Qui viene mostrato un metodo per la preparazione della matrice extracellulare (TEM) di lingua con decellularizzazione efficiente. Il TEM utilizzabile come funzionale scaffold per la ricostruzione di un modello di carcinoma di cellule squamous (TSCC) lingua in condizioni di coltura statica o agitata.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di lingua della matrice extracellulare e la ricostituzione di Carcinoma di cellule Squamous Tongue In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Al fine di costruire un modello efficace e realistico per lingua cellule squamose carcinoma (TSCC) in vitro, i metodi sono stati creati per produrre decellularized lingua extracellulare (TEM) che fornisce funzionale ponteggi per edilizia TSCC. TEM fornisce una nicchia in vitro per la crescita cellulare, differenziazione e migrazione cellulare. Le microstrutture del nativo della matrice extracellulare (ECM) e biochimici composizioni conservate nella matrice decellularizzata forniscono tessuto-specifiche nicchie per l'ancoraggio di cellule. La fabbricazione di TEM può essere realizzata tramite digestione deossiribonucleasi (DNase) accompagnata con una seria di pretrattamento organico o inorganico. Questo protocollo è facile da usare ed assicura l'alta efficienza per il decellularizzati. Il TEM ha mostrato citocompatibilità favorevole per le celle TSCC in condizioni di coltura statica o agitata, che permette la costruzione del modello TSCC. Un bioreattore self-made è stato utilizzato anche per la persistente condizione agitata per la coltura cellulare. TSCC ricostruito utilizzando TEM ha mostrato le caratteristiche e le proprietà che assomiglia l'istopatologia clinica di TSCC, suggerente il potenziale della ricerca TSCC.
Introduzione
La lingua ha varie funzioni importanti, come la deglutizione, articolazione e degustazione. Quindi, il danno della funzione di lingua ha grande impatto il patients' qualità di vita1. La malignità più comune nella cavità orale è carcinoma di cellule squamous lingua (TSCC), che di solito si verifica nelle persone che bere alcolici o fumano tabacco2.
Negli ultimi anni, scarsi progressi compiuti nella ricerca fondamentale sulla TSCC. La mancanza di efficienti in vitro ricerca modelli resti per essere uno dei maggiori problemi. Così, la matrice extracellulare (ECM) scopre di essere una pot....
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Protocollo
Tutto il lavoro animale era eseguito in conformità con legge di benessere degli animali, le linee guida istituzionali e approvato dal comitato di uso, Sun Yat-sen University e istituzionali Animal Care.
1. preparazione del TEM
- Eseguire topi di dislocazione cervicale e rimuovere le lingue utilizzando pinzette e forbici chirurgiche sterili.
- Immergere le linguette in etanolo di 75% per 3 minuti, poi mettere ogni lingua in un 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL di 10 millimetri di fosfato sterile tamponata (PBS).
Nota: La concentrazione di PBS in tutti i passaggi seguenti è lo stessa come la concentrazione in questo passa....
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Risultati
Questo protocollo per la preparazione di TEM risulta per essere efficiente e appropriato. Il TEM ha mostrato decellularizzazione perfetto rispetto ai tessuti di madrelingua. L'efficacia di decellularizzazione è stata confermata da ematossilina-eosina (HE) (Figura 1A-B). HE i risultati di macchiatura ha rivelato la scomparsa completa di macchiatura nucleare nel TEM (Figura 1B). Inoltre, contenuto .......
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Discussione
Un protocollo ben consolidato per la fabbricazione di ECM decellularizzati dovrebbe mantenere la composizione di ECM nativa durante la rimozione di componenti cellulari nei tessuti quasi completamente21. Nonostante i protocolli di decellularizzazione attualmente segnalati che richiedono perfusione attraverso il sistema vascolare per rimuovere materiali cellulari di trasporto convettivo, agitazione meccanica è stata adottata qui, conosciuto come un metodo semplice ed economico tradizionale
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il supporto di assegni di ricerca dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31371390), il programma del progetto di sviluppo High-Tech di stato (2014AA020702) e il programma di Guangdong Science and Technology (2016B030231001).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi C57-BL / 6J | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Etanolo | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Cloruro di sodio | Sangon Biotech | A501218 | |
| Cloruro di potassio | Sangon Biotech | A100395 | |
| Fabbrica | di reagenti chimici bibasici di Sodio Fosfato di GuangzhouBE14-GR-500G | ||
| Fosfato di potassio monobasico | Sangon Biotech | A501211 | |
| Provetta EP da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-A Congelatore | |
| a bassissima temperatura | Thermo Fisher Scientific Piatto | ||
| colture cellulari da 3,5 cm | Thermo Fisher Scientific 153066 | ||
| Piatto per colture cellulari da 6 cm | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Solfato di magnesio | Sangon Biotech | A601988 | |
| glucosio | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillina | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Sutura chirurgica | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL bottiglia a bocca larga | SHUNIU | 1407 | |
| Agitatore magnetico | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubatore | SHEL LAB | SCO5A | |
| Siringa da 10 mL | Hunan Pingan | ||
| 50 mL provetta da centrifuga | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai Cell Bank | Linea cellulare di carcinoma a cellule squamose della lingua | |
| U2OS cell | Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai Cell Bank | Linea cellulare di osteosarcoma umano | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes acido libero | BBI | ||
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 gradi C frigorifero | Haier | ||
| Depuratore d'acqua | ELGA | ||
| Emocitometro | BLAU | 717805 |
Riferimenti
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al.
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Ristampe e permessi
