Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.

Sommario

Citrus Greening è una malattia particolarmente distruttiva che interessano colture di agrumi a livello globale. Presentato qui è un metodo semplice usando PCR ed estrazione del DNA genomico di tessuto fogliare agrumi per l'accurata e precisa identificazione dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, è una malattia distruttiva agrumi devastando agrumeti a livello globale. Questa malattia provoca asimmetrico foglia giallo chiazzatura, vena ingiallimento, defogliazione, decadimento di radice e in ultima analisi, la morte della pianta di agrumi. Quando infetta, le piante di agrumi hanno stentata crescita e producono fiori fuori stagione. Questi fiori frutti raramente, e quelli che producono agrumi piccoli, amaro, dalla forma irregolare che non sono desiderabili. Questa malattia è sparsa per l'Asian psyllid agrumi, Diaphorina citri e margotta di tessuto infetto di agrumi. L'agente patogeno ha un periodo di incubazione lungo e variabile all'interno della pianta di agrumi — a volte anni, prima che i sintomi compaiono. Tentativi di questo agente patogeno in vitro della coltura sono stati infruttuosi, possibilmente dovuto il livello basso e irregolare concentrazione dell'agente patogeno all'interno tessuto di agrumi contaminati, o perché è difficile da replicare l'ambientale condizioni favorevoli alla crescita di l'agente patogeno. È molto difficile individuare la malattia prima che si è diffuso, a causa del suo lungo periodo di incubazione e l'incapacità dei ricercatori alla cultura l'agente patogeno. Di conseguenza, la malattia diventa solo apparente dopo aver distrutto improvvisamente resa intera di un contadino di agrumi. Presentato qui è un metodo per la rilevazione accurata e specifica dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico e PCR. Questo metodo è semplice, efficiente, conveniente e adattabile per l'analisi quantitativa. Questo metodo può essere adattato per l'uso su qualsiasi tessuto agrumi; Tuttavia, è potenzialmente limitato dalla quantità di agente patogeno presente nel tessuto. Tuttavia, questo metodo verrà consentire agli agricoltori di agrumi identificare le piante infette di agrumi all'inizio e frenare la diffusione di questa malattia distruttiva prima che possa diffondersi ulteriormente.

Introduzione

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, ha causato una perdita significativa di alberi di agrumi. Un caso rappresentativo è Florida, dove la malattia è prevista per causare una riduzione del 70% nella produzione di scatole di Florida arancione da scatole di 244 milioni nella stagione 1997-1998 a caselle 70 milioni a partire dal 2016-2017 stagione¹. Oltre il 90% degli alberi di agrumi in Florida sono infetti², e si stima che l'industria dell'agrume di Florida perde circa 1 miliardo di dollari ogni anno a causa di malattie degli agrumi, in cui citrus greening gioca un ruolo importante³. Citrus greening è trasmesso principalmente per la dilagante psyllid agrume asiatico Diaphorina citri, ma può essere trasmessa anche mediante innesto di tessuto infetto. La malattia provoca l'ingiallimento delle vene, foglia giallo asimmetrico chiazzatura, defogliazione precoce, avvizzimento progressivo ramoscello, decadimento di radice e morte della pianta. D'importanza, la malattia provoca la pianta di agrumi a produrre fiori fuori stagione, che raramente producono frutta. La frutta che è prodotta da piante di agrumi infetti è immaturi, verde e amaro degustazione⁴.

Lo scopo di questo metodo è quello con precisione e identificare con precisione il batterio mobile Candidatus liberibacter spp., l'agente causativo di citrus greening, vivono all'interno del floema di alberi di agrumi infetti⁵. Il DNA genomico è estratto dal tessuto foglia intera, che contiene i batteri vivi. Questo DNA genomico estratto viene utilizzato come un modello per PCR convenzionale, dove oligonucleotidi complementari alla sequenza del rDNA 16S del batterio sono utilizzati per amplificare questa sequenza. Oligonucleotidi complementari ad un gene FBOX agrumi sono utilizzati come un controllo di amplificazione interna. Abbiamo scelto di utilizzare questo metodo, perché essa ha dimostrato di avere successo nella precedente ricerca⁶.

Questo metodo ha il chiaro vantaggio di essere semplice, relativamente poco costoso e in grado di essere eseguita in qualsiasi laboratorio di biochimica normalmente attrezzata. Inoltre, PCR rimane il metodo più accurato e preciso per la rilevazione di questo agente patogeno, a causa della difficoltà di coltura di questo agente patogeno⁷e capacità del patogeno di sopravvivere e riprodursi per anni all'interno di un host asintomatico⁸. Molte specialità diverse analisi di PCR sono state usate per rilevare correttamente questo agente patogeno; Tuttavia, PCR convenzionale rimane il più semplice test per la rilevazione accurata e specifica, soprattutto all'interno di host asintomatico⁸.

Protocollo

1. isolare il DNA genomico da tessuto vegetale utilizzando un Kit di estrazione genomico

1. Ottenere tessuto fogliare agrumi tagliando un intero fresco foglia da un albero di agrume utilizzando forbici pulite e portare l'anta in un sacchetto di plastica pulito sandwich.
   Nota: La borsa contenente tessuto fogliare deve essere inserita in un frigorifero a 4 ° C o il ghiaccio in un contenitore isolato appena possibile dopo la raccolta per evitare il deterioramento.
2. Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido per raffreddare un mortaio e un pestello. Mentre essi sono agghiaccianti, usare le forbici per tagliare un piccolo pezzo di tessuto fogliare, circa 1 pollice quadrato di dimensioni. Posizionare il tessuto tagliato nel mortaio per congelare istantaneamente. Aggiungere più azoto liquido, se necessario.
   Nota: Guanti isolanti devono sempre essere indossati durante la manipolazione di azoto liquido.
3. Macinare rapidamente i tessuti vegetali in una polvere fine utilizzando il mortaio. Continuare la rettifica fino a quando l'azoto liquido evapora completamente, e rimane una polvere fine verde.
4. Brevemente chill una spatola di metallo in azoto liquido per 10-15 s, poi scoop il tessuto di terra all'interno di mortaio in una microcentrifuga da 1,5 mL, utilizzando la spatola.
5. Aggiungere 600 µ l di soluzione di lisi di Nuclei (Vedi Tabella materiali) utilizzando una 1000 µ l pipette e vortexare il campione per 1-3 e, quindi, Incubare in un bagno di acqua di 65 ° C per 15 min.
6. Aggiungere 3 µ l di soluzione di RNAsi al lisato utilizzando una pipetta 10 µ l, capovolgere la provetta 2 - 5 volte per mescolare e incubare a 37 ° C in un incubatore armadietto per 15 min.
   Nota: Lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere.
7. Aggiungere 200 µ l di soluzione di precipitazione della proteina, vortice ad alta velocità per 20 s, poi Centrifugare per 3 min a 13.000 x g per formare una pallottola solida. Mentre il campione è essere centrifugato, aggiungere 600 µ l di isopropanolo a temperatura ambiente per un tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL.
8. Utilizzando una pipetta di 1000 µ l, con attenzione rimuovere il supernatante dal campione centrifugato, trasferirlo al tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL contenenti isopropanolo. Il pellet può ora essere scartato.
   Nota: Evitare di contaminare il surnatante con proteina lasciando una quantità minuscola di surnatante sopra il pellet.
9. Capovolgere la provetta fino a quando il DNA diventa visibile come una massa di filamenti filiformi, poi Centrifugare a 13.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
10. Decantare il supernatante, aggiungere 600 µ l di etanolo al 70% per il pellet, capovolgere la provetta diverse volte per lavare il DNA e centrifugare a 13.000 x g per 1 min.
11. Attentamente aspirare l'etanolo, lasciando il pellet sciolto di DNA, quindi aprire e capovolgere la provetta, che riposa su carta assorbente. Aria secca a temperatura ambiente per 15 min.
12. Aggiungere 100 µ l di soluzione di reidratazione del DNA al pellet di DNA secchi, quindi incubare il DNA in un bagno di acqua di 65 ° C per 1 h, mescolando periodicamente toccando il tubo.
13. Posizionare 1 µ l di acqua purificata su un microcuvette e inserirlo in uno spettrofotometro per essere utilizzato come uno spazio vuoto. Calcolare la concentrazione di DNA presente posizionando 1 µ l di campione sulle microcuvette e inserimento nello spettrofotometro. Concentrazione di DNA (ng / µ l) può essere calcolato come (un₂₆₀-₃₂₀) × diluizione fattore × 50 ng / µ l.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione può essere conservato a 4 ° C.

2. eseguire la PCR su campioni di DNA genomico

1. Unire 10 µ l 2 x PCR Master Mix (Vedi tabella dei materiali), primer di 1 µ l in avanti (10 pM / µ l), 1 µ l reverse primer (10 pM / µ l) (Vedi tabella 2 per sequenze dell'iniettore), 100 ng di DNA genomic estratto dal campione e purificato acqua (fino a 20 µ l di volume finale) in un 50 µ l PCR tubo, flick per mescolare e brevemente della centrifuga.
2. Inserire il tubo PCR il termociclatore ed eseguire di conseguenza (Vedi tabella 1).
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se necessario, conservare il campione a 4 ° C dopo la reazione è completa.

3. elettroforesi del DNA amplificato in un Gel di agarosio

1. Pesare 0,4 g di polvere di agarosio e aggiungerlo insieme con 1 tampone di x TAE a un pulito 200 mL flacone erlenmeyer, riempimento fino a 50 mL.
2. Forno a microonde in alto per 1,5 minuti, scuotendo ogni 30 s, finchè agarosio sia completamente dissolto.
   Nota: Guanti isolanti devono essere indossati durante la manipolazione di liquidi dell'agarosi per evitare ustioni.
3. Aggiungere 2,5 µ l di bromuro di etidio 10 mg/mL il liquido agarosio e agitare per mescolare, quindi versare il gel di agarosio liquido in uno stampo di gel di livello. Inserire rapidamente pettini standard 12-dente del gel dopo la colata.
4. Lasciare che il gel a raffreddare per 20 min a temperatura ambiente, poi rimuovere gel pettini e mettere il gel in una scatola di livello gel riempito con 1 tampone di x TAE.
5. Utilizzando una micropipetta, caricare i campioni di DNA amplificati totali nei pozzetti. Aggiungere 5 µ l di DNA ladder (Vedi Tabella materiali) in un pozzo separato dai vostri campioni.
6. L'elettroforesi per 35 min a una costante 90 V, quindi rimuovere il gel e posto in un transilluminatore UV.
7. Fotografare e analizzare il gel banding modello mentre con transilluminazione UV a 302 nm.

Risultati

Un risultato positivo produce una fascia distinta corrispondente a 500 bp per Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, e/o una fascia distinta corrispondente a 700 bp per Laa2/Laj5, un inserto nella β ribosomal 16S operone⁹. La banda di controllo di amplificazione interna deve essere presente anche a 400 bp. Questa banda corrisponde all'amplificazione dell'agrume FBOX gene^1...

Discussione

È fondamentale che tutti i passaggi sono seguiti esattamente per ottenere le condizioni sperimentali ottimali. Tessuto di foglia intera è stato utilizzato durante questa dimostrazione; Tuttavia, il protocollo può essere modificato per includere teoricamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale. In precedenza, i ricercatori hanno estratto il DNA genomico da tessuto fogliare della vena, piuttosto che del tessuto foglia intera e raggiunto simili risultati¹¹. Se la fascia corrispondente al gene FBOX...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di purificazione del DNA genomico Wizard	Promega	A1120	Fonte di soluzioni per la lisi dei nuclei, l'RNasi, la precipitazione delle proteine e la reidratazione del DNA
Azoto liquido	Prodotti per l'aria	N/A
Mastercycler pro con pannello di controllo	Eppendorf	6321000019
1250 W Microonde	Panasonic	N/A
5424 centrifuga da tavolo	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 bagnomaria digitale	Fisher scientific	15-462-15Q
Spatola in metallo	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortaio e pestello	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanolo	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μ Punte a L	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μ Punte a L	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μ Punte a L	TipOne	1161-1750
Kit pipettatore a volume variabile	VWR	75788-460
Bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E1510
Agarosio	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acido acetico	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μ cuvetta	Eppendorf	6138000018
Vassoio di colata impilabile e pettini Carolina		213655
PowerPac Alimentatore di base	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospettrometro di base	Eppendorf	6135000009
provette PCR da 0,2 mL	Fisher scientific	AB-0620
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Primer diretto	Thermo Fisher Scientific	N/A
Primer inverso	Thermo Fisher Scientific	N/A
Acqua, grado	PCR Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ Scala DNA	Thermo Fisher Scientific	10787018