Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Sommario

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca^{2 +} mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca^{2 +} importazione analisi usando il Ca^{2 +} sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca^{2 +} colorante Rhod-2/AM.

Abstract

CA^{2 +} gestione dai mitocondri è una funzione critica che regolano processi sia fisiologici e fisiopatologici in un ampio spettro di cellule. La capacità di misurare con precisione l'afflusso e l'efflusso di Ca^{2 +} dai mitocondri è importante per determinare il ruolo di mitocondriale Ca^{2 +} gestione in questi processi. In questo rapporto, presentiamo due metodi per la misura di mitocondriale Ca^{2 +} gestione in mitocondri isolati sia in cellule coltivate. Dettagliamo in primo luogo una piattaforma di basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando il Ca^{2 +} colorante sensibile del calcio verde-5N. Il formato basato su lettore di piastra elude la necessità di attrezzature specializzate, e la tintura di calcio verde-5N è adatta idealmente per misura Ca^{2 +} dai mitocondri del tessuto isolato. Per la nostra applicazione, descriviamo la misurazione del mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in mitocondri isolati dal tessuto del cuore del mouse; Tuttavia, questa procedura può essere applicata per misurare mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in mitocondri isolati da altri tessuti quali fegato, muscolo scheletrico e cervello. In secondo luogo, descriviamo un saggio basato su microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca^{2 +} in celle permeabilized utilizzando il Ca^{2 +} sensibile colorante Rhod-2/AM e imaging utilizzando la microscopia a scansione laser 2-dimensionale. Questo protocollo di permeabilizzazione Elimina la contaminazione di tintura citosolico, consentendo la registrazione specifica di cambiamenti in mitocondriale Ca^{2 +}. Inoltre, microscopia a scansione laser permette un'alta frequenza di catturare rapidi cambiamenti di mitocondriale Ca^{2 +} in risposta a diversi farmaci o reagenti applicati nella soluzione esterna. Questo protocollo può essere applicato per misurare mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in molti tipi cellulari tra cui cellule primarie quali miociti cardiaci e neuroni e linee cellulari immortalizzate.

Introduzione

I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca^{2 +} deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca^{2 + 1,2}. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti di^{Ca 2 +} storage. CA^{2 +} presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l'attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza³. Per la regolazione metabolica, Ca....

Protocollo

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Emory University.

Nota: La prima parte è la procedura sperimentale per la misura di afflusso Ca^{2 +} mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati utilizzando un lettore di piastra.

1. reagenti e soluzioni

1. Fare 500 mL di tampone di MS-EGTA per isolamento mitocondriale: 225 mM mannitolo, saccarosio di 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 1 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), pH regol....

Risultati

La figura 1 Mostra mitocondriale Ca^{2 +} misure di assorbimento in mitocondri cardiaci isolati utilizzando la piattaforma basata su lettore di piastra e il Ca^{2 +} tingere del calcio verde-5N. In condizioni di controllo (Figura 1A), i mitocondri cardiaci erano sospese in tampone di KCl contenente calcio verde-5N e poi sfidati con impulsi sequenziali di CaCl₂ (5 μL di soluzione di CaCl₂ 0,6 .......

Discussione

Qui, descriviamo due diversi approcci per misurare mitocondriale afflusso di Ca^{2 +} . La piastra lettore-basato del calcio verde-5N Metodo Monitor extramitochondrial Ca^{2 +} livelli ed è una Ca^{2 +} analisi di assorbimento che è ben adatta per le misurazioni in mitocondri isolati. Mentre abbiamo dimostrato risultati rappresentativi da mitocondri cardiaci murini isolati, questo test può essere facilmente adattato per i mitocondri isolati dai tessuti con alta abbondanza mitocondriale compreso fe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Olympus FV1000 Laser Scanning microscopio confocale	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Lettore multimodale di micropiastre con iniettori	Biotek
Omogeneizzatore tissutale	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm Vetrini coprioggetti	Corning	2850-22
Piastra a 96 pozzetti	Corning	3628
6 pozzetto	piastra Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker verde FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Saccarosio	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Cloruro di potassio	Fisher	BP366-500
Fosfato di potassio monobasico	Sigma	P0662
Cloruro di magnesio	Sigma	M2670
Piruvato di sodio	Sigma	P2256
Acido L-malico	Sigma	M1125
Cloruro di calcio	Sigma	C4901
Acetato di potassio	Fisher	BP364-500
Adenosina 5′-trifosfato sale di magnesio	Sigma	A9187
Fosfocreatina sale disodico	Sigma	P7936
Saponina	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440