesanti che contengono il sito di acetilazione indicato in rosso e blu. Gli ioni frammento comuni vengono visualizzati in nero punteggiato e non contengono il sito di modifica. Figura adattata da Meyer et al. ⁴ (J. em. Soc. Mass Spectrom., scelta aperta). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: visualizzazione di Skyline del peptide di BSA proteolitico succinylated a livelli di occupazione diversi. (A) struttura di destinazione Skyline mostrando il peptide proteolitico LCKsuccVASLRE e la sua conseguente frammentazione degli ioni. (B) Skyline estratte cromatogrammi ioni frammento a diversi livelli di occupazione succinylation. Il più alto in classifica su differenziazione ion, y₇, aumenta nell'area di picco 1, 10, 50 e 100% correlazione alla percentuale di input di pre-succinylated BSA (generata internamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: valutazione stechiometria di acilazione di BSA BSA pre-succinylated. Cinque campioni diversi di BSA alle percentuali definite di modificazione pesanti (ad es., a 0, 1, 10, 50 e 100%) sono stati sottoposti alla determinazione di occupazione MS2. Occupazione del sito per 20 peptidi di BSA succinylated sono stati determinati con i più alto in classifica su differenziazione frammenti ionici per cinque diversi campioni di BSA alle percentuali definite di luce modifica (ad esempio, a 0, 1, 10, 50 e 100%). La trama di Box Whisker consente di visualizzare la distribuzione dei peptidi succinil 20, valori da 50% di peptidi sono nella finestra' ' (25% percentile 75% percentile), il baffo superiore indica i valori da 75% percentile al massimo (100%) e il Baffo inferiore indica i valori da 25% percentile al minimo (0% percentile). (J. em. Soc. Mass Spectrom., scelta aperta). Quantificazione delle misurazioni può essere trovato nella tabella 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempo (minuti)	% A	% B
0.00	100	0
7,27	92	8
45,27	73	27
49.27	69	31
65,27	61	39
72,27	40	60
80.00	10	90
85.00	10	90
86.00	100	0
120.00	100	0
Portata: 0,7 mL/min
Tampone a: formiato di ammonio 10 mM in acqua, pH 10
Tampone b: formiato di ammonio 10 mM in acqua ACN e 10% di 90%, pH 10
Nota: Il pH di entrambe le fasi mobili regolato a 10 con ammoniaca ordinata

Tabella 1: gradiente per offline frazionamento di HPLC controfase basic-pH. Lunghezza gradiente: formiato di ammonio 120 min Buffer a: 10 mM in acqua, pH 10. Tampone b: formiato di ammonio 10 mM in acqua ACN e 10% di 90%, pH 10.

L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0.2	1.7	11.1	50,9	99.2
1.2	2.3	12.3	49,4	97,6
2.9	3.8	14	48,6	99.5
0,5	1.8	11,7	50,8	99.5
0.2	1.7	11.1	48,3	98,2
0.2	1.2	11	47,5	96,1
0.3	1.6	12,8	51	99.2
3.7	5.2	14,7	51,9	89,5
1.5	1.8	12.5	47,2	91,1
0,8	1.5	11.3	48,4	96,8
0.2	1.6	13,9	49,7	98,9
0.1	1.1	10.7	48,2	98,6
0.2	0.9	10.3	49,4	99,4
0,5	2.5	17,2	52,3	97,5
0.1	3.5	20,8	51	99
0.3	1.9	10.7	49,6	98,2
2	1.7	10,9	47,7	96,3
0.3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12,9	57,9	94,1
0.2	1.4	11.6	48,6	98,8

Tabella 2: quantificazione di misurata occupazione succinylation di lisina di BSA per 20 peptidi proteolitici succinylated. Succinylated peptidi ottenuti da BSA commerciale pre-succinylated, succinylated alle percentuali definite (ad es., a 0, 1, 10, 50 e 100%). Per ciascuno dei 20 peptidi proteolitici BSA, ordinati per il più alto, differenziando MS2 ioni frammento è stato utilizzato per calcolare l'occupazione di succinylation (Ksucc) di lisina, come L/(L+H) in %.

Discussione

Questo protocollo fornisce un romanzo e un metodo preciso per quantificare la lisina site-specific acetilazione e occupazione succinylation che può essere applicato a un intero proteoma. Questo metodo si basa sulla misurazione dei peptidi luce endogeni ed esogeni peptidi pesante, il posteriore di quale sono generati in vitro usando acilazione di chimica quantitativa delle proteine con anidride acetica deuterati -d₆ o succinico anidride acetica -d₄ (Figura 1). Metodi simili hanno usato etichettatura isotopica stabile dei residui di lisina non modificato nativo ed eseguita quantificazione di occupazione di sito basato su entrambi ioni-solo¹² o un frammento di ioni precursori da DDA acquisizioni^13,14. Questo protocollo applica diversi passaggi durante la preparazione del campione per migliorare l'efficienza di acilazione ed estende l'etichettatura chimica a succinylation. Raccolta dati mediante acquisizioni DIA ottiene sia dello ione precursore e MS2 frammento intensità dello ione sopra l'intera gamma di massa rilevabile, riducendo le interferenze di ioni frammento. Analisi e quantificazione tramite script personalizzati sviluppati internamente e Skyline permettono il calcolo di occupazione del sito per peptidi contenenti più di un residuo di lisina e più acilazione presso un unico sito.

Ci sono diversi passaggi critici durante la fase di preparazione del campione del presente protocollo che deve essere seguito attentamente. Poiché l'intero protocollo si basa su efficiente modificazione chimica di tutti i residui di lisina, questo passaggio è della massima importanza. Anidridi reagiscono con ammine gratis, quindi contenenti molecole buffer o contaminante nel lisato proteico devono essere evitati. Anche durante la fase di chimica per acilazione, assicurarsi che il pH della miscela di reazione è regolato indietro a pH 8 dopo ciascuna delle tre incubazioni con reagente anidride acetica come questa reazione acidifica la miscela e reazioni secondarie O-acilazione possono formare. Inoltre, diluizione 8m contenenti urea miscela di reazione di circa 0,8 M urea prima della digestione e controllando che il pH è compreso nell'intervallo ottima è importante per l'attività ottima di endoproteinase Glu-C. Un altro componente chiave del nostro protocollo è la fase di raccolta dati e l'introduzione di un flusso di lavoro DIA, che supera qualsiasi incoerenza di campionamento dei dati DDA e che permette per la quantificazione a livello di ioni frammento MS2. Uno dei principale vantaggi della metodologia DIA è la diminuzione delle interferenze che in genere sono molto più inclini e problematico nel quantificare il segnale di ione precursore MS1 (come alcune delle pubblicazioni precedenti hanno suggerito).

Diverse modifiche al flusso di lavoro possono essere fatto durante la preparazione di campioni altamente complessi. Il numero delle frazioni riunite dopo il frazionamento di HPLC di controfase basic-pH in linea può essere ridotto per ridurre la complessità del pool di campioni che saranno acquisiti da LC/MS. inoltre, più le sfumature cromatografica può anche essere usato durante acquisizione per consentire per la separazione migliore del peptide. In alternativa, più proteasi possono essere usate per digerire i campioni per produrre una grande varietà di peptidi spaccati e aumentare la copertura dei residui di lisina della proteina. Periodo di prova dura e ottimizzazione può essere condotta usando BSA commerciale contenente specifiche percentuali di acetilazione o succinylation.

Una limitazione al presente protocollo è sopravvalutazione di occupazione sito potenzialmente lieve dovuto dispersi altre modifiche di lisina, come la metilazione o ubiquitinazione, ecc., allo stesso sito⁴. Calcolato dalle aree dei picchi delle modifiche acil leggeri e pesanti, L/(L+H), l'occupazione del sito è basata sul presupposto che il livello totale di modifica in un sito di lisina è costituito da solo endogeno 'luce' acilazione (L) e chimicamente con l'etichetta «pesante» Acilazione (H). Tuttavia, la capienza effettiva totale acilazione presso un sito in vivo può includere altre modifiche di là di acetilazione e/o succinylation. Inoltre, la purezza isotopica segnalata dei reagenti acquistati anidride acetica -d₆ (99%) e succinico anidride acetica -d₄ (> 98%) può contribuire a una sovrastima piccola di fino a 2% (succinil) o 1% (acetile) della Acilazione endogeno di livello⁴. Insieme, questi lievi overestimations aggiungere la difficoltà nel quantificare siti con meno di 1% occupazione. Differenze di grande abbondanza tra la completa chimicamente acilato peptidi e i peptidi nativi acilato anche contribuiscono a potenziali errori di quantificazione occupazione sito, soprattutto per basso acilato endogeno peptidi²⁷. Un recente studio di Weinert et al. ²⁷ trovato che abbondanza in diminuzione differenze tra peptidi a-acetilato complete possono ridurre l' errore di quantificazione²⁷.

Quantificazioni di stechiometria raccolte utilizzando questo protocollo possono individuare importanti acilazione hotspot in una particolare ipotesi di proteina e modulo per esperimenti biologici follow-up, ad esempio di mutagenesi sito-diretta di alcuni siti di interesse. Questo protocollo potrebbe anche rivelare effetti combinati dei siti di stechiometria di acilazione basso che potrebbero esercitare influenze indirette o sottile sulla stabilità strutturale della proteina e localizzata ambienti cellulari. Inoltre, questo protocollo di misura acetilazione e succinylation e altre modifiche di acilazione di lisina possibile di là di acetilazione in modo univoco offrirebbe intuizioni gli effetti dinamici acilazione sulle proteine sotto diversi condizioni biologiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acquosa acetica-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G	1% di purezza isotopica
anidride succinica-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	della purezza isotopica al 2%
Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, USA (tramite Sigma)	10791156001	rapporto proteasi/proteine substrato 1:50 (wt:wt)
Cartucce per estrazione in fase solida (SPE) Oasis HLB	Waters Corp., Milford, MA, USA	094225 HPLC
acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH015-4
Acqua di grado HPLC	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH365-4
iodoacetamide	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
ditiotreitolo (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
FLUKA acido formico (FA) per spettrometria di massa	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	C988C27	~98%
urea	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
albumina sierica bovina (BSA)	Pierce, Rockford, IL, USA	88341
bicarbonato di trietilammonio (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408-100ML
dimetil solfossido anidro (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	43998
idrossido di sodio (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, USA	SX0590
Soluzione di idrossilammina al 50% in acqua	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
Acqua di grado LC-MS	Burdick e Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC365-4
LC-MS acetonitrile	Burdick e Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentratore	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Sistema di pompaggio HPLC binario Waters 1525	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Rivelatore UV a doppia lunghezza d'onda	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autocampionatore	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878
Colonna Agilent Zorbax 300Extend C18	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Labconco Sistema di liofilizzazione Freezone 4.5 Liofilizzatore	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
Standard di normalizzazione del peptide di normalizzazione del tempo di ritenzione indicizzato (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurigo, Svizzera	Ki-3002-2
Sistema HPLC Ultra Plus nano-LC 2D	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	modello # 845
quadrupolo ortogonale time-of-flight (QqTOF) Spettrometro di massa TripleTOF 5600	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per preventivo
quadrupolo ortogonale tempo di volo (QqTOF) Spettrometro di massa TripleTOF 6600	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per preventivo
Chip pre-colonna C18 (200 μ m &volte; Chip ChromXP C18-CL da 6 mm, 3 μ m, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
SWATH 2.0 plugin in PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	download del software Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurigo, Svizzera	Sw-3001
C18-CL chip (75 µ m x 15 cm ChromXP, 3 &; m, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, Stati Uniti	804-00001