I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca2 + deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca2 + 1,2. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti diCa 2 + storage. CA2 + presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l'attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza3. Per la regolazione metabolica, Ca2 + migliora l'attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell'acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale4,5 . Con sovraccarico mitocondriale di Ca2 + e dysregulated mitocondriale Ca2 + movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca2 + trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte6,7,8,9. Così, mitocondriale di Ca2 + segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.
Negli ultimi anni, c'è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca2 + dinamica dovuta in gran parte per l'identificazione dei costituenti molecolari del Ca2 + uniporter mitocondriale complesso, un'interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca2 + importare nella matrice mitocondriale 10,11,12. Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca2 + mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell'uniporter complesso e mitocondriale Ca2 + afflusso a malattia13,14,15. Infatti, Ca2 + segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro16,17,18, 19,20.
Data l'importanza fondamentale di mitocondriale Ca2 + segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca2 + segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca2 + afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca2 + . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca2 +-coloranti sensibili21,22 e geneticamente codificato Ca2 + sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina23, 24. L'obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca2 + l'assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca2 + afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato14 . Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM25.