Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.

Sommario

Citrus Greening è una malattia particolarmente distruttiva che interessano colture di agrumi a livello globale. Presentato qui è un metodo semplice usando PCR ed estrazione del DNA genomico di tessuto fogliare agrumi per l'accurata e precisa identificazione dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, è una malattia distruttiva agrumi devastando agrumeti a livello globale. Questa malattia provoca asimmetrico foglia giallo chiazzatura, vena ingiallimento, defogliazione, decadimento di radice e in ultima analisi, la morte della pianta di agrumi. Quando infetta, le piante di agrumi hanno stentata crescita e producono fiori fuori stagione. Questi fiori frutti raramente, e quelli che producono agrumi piccoli, amaro, dalla forma irregolare che non sono desiderabili. Questa malattia è sparsa per l'Asian psyllid agrumi, Diaphorina citri e margotta di tessuto infetto di agrumi. L'agente patogeno ha un periodo di incubazione lungo e variabile all'interno della pianta di agrumi — a volte anni, prima che i sintomi compaiono. Tentativi di questo agente patogeno in vitro della coltura sono stati infruttuosi, possibilmente dovuto il livello basso e irregolare concentrazione dell'agente patogeno all'interno tessuto di agrumi contaminati, o perché è difficile da replicare l'ambientale condizioni favorevoli alla crescita di l'agente patogeno. È molto difficile individuare la malattia prima che si è diffuso, a causa del suo lungo periodo di incubazione e l'incapacità dei ricercatori alla cultura l'agente patogeno. Di conseguenza, la malattia diventa solo apparente dopo aver distrutto improvvisamente resa intera di un contadino di agrumi. Presentato qui è un metodo per la rilevazione accurata e specifica dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico e PCR. Questo metodo è semplice, efficiente, conveniente e adattabile per l'analisi quantitativa. Questo metodo può essere adattato per l'uso su qualsiasi tessuto agrumi; Tuttavia, è potenzialmente limitato dalla quantità di agente patogeno presente nel tessuto. Tuttavia, questo metodo verrà consentire agli agricoltori di agrumi identificare le piante infette di agrumi all'inizio e frenare la diffusione di questa malattia distruttiva prima che possa diffondersi ulteriormente.

Introduzione

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, ha causato una perdita significativa di alberi di agrumi. Un caso rappresentativo è Florida, dove la malattia è prevista per causare una riduzione del 70% nella produzione di scatole di Florida arancione da scatole di 244 milioni nella stagione 1997-1998 a caselle 70 milioni a partire dal 2016-2017 stagione¹. Oltre il 90% degli alberi di agrumi in Florida sono infetti², e si stima che l'industria dell'agrume di Florida perde circa 1 miliardo di dollari ogni anno a causa di malattie degli agrumi, in cui citrus greening gioca un ruolo importante³. Citr....

Protocollo

1. isolare il DNA genomico da tessuto vegetale utilizzando un Kit di estrazione genomico

1. Ottenere tessuto fogliare agrumi tagliando un intero fresco foglia da un albero di agrume utilizzando forbici pulite e portare l'anta in un sacchetto di plastica pulito sandwich.
   Nota: La borsa contenente tessuto fogliare deve essere inserita in un frigorifero a 4 ° C o il ghiaccio in un contenitore isolato appena possibile dopo la raccolta per evitare il deterioramento.
2. Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido per raffreddare un mortaio e un pestello. Mentre essi sono agghiaccianti, usare le forbici per tagliare un piccolo pezzo di tessuto fogliare,....

Risultati

Un risultato positivo produce una fascia distinta corrispondente a 500 bp per Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, e/o una fascia distinta corrispondente a 700 bp per Laa2/Laj5, un inserto nella β ribosomal 16S operone⁹. La banda di controllo di amplificazione interna deve essere presente anche a 400 bp. Questa banda corrisponde all'amplificazione dell'agrume FBOX gene^1.......

Discussione

È fondamentale che tutti i passaggi sono seguiti esattamente per ottenere le condizioni sperimentali ottimali. Tessuto di foglia intera è stato utilizzato durante questa dimostrazione; Tuttavia, il protocollo può essere modificato per includere teoricamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale. In precedenza, i ricercatori hanno estratto il DNA genomico da tessuto fogliare della vena, piuttosto che del tessuto foglia intera e raggiunto simili risultati¹¹. Se la fascia corrispondente al gene FBOX.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di purificazione del DNA genomico Wizard	Promega	A1120	Fonte di soluzioni per la lisi dei nuclei, l'RNasi, la precipitazione delle proteine e la reidratazione del DNA
Azoto liquido	Prodotti per l'aria	N/A
Mastercycler pro con pannello di controllo	Eppendorf	6321000019
1250 W Microonde	Panasonic	N/A
5424 centrifuga da tavolo	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 bagnomaria digitale	Fisher scientific	15-462-15Q
Spatola in metallo	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortaio e pestello	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanolo	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μ Punte a L	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μ Punte a L	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μ Punte a L	TipOne	1161-1750
Kit pipettatore a volume variabile	VWR	75788-460
Bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E1510
Agarosio	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acido acetico	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μ cuvetta	Eppendorf	6138000018
Vassoio di colata impilabile e pettini Carolina		213655
PowerPac Alimentatore di base	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospettrometro di base	Eppendorf	6135000009
provette PCR da 0,2 mL	Fisher scientific	AB-0620
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Primer diretto	Thermo Fisher Scientific	N/A
Primer inverso	Thermo Fisher Scientific	N/A
Acqua, grado	PCR Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ Scala DNA	Thermo Fisher Scientific	10787018