Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Joshua T. Maxwell; Chin-Hsien Tsai; Tahmina A. Mohiuddin; Jennifer Q. Kwong

doi:10.3791/57225

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Articolo metodologico

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

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DOI:

10.3791/57225

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27 aprile 2018

Joshua T. Maxwell¹ , Chin-Hsien Tsai¹ , Tahmina A. Mohiuddin² , Jennifer Q. Kwong¹

¹Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, ²Emory College of Arts and Sciences, Emory University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca^{2 +} mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca^{2 +} importazione analisi usando il Ca^{2 +} sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca^{2 +} colorante Rhod-2/AM.

Abstract

CA^{2 +} gestione dai mitocondri è una funzione critica che regolano processi sia fisiologici e fisiopatologici in un ampio spettro di cellule. La capacità di misurare con precisione l'afflusso e l'efflusso di Ca^{2 +} dai mitocondri è importante per determinare il ruolo di mitocondriale Ca^{2 +} gestione in questi processi. In questo rapporto, presentiamo due metodi per la misura di mitocondriale Ca^{2 +} gestione in mitocondri isolati sia in cellule coltivate. Dettagliamo in primo luogo una piattaforma di basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando il Ca^{2 +} colorante sensibile del calcio verde-5N. Il formato basato su lettore di piastra elude la necessità di attrezzature specializzate, e la tintura di calcio verde-5N è adatta idealmente per misura Ca^{2 +} dai mitocondri del tessuto isolato. Per la nostra applicazione, descriviamo la misurazione del mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in mitocondri isolati dal tessuto del cuore del mouse; Tuttavia, questa procedura può essere applicata per misurare mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in mitocondri isolati da altri tessuti quali fegato, muscolo scheletrico e cervello. In secondo luogo, descriviamo un saggio basato su microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca^{2 +} in celle permeabilized utilizzando il Ca^{2 +} sensibile colorante Rhod-2/AM e imaging utilizzando la microscopia a scansione laser 2-dimensionale. Questo protocollo di permeabilizzazione Elimina la contaminazione di tintura citosolico, consentendo la registrazione specifica di cambiamenti in mitocondriale Ca^{2 +}. Inoltre, microscopia a scansione laser permette un'alta frequenza di catturare rapidi cambiamenti di mitocondriale Ca^{2 +} in risposta a diversi farmaci o reagenti applicati nella soluzione esterna. Questo protocollo può essere applicato per misurare mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in molti tipi cellulari tra cui cellule primarie quali miociti cardiaci e neuroni e linee cellulari immortalizzate.

Introduzione

I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca^{2 +} deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca^{2 +} ¹^,². Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti di^{Ca 2 +} storage. CA^{2 +} presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l'attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza³. Per la regolazione metabolica, Ca^{2 +} migliora l'attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell'acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale⁴^,⁵. Con sovraccarico mitocondriale di Ca^{2 +} e dysregulated mitocondriale Ca^{2 +} movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca^{2 +} trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Così, mitocondriale di Ca^{2 +} segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.

Negli ultimi anni, c'è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca^{2 +} dinamica dovuta in gran parte per l'identificazione dei costituenti molecolari del Ca^{2 +} uniporter mitocondriale complesso, un'interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca^{2 +} importare nella matrice mitocondriale ¹⁰^,¹¹^,¹². Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca^{2 +} mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell'uniporter complesso e mitocondriale Ca^{2 +} afflusso a malattia¹³^,¹⁴^,¹⁵. Infatti, Ca^{2 +} segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^, ¹⁹^,²⁰.

Data l'importanza fondamentale di mitocondriale Ca^{2 +} segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca^{2 +} segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca^{2 +}afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca^{2 +} . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca^{2 +}-coloranti sensibili²¹^,²² e geneticamente codificato Ca^{2 +} sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina²³^, ²⁴. L'obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca^{2 +} l'assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca^{2 +} afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando il Ca^{2 +} sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato¹⁴. Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca^{2 +} in celle permeabilized utilizzando il Ca^{2 +} sensibile colorante Rhod-2/AM²⁵.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Emory University.

Nota: La prima parte è la procedura sperimentale per la misura di afflusso Ca^{2 +} mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati utilizzando un lettore di piastra.

1. reagenti e soluzioni

Fare 500 mL di tampone di MS-EGTA per isolamento mitocondriale: 225 mM mannitolo, saccarosio di 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 1 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), pH regolato a 7,4 con KOH. Sterilizzarlo attraverso un filtro di 0,22 μm e conservarla a 4 ° C. Assicurarsi che il buffer di MS-EGTA è pre-refrigerato a 4 ° C prima dell'uso.
Preparare 100 mL di tampone di KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH₂PO₄, 2mm MgCl₂, 40 μM EGTA e pH regolato a 7,2 con KOH. Conservare a temperatura ambiente.
Preparare calcio 1 mM verde-5N stock in dimetilsolfossido (DMSO). Lo stock di verde-5N di calcio può essere aliquotato e conservato a-20 ° C.
Preparare substrati per Ca^{2 +} l'assorbimento.
1. Preparare il piruvato di sodio 1 M, pH 7,4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.
2. Preparare malate di 500 mM, pH 7.4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.

2. isolamento dei mitocondri cardiaci

Eutanasia il mouse secondo le norme istituzionali.
Nota: Per il nostro metodo approvato dall'istituzione dell'eutanasia, topi erano anestetizzati per inalazione isofluorano e sacrificati dalla dislocazione cervicale.
Raccogliere il cuore di cavità toracica di apertura, taglio lungo entrambi i lati delle nervature, che fiancheggiano il cuore, tagliando via il diaframma e asportando il tessuto del cuore.
Nota: In questo protocollo, isolamento mitocondriale viene eseguita da un cuore intero raccolto da un topo adulto (circa 120 mg), che dovrebbe essere sufficiente per 3-4 esperimenti. Per l'isolamento mitocondriale da altri tessuti ricchi di mitocondri quali il fegato, fino a 200 mg di tessuto può essere utilizzato seguendo il protocollo descritto.
Sciacquare il tessuto accuratamente in 25 mL di gelida 1x tamponato fosfato salino (PBS) assicurando che tutto il sangue viene spremuto fuori i ventricoli.
Nota: Il cuore viene risciacquato sufficientemente quando il liquido spremuto fuori dal cuore esce pulito.
Tritare il cuore in piccoli pezzi in 5 mL di PBS 1X ghiacciata usando un paio di forbici affilate.
Scartare il PBS e trasferimento di tessuto cardiaco macinate in un omogeneizzatore di lisata pre-refrigerati 7 mL vetro-teflon con una clearance di 0,10 a 0,15 mm.
Aggiungere 5 mL di buffer di MS-EGTA ghiacciata e omogeneizzare il campione fino a pezzi di tessuto non sono più visibili (circa 11 colpi).
Nota: Non over-omogeneizzare il tessuto come l'obiettivo è quello di ottenere i mitocondri intatti e funzionali.
Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 mL.
Centrifugare l'omogeneizzato a 600 x g a 4 ° C per 5 min a pellet di nuclei e cellule ininterrotte.
Trasferire il surnatante in una provetta di fresco da 15 mL e centrifugare esso a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min a pellet mitocondri.
Scartare il surnatante e tenere il pellet mitocondriale sul ghiaccio.
Lavare la pallina mitocondriale utilizzando due volte ghiacciata MS-EGTA buffer. Per ogni lavaggio, risospendere il pellet mitocondriale in 5 mL di buffer di MS-EGTA, centrifugare e a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min e scartare il surnatante.
Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere i mitocondri in 100 μL di tampone di MS-EGTA freddo di ghiaccio. Tenere i mitocondri sul ghiaccio.
Nota: I mitocondri devono essere utilizzati per la sperimentazione entro 1 h.
Misurare la concentrazione di proteina mitocondriale utilizzando un' analisi della proteina di Bradford²⁶.

3. piastra lettore-basato di misurazione dell'assorbimento del calcio mitocondriale

Nota: Qui è descritto il protocollo per l'analisi mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando un lettore di piastra multimodo dotato di iniettori. Qualsiasi piatto lettore con la capacità di lettura di fluorescenza verde-5N calcio (eccitazione/emissione di 506/532 nm) in modalità cinetica con reagente automatizzato possono essere utilizzati iniettori per mantenere la reazione al riparo dalla luce.

Programma lettore della piastra per eseguire una cinetica leggere di fluorescenza verde-5N calcio con misurazioni effettuate ogni secondo per un tempo di dosaggio totale di 1.000 s. Inoltre, programmare gli iniettori di reagente a dispensare 5 μL di soluzione di CaCl₂ ore 30 s, 150 s, 300 s , 480 s e 690 punti di tempo s.
Nota: I tempi di CaCl₂ iniezioni sono definiti dall'utente e possono essere adattate per esigenze sperimentali.
Adescare gli iniettori di reagente con la soluzione di CaCl₂ deve essere utilizzato.
Nota: La concentrazione della soluzione CaCl₂ è definito dall'utente e può essere registrata in esecuzioni successive a titolare la quantità di Ca^{2 +} per attivare MPTP apertura necessaria.
Aggiungere 200 μg di mitocondri in un individuale pozzetto di una piastra ben 96.
Aggiungere il volume appropriato di buffer di KCl tale che il volume totale dei mitocondri e buffer di KCl nasce a 197 μL.
Aggiungere 1 μL di piruvato di 1 M e 1 μL di malate di 500 mM per la miscela di mitocondri. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare i mitocondri con i substrati per 2 min a temperatura ambiente per consentire i mitocondri diventare stimolato.
Aggiungere 1 μL di stock di 1mm del calcio verde-5N. Mescolare delicatamente pipettando.
Nota: Proteggere la reazione dalla luce dopo l'aggiunta del colorante verde-5N calcio.
Avviare il pre-programmati cinetica protocollo e monitor del calcio verde-5N fluorescenza.

4. reagenti e soluzioni

Nota: La seconda parte è una procedura sperimentale per l'imaging confocale di mitocondriale Ca^{2 +} in cellule coltivate

Rendere la soluzione di Tyrode (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2mm CaCl₂, 1mm MgCl₂, 10 millimetri di glucosio e 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Preparare la soluzione di lavaggio (acetato di potassio di 100 mM, 15 mM KCl, 5mm KH₂PO₄, 5mm Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl₂, 0.75 mM MgCl₂, fosfocreatina di 10 mM, 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Preparare la soluzione di permeabilizzazione, che contiene saponina 0,005% in soluzione di lavaggio. Prepararlo fresco ogni giorno.
Preparare 0 Ca^{2 +} soluzione interna (100mm potassio acetato, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH regolato a 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Preparare soluzione interna contenente Ca^{2 +}. Aggiungere CaCl₂ per la soluzione interna sopra per raggiungere la concentrazione di Ca libero^{2 +}desiderata. La quantità di CaCl₂ per aggiungere viene calcolata utilizzando il programma MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
Preparare 1 mM Rhod-2/AM brodo in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
Preparare 1 mM MitoTracker brodo verde in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.

5. placcatura cellule per l'Imaging

22x22 cm² vetrini coprioggetti con etanolo al 100% di lavare e asciugare i vetrini coprioggetto per aria.
Posizionare i vetrini coprioggetti in singoli pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
Nota: Le lamelle possono essere rivestite con laminina, poli-L-lisina o simile matrice per promuovere l'adesione delle cellule.
Tripsinizzano e le cellule sul lamelle che mira per circa il 70% confluenza il giorno dell'imaging della lastra.

6. caricamento di cellule con il Rhod-2/AM e MitoTracker Green

Preparare Rhod-2/AM-MitoTracker verde soluzione di lavoro. Aggiungere 20 μL di Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL di Stock in MitoTracker verde 1 mM e 2,5 μL di 20% pluronic F-127 a 1 mL di soluzione di Tyrode. La concentrazione finale di Rhod-2 della soluzione di lavoro è di 20 µM e la concentrazione finale di MitoTracker green è di 200 nM.
Rimuovere delicatamente il supporto di crescita dal vetrino coprioggetti.
Nota: Un passaggio di lavaggio non è necessario prima dell'aggiunta di soluzione colorante.
Aggiungere il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde in modo goccia a goccia sul coprioggetto finché il coprioggetto è appena coperto (circa 3-4 gocce al vetrino coprioggetti).
Incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce per permettere alle cellule di carico con i coloranti.
De-esterificare il Rhod-2am. Rimuovere delicatamente il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde e sostituirlo con soluzione di Tyrode fresca temperatura ambiente Incubare 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

7. confocale Imaging del mitocondriale Rhod-2am e fluorescenza MitoTracker Green

Trasferire il coprioggetto al microscopio imaging camera e riempire la camera con soluzione di lavaggio.
In impostazioni per l'osservazione di cellule in contrasto di fase a 40x, regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule sono visibili e messo a fuoco.
Permeabilize membrana plasmatica di Rhod-2/AM-MitoTracker verde caricato celle per rimuovere localizzato cytosol Rhod-2, pur mantenendo la tintura localizzato i mitocondri.
1. Rimuovere la soluzione di lavaggio dal vetrino coprioggetti.
2. Sostituirlo con soluzione di permeabilizzazione per circa 1 min.
3. Controllare visivamente la morfologia di membrana plasmatica durante tutto il processo di permeabilizzazione. Celle permeabilized svilupperà una superficie ruvida.
4. Quando permeabilizzazione è completa, immediatamente rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e sostituirlo con 0 Ca^{2 +} soluzione interna.
Allo stesso tempo immagine Rhod-2 fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 575-675 nm 559) e MitoTracker verde fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser 488nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 505-525 nm). Concentrarsi su celle permeabilized visualizzati da un chiaro colocalizzazione di Rhod-2 e MitoTracker verde.
Diminuire il laser di microscopio e impostazioni di guadagno tale che la fluorescenza Rhod-2 mitocondriale è fioca e appena visibile.
Selezionare impostazioni di microscopio di acquisire scansioni 2-dimensionale di un corso di tasso e tempo di frame appropriato per la specifica applicazione. Un frame rate di almeno 30 fotogrammi/s è consigliato per acquisire con precisione la cinetica dei cambiamenti in mitocondriale Ca^{2 +}.
Rimuovere la Ca 0^{2 +} soluzione interna senza disturbare le celle o la messa a fuoco del microscopio.
Avviare l'acquisizione di immagini.
Aggiungere Ca^{2 +}-soluzione interna piena al momento s 10 punto manualmente o con un sistema di perfusione.
Selezionare le regioni di interesse (ROI) per comprendere le regioni di colocalizzazione tra mitocondriale Rhod-2 e MitoTracker verde segnale del software di acquisizione immagine.
Nota: Per ogni ROI vengono ottenuti i valori di fluorescenza arbitrario (F) per ogni punto di tempo della registrazione. Questi valori sono sfondo sottratto e normalizzato per la fluorescenza iniziale (prima del Ca^{2 +} aggiunta; F₀) e tracciate come F/F₀ nel corso del tempo per la presentazione dei dati e la quantificazione dell'ampiezza del cambiamento di mitocondriale Ca^{2 +}.

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Risultati

La figura 1 Mostra mitocondriale Ca^{2 +} misure di assorbimento in mitocondri cardiaci isolati utilizzando la piattaforma basata su lettore di piastra e il Ca^{2 +} tingere del calcio verde-5N. In condizioni di controllo (Figura 1A), i mitocondri cardiaci erano sospese in tampone di KCl contenente calcio verde-5N e poi sfidati con impulsi sequenziali di CaCl₂ (5 μL di soluzione di CaCl₂ 0,6 ...

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Discussione

Qui, descriviamo due diversi approcci per misurare mitocondriale afflusso di Ca^{2 +} . La piastra lettore-basato del calcio verde-5N Metodo Monitor extramitochondrial Ca^{2 +} livelli ed è una Ca^{2 +} analisi di assorbimento che è ben adatta per le misurazioni in mitocondri isolati. Mentre abbiamo dimostrato risultati rappresentativi da mitocondri cardiaci murini isolati, questo test può essere facilmente adattato per i mitocondri isolati dai tessuti con alta abbondanza mitocondriale compreso fe...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da concedere finanziamenti dall'associazione americana di cuore (J.Q.K.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo
Olympus FV1000 Laser Scanning microscopio confocale	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Lettore multimodale di micropiastre con iniettori	Biotek
Omogeneizzatore tissutale	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm Vetrini coprioggetti	Corning	2850-22
Piastra a 96 pozzetti	Corning	3628
6 pozzetto	piastra Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker verde FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Saccarosio	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Cloruro di potassio	Fisher	BP366-500
Fosfato di potassio monobasico	Sigma	P0662
Cloruro di magnesio	Sigma	M2670
Piruvato di sodio	Sigma	P2256
Acido L-malico	Sigma	M1125
Cloruro di calcio	Sigma	C4901
Acetato di potassio	Fisher	BP364-500
Adenosina 5′-trifosfato sale di magnesio	Sigma	A9187
Fosfocreatina sale disodico	Sigma	P7936
Saponina	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440

Riferimenti

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Saggio con lettore di piastre Microscopia confocale Calcium Green 5N Rhod 2 AM Captazione mitocondriale Cellule permeabilizzate Segnalazione del calcio

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