La precisa identificazione delle cellule satelliti è essenziale per lo studio delle loro funzioni in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Questo articolo presenta un protocollo per identificare cellule satelliti su sezioni del muscolo scheletrico adulto tramite basati su immunofluorescenza colorazione.
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Articolo metodologico
Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunofluorescenza è un metodo efficace che aiuta a identificare i diversi tipi di cellule su sezioni di tessuto. Al fine di studiare la popolazione di cella desiderata, anticorpi per gli indicatori delle cellule specifiche vengono applicati su sezioni di tessuto. Nel muscolo scheletrico adulto, le cellule satellite (SC) sono cellule staminali che contribuiscono alla rigenerazione e riparazione del muscolo. Pertanto, è importante visualizzare e tracciare la popolazione delle cellule satelliti in diverse condizioni fisiologiche. Nel muscolo scheletrico di riposo, SCs risiedono tra la lamina basale e la membrana plasmatica miofibre. Un indicatore comunemente usato per l'identificazione SCs i myofibers o nella coltura delle cellule è la proteina accoppiati casella Pax7. In questo articolo, è presentato un protocollo ottimizzato di Pax7 immunofluorescenza su sezioni del muscolo scheletrico che minimizza la colorazione aspecifica e sfondo. Un altro anticorpo che riconosce una proteina (laminina) della lamina basale è stato anche aggiunto per identificare i protocolli SCs. simile può essere utilizzato anche per eseguire doppio o triplo etichettatura con Pax7 e anticorpi per ulteriori proteine di interesse.
Introduzione
Muscolo scheletrico è composto di cellule multinucleate muscolo, chiamato miotubi, organizzato nelle miofibre, che generano la forza e i movimenti attraverso la contrazione. Più i muscoli scheletrici, ad eccezione di alcuni muscoli cranio-facciali, sono derivati da una struttura embrionale temporanea denominata un somite1. Le cellule del precursore miogenico delaminare dal somite epiteliali diventare mioblasti. Mioblasti ulteriormente differenziano in miociti che si fondono per diventare miotubi per formare multi-nucleate miofibre. Il processo di cui sopra è chiamato miogenesi ed è caratterizzato da temporaneamente-ha regolato il controllo dell....
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Protocollo
In questo protocollo, i muscoli dell'arto anteriore di topi adulti (2-6 mesi), tibiale anteriore (TA) e longus di digitorum dell'estensore (EDL), sono stati impiegati ad esempio per eseguire l'immunofluorescenza che macchia il loro SCs. Tutte le fasi di movimentazione topi e muscolo dissezioni di tessuto sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di NIAMS/NIH.
1. sezionare il muscolo TA/EDL dal Mouse dell'arto
- Eutanasia il mouse in una camera di eutanasia riempito CO2 nell'ambito degli orientamenti di ACUC del NIH. Eseguire, dislocazione cervicale se necessario.
- Mettere il mouse a facc....
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Risultati
Seguendo i passi sopra, SCs possono essere visualizzati correttamente in adulto sezioni muscolari che riposa sotto un microscopio a fluorescenza (Figura 1). Anche se il tessuto di muscolo adulto ha una forte auto-fluorescenza in certo tipo di fibre, i coloranti di serie di Alexa luminosi in grado di superare il rumore di fondo e il segnale si distingue (Figura 1A, B; teste di freccia). La microscopia confocale de.......
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Discussione
Il protocollo di cui sopra è stato basato su un metodo di macchiatura Pax7/MF20 su zebrafish muscolo scheletrico12. Le soluzioni utilizzate e bloccando i passaggi sono identici o simili. Gli anticorpi utilizzati sono identici. I passaggi regolati erano basati sulle caratteristiche del tessuto muscolare del mouse e SCs. In primo luogo, laminina anticorpo è stato aggiunto nel mix per aiutare a visualizzare e confermare la posizione di SCs. E ' stato particolarmente utile contare il numero di SCs al .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la sezione Imaging luce NIAMS per fornire i microscopi e aiuto tecnico. Gli anticorpi MF20 e Pax7 sono stati ottenuti da Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto l'egida del NICHD e mantenuto dal dipartimento di scienze biologiche, The University of Iowa, Iowa City. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale di NIAMS del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| metilbutano | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Temperatura di taglio ottimale (OCT) composto | Microscopia elettronica Scienze | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Siero di capra normale | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment IgG anti-topo di capra (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x tampone citrato | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 anticorpo monoclonale di topo (IgG1) (surnatante) | Studio sullo sviluppo Hybridoma Bank | N/A Laminin | |
| anticorpo policlonale di coniglio | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 anticorpo monoclonale di topo (IgG2b) (surnatante) | Studio sullo sviluppo Ibridoma Bank | N/A | |
| Anticorpo secondario ad assorbimento incrociato anti-IgG1 di capra, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Anticorpo secondario ad assorbimento incrociato anti-topo di capra IgG2b, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Anticorpo secondario altamente adsorbito di capra anti-coniglio IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Criostato Leica CM1860 Microscopio | |||
| fluorescente a campo largo Leica DM6000 | |||
| fluorescente a campo largo Leica DMR | |||
| Microscopio confocale Zeiss LSM510 Microscopio | |||
| confocale Zeiss LSM780 | |||
| Pentola | a pressione elettronica Cuisinart |
Riferimenti
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell D....
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Ristampe e permessi
