Formaldeide-assistita di isolamento di elementi regolatori per l'accessibilità della cromatina di misura in cellule di mammifero

Summary

La plasticità dell'architettura nucleare è controllata da meccanismi epigenetici dinamici tra cui non codificanti RNA, DNA metilazione, nucleosoma riposizionamento come istone composizione e modifica. Qui descriviamo un protocollo di isolamento Formaldehyde-Assisted di elementi normativi (FAIRE) che permette la determinazione dell'accessibilità della cromatina in modo riproducibile, poco costoso e semplice.

Abstract

Espressione genica appropriato in risposta a segnali extracellulari, vale a dire, trascrizione genica di tessuto e lineage-specifici, dipende criticamente stati altamente definiti di organizzazione della cromatina. L'architettura dinamica del nucleo è controllata da meccanismi multipli e modella i programmi di uscita trascrizionale. È, pertanto, importante determinare l'accessibilità della cromatina locus-specifici in modo affidabile che è preferibilmente indipendente dagli anticorpi, che possono essere una fonte potenzialmente di confusione di variabilità sperimentale. L'accessibilità della cromatina può essere misurata con vari metodi, compreso il saggio di isolamento Formaldehyde-Assisted di elementi normativi (FAIRE), che consentono la determinazione dell'accessibilità generale della cromatina in un numero relativamente basso di cellule. Qui descriviamo un protocollo FAIRE che consente la semplice, affidabile e veloce identificazione di regioni genomiche con una capienza di povera in proteine. In questo metodo, il DNA è covalentemente legato a proteine cromatiniche usando formaldeide come un agente di reticolazione e tagliato a piccoli pezzi. Il DNA libero è in seguito arricchito con l'estrazione del fenolo: cloroformio. Il rapporto del DNA libero è determinato da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o sequenziamento del DNA (DNA-seq) rispetto ad un campione di controllo che rappresenta il DNA totale. Le regioni con una struttura più flessibile di cromatina sono arricchite nel campione di DNA libero, consentendo così l'identificazione di regioni genomiche con bassa compattazione della cromatina.

Introduction

Il DNA genomico delle cellule eucariotiche è stipato in nucleosomi, che deve essere rimosso o ristrutturato al fine di consentire l'interazione di altre proteine con il DNA. L'attivazione trascrizionale di un gene, in genere conduce a una configurazione più aperta della sua struttura nucleosomal, particolarmente in nucleosomi + 1¹, per facilitare la trascrizione di RNA polimerasi. Inoltre, regioni regolarici quali promotori e rinforzatori subiscono cambiamenti dinamici nella loro accessibilità della cromatina per consentire l'interazione con i modificatori della cromatina o di fattori di trascrizione². Diversi approcci sono stati sviluppati per identificare queste regioni nucleosoma-libero. Questi includono la sensibilità a nucleasi come dnasi I³ o nucleasi di micrococcal⁴, che può accedere solo il DNA quando non è strettamente avvolto intorno nucleosomi. Altri metodi per l'identificazione di cromatina aperta o DNA libero includono l'integrazione transposase-mediata di elementi retrotrasponibili (saggio per Transposase-accessibile della cromatina, ATAC)⁵o utilizzo di chromatin immunoprecipitation (ChIP) anticorpi contro gli istoni. Il metodo FAIRE non si basa sulla capacità di un enzima per raggiungere il DNA o l'associazione di un anticorpo ad una proteina particolare, ma si basa invece sulla purificazione delle regioni indenni da nucleosoma di un fenolo: cloroformio estrazione^6,7. In questo metodo, il DNA è tagliato in seguito a piccoli pezzi di sonicazione e si lega covalentemente ad proteine cromatiniche la formaldeide agente di reticolazione. Regioni di cromatina strettamente imballate avrà legami incrociati del DNA/proteine abbondanti, mentre le regioni di DNA con pochi o nessun nucleosomi avrà poco o nessun complessi di DNA/proteine del reticolato. Un'estrazione del fenolo: cloroformio permette la purificazione di DNA libero in fase acquosa, mentre il reticolato del DNA alle proteine è catturato in fase organica fenolo o acquoso-organici interfase insieme con le proteine non reticolati. La quantificazione di questo DNA libero rispetto a un riferimento di totale campione di DNA permette l'identificazione delle regioni gratuito della cromatina. Il metodo FAIRE può essere utilizzato per la caratterizzazione delle singole regioni genomiche, come descritto qui, ma è adatto anche per l'identificazione di accessibilità della cromatina genoma quando agganciato al sequenziamento profondo come descritto in diversi modelli^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. risultati ottenuti da FAIRE-seq e altri metodi quali ATAC-seq sono sovrapposte in gran parte¹⁴. Il metodo FAIRE è un molto robusto, economico e facile eseguire il metodo per identificare le regioni libere di nucleosomi. A differenza di altri metodi, esso non richiede esperimenti pilota per determinare il livello appropriato di digestione come richiesto per nucleasi (DNasi-seq, MNase-seq) o transposases (ATAC-seq) e discusso in dettaglio in una recente recensione¹⁵. Gli unici parametri da regolare sono la sonicazione condizioni e in alcuni casi il tempo di fissazione. Questo articolo descrive un semplice protocollo che è schematicamente mostrato in Figura 1 e che non richiede particolari attrezzature diverse da un sonicatore. Il protocollo può essere eseguito in un tempo ragionevolmente breve e rende FAIRE un metodo semplice e affidabile per testare l'accessibilità della cromatina in un certo numero di tipi cellulari diversi che vanno dal polmone cellule¹¹ a cellule primarie ottenute da mouse fegati¹⁶.

Protocol

1. giorno 1: Coltura cellulare

1. Coltura le cellule per essere analizzati fino alla quantità desiderata. Media e condizioni di coltura delle cellule dipende i tipi di cellule sotto inchiesta.
   Nota: In linea di principio, qualsiasi cellula eucariotica è favorevole ad un'analisi dell'accessibilità della cromatina di FAIRE. Per questo esperimento, 4 x 10⁶ HEK 293T cellule sono seminate in un piatto singolo 10cm in DMEM medium completato con 10% (v/v) FBS e 1% (p/v) penicillina/streptomicina e incubate a 5% CO₂ e 37 ° C per 24 h fino a quando le cellule raggiungono la confluenza di 70-80% (~ 8 x 10 ⁶ cellule per piatto).

2. giorno 2: Formaldeide reticolazione e cella di raccolta

Attenzione: La formaldeide è altamente tossica e deve essere sempre utilizzata sotto una cappa aspirante. Indossare indumenti protettivi (guanti e camice da laboratorio). Smaltire i rifiuti in modo appropriato.

1. Aggiungere formaldeide direttamente al terreno di coltura di cellule in una cappa per raggiungere una concentrazione finale dell'1% (v/v) (270 µ l di formaldeide 37% (v/v) a 10 mL di terreno di coltura cellulare). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25 ° C) e uccise le piastre manualmente ogni 2 min.
   Nota: Il tempo di reticolazione può essere regolato secondo il tipo di cella. Per la maggior parte delle varietà di cellula, 10 min di reticolazione è adeguata. Per i tessuti, le incubazioni più lungo potrebbero essere necessario consentire il fissaggio di tutte le cellule.
2. Aggiungere glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M per placare la formaldeide (aggiungere 500 µ l di uno stock di glicina 2,5 M a 10 mL di terreno di coltura). Incubare per 5 min a temperatura ambiente e uccise ogni 2 min.
3. Lavare le cellule 3 x con PBS freddo ghiaccio (8 g/L NaCl, KCl, 1,44 g/L Na₂HPO₄ · 2 H₂O, 0,24 g/L KH₂PO₄, 0,2 g/L aggiustare il pH a 7.4 con HCl o NaOH). Il mezzo di aspirare e lavare direttamente nella piastra di coltura delle cellule o boccetta con l'aggiunta di 10 mL di PBS. Ripetere questo passaggio due volte facendo molta attenzione nel caso di cellule senza bloccare aderenti ad esempio HEK 293T. Aggiungere PBS con attenzione al lato del piatto per evitare il distacco delle cellule.
4. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo ghiaccio e trasferirlo in una provetta di reazione di 1,5 mL sul ghiaccio. Utilizzare un raschietto di cella per staccare le cellule quando necessario.
   Nota: Quando si inizia con un materiale limitato, è possibile utilizzare basso DNA-legantesi tubi per evitare la perdita del campione durante la procedura.
5. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g a 4 ° C in una centrifuga refrigerata da tavolo. Scartare il surnatante aspirando con attenzione.

3. cellula Lisi e frammentazione della cromatina

1. Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi FAIRE di 1 mL (1% (p/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.1, 10 µ g/mL leupeptina, 10 µ g/mL aprotinina, 2 mM PMSF) e risospendere le cellule attentamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Conservare i campioni a-80 ° C a questo passaggio se necessario.
2. Sonicare il reticolato del DNA al taglio per una dimensione media di 200-300 bp. Le impostazioni specifiche del sonicatore devono essere determinate per ciascuna fonte di campioni e il dispositivo usato sonicazione. In ogni caso assicurarsi che il DNA è stato tosato in modo efficiente. Un passaggio di ottimizzazione per la tosatura del DNA è descritto nella sezione passaggio 5.14. Raffreddare i campioni su ghiaccio durante la sonicazione per evitare il riscaldamento del campione.
3. Centrifugare il campione per 15 min e 13.000 x g a 4 ° C.
4. Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo di reazione. Dividere i campioni in aliquote di 100 µ l. Conservare i campioni a-80 ° C, se necessario.
   Nota: Il protocollo può essere interrotta a questo punto.

4. de-reticolazione del controllo del DNA

1. Prendere un 100 µ l aliquota dal passaggio 3.4 per invertire la reticolazione e per essere utilizzato come riferimento per DNA totale. Aggiungere 10 µ l di RNasi-A (10 mg/mL) e incubare per 1h a 37 ° C.
2. Aggiungere 10 µ l di proteinasi K (20 mg/mL). Utilizzare un termo-blocco programmabile per incubare per 4 h a 37 ° C e poi per 6 h a 65 ° C per fendere le proteine e per invertire i collegamenti incrociati. Infine, tenere i campioni a 4 ° C fino a quando il protocollo è ripreso e quindi procedere al passaggio 5.
   Nota: Altri protocolli FAIRE utilizzano esempi di cromatina da cellule che non sono stati reticolati come riferimento, abolendo così la necessità di de-reticolazione¹¹. Il fatto che questi esempi non sono reticolate potrebbero portare a differenze dell'efficienza di sonicazione o nella stabilità del DNA, pertanto l'uso totali del DNA di campioni di riferimento che hanno subito la stessa procedura come i campioni di prova è più accurata.

5. giorno 3: Fenolo: cloroformio purificazione del DNA

1. Prendere la non-de-reticolato aliquota dal punto 3.4. Aggiungere 10 µ l di RNasi-A (10 mg/mL) e incubare per 1h a 37 ° C.
2. Prendere il passaggio di modulo aliquota non-de-reticolato 5.1 e il campione di de-irradiato dalla fase 4.2 e procedere in parallelo. Aggiungere H₂O per raggiungere un volume finale di 300 µ l.
3. Aggiungere 300 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) in una cappa aspirante e vortexare vigorosamente.
   Attenzione: Il fenolo è corrosivo e tossico e deve essere utilizzato sempre sotto cappa aspirante. Indossare indumenti protettivi (guanti e camice da laboratorio), assicurarsi che le provette di reazione sono ermeticamente chiuse e smaltire i rifiuti in modo appropriato.
4. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
5. Trasferire con cautela 280 µ l della fase acquosa superiore ad un nuovo tubo di reazione. Assicurarsi di non prendere eventuali detriti dall'interfase che contiene anche proteine. Scartare la fase inferiore rimanente come rifiuti di solventi organici.
6. Ripetere i passaggi da 5.3 a 5.5 e trasferire con cautela 270 µ l della fase acquosa superiore ad un nuovo tubo di reazione.
7. Aggiungere 270 µ l di cloroformio in una cappa aspirante e vortexare vigorosamente.
   Nota: Questo passaggio viene utilizzato per eliminare qualsiasi fenolo restante dal campione.
8. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
9. Trasferire con cautela 250 µ l della fase acquosa superiore ad un nuovo tubo di reazione, avendo cura di non per portare eventuali detriti dall'interfase. Scartare il campione rimanente come rifiuti di solventi organici.
10. Aggiungere 25 µ l di 5 M di NaCl e 250 µ l di isopropanolo. Aggiungere 5 µ l di glicogeno (20 mg/mL) come il vettore di DNA. Mescolare bene capovolgendo i tubi e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C per precipitare il DNA.
11. Lavare la pallina di DNA con 400 µ l di etanolo al 70% (v/v). Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
12. Aspirare il surnatante con cura e asciugare il pellet per 10 min a temperatura ambiente. Risospendere in 100 µ l di tampone di TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA).
13. Incubare il campione di DNA libero non-de-reticolato per 4 h a 65 ° C per rimuovere legami crociati inter-DNA. Conservare i campioni a-20 ° C.
14. Quantificare la quantità di DNA mediante uno spettrofotometro ed eseguire un'aliquota per controllare la dimensione del frammento su un gel di agarosio al 2% (p/v). Regolare il tempo di taglio e intensità, a seconda dei risultati dell'analisi del DNA dimensione di agarosio gel elettroforesi, per ottenere una dimensione media di 200-300 bp.

6. determinazione del DNA totale Versus libero mediante PCR Real Time quantitativa (qRT-PCR)

1. Il rapporto del DNA libero nucleosoma (nel seguito indicato come DNA libero) rispetto al totale di DNA è determinato da qRT-PCR^17,18. I campioni possono anche essere analizzati quantitativamente dall'ibridazione di microarray o sequenziamento profondo per le determinazioni di genoma.
2. Disegnare primers qPCR per le regioni da testare e per controlli positivi e negativi.
   Nota: Adatti controlli positivi sono iniettori situati nel promotore di geni housekeeping attivamente trascritto come ACTB, GAPDH, TPI1 o TUBA1A (codifica β-actina, GAPDH, TPI o α-tubulina). Opportuni controlli negativi si trovano in regioni di eterocromatina o gene deserti. Altri idonei controlli negativi possono essere progettati in regioni genomiche adiacenti al locus dinamicamente regolato sotto inchiesta a controllo per differenze di numero di copia locale (tabella 1).
3. Diluire i campioni di DNA ad una concentrazione finale di 10 ng / µ l con buffer di TE e il fattore di diluizione di prendere in considerazione per i calcoli finali (Vedi punto 6.5).
4. Impostare una reazione di qPCR in triplici copie in una piastra a 96 pozzetti, con il seguente mix di reazione per pozzetto: modello del DNA: 20 ng (2 µ l), forward primer 200 nM (0,4 µ l di uno stock di 5 µM), reverse primer 200 nM (0,4 µ l di uno stock di 5 µM) , un commerciale pronto all'uso contenente colorante verde (5 µ l da uno stock di 2x) e H₂O a 10 µ l di miscela di reazione.
5. Eseguire in un dispositivo di qPCR di tempo reale, utilizzando la modalità di quantificazione assoluta e determinare il Ct dei campioni con le coppie di primer diversi. Calcolare il rapporto di recupero di DNA libero di DNA totale per ciascun primer utilizzando la seguente formula, tenendo conto dei fattori di diluizione dal punto 6.3:
   
   Risultati rappresentativi e un esempio di calcolo sono riportati nella tabella 2.
6. Per compensare le differenze tra i campioni, normalizzare il rapporto di recupero di controllo positivo:
   

Results

Abbiamo utilizzato il metodo FAIRE per misurare differenze nell'accessibilità della cromatina dei geni MHC classe II di HEK293T cellule come pubblicato¹⁹. Geni codificanti di MHC classe II sono espressi in antigene che presenta le cellule (APC), costitutivamente o in risposta a citochine segnalazione²⁰. L'espressione dei geni MHCII è guidato da un attivatore complesso che si lega a specifici elementi di DNA, chiamati scatole di XY, situati nel promotore e promotori di questi geni^21,22. Questo si riflette a livello della cromatina, come rivelato dalla nostra analisi FAIRE delle regioni selezionate i geni di MHC classe II HLA-DPB1 e HLA-DMA. Questi esperimenti hanno mostrato che quella della cromatina è aperta alle regioni che comprende le caselle di XY, mentre è più compatta nei corpi gene (Figura 2).

Ad esempio, per i calcoli, in questo particolare esperimento, abbiamo diluito totale campione di DNA 10 volte (fattore di diluizione 10), e il campione di DNA libero non è stato diluito (fattore di diluizione 1) per la qRT-PCR. Il Cts ottenuti per le diverse regioni testate e i calcoli per ottenere i rapporti di recupero finale e rapporti di recupero relativa sono elencati tabella 2. Questi rapporti di recupero relativa sono stati ottenuti utilizzando il promotore ACTB come controllo positivo. Si noti che questi calcoli sono per uno dei replicati utilizzati per generare i risultati mostrati nella Figura 2.

In un contesto diverso, l'accessibilità della cromatina è stato testato in un modello per l'espressione genica viscoelastica. In questo caso, rapidi cambiamenti di compattazione della cromatina in risposta al fattore di necrosi tumorale (TNF) di stimoli pro-infiammatori sono stati misurati. Cellule HeLa sono state lasciate non trattati o stimolate con TNF per 1 h, seguito da FAIRE per misurare la compattazione della cromatina presso l'espressione di controllo di regione promoter del gene che codifica per il TNF-sensible a reagire citochina interleuchina 8 (IL8). Questi risultati hanno mostrato un'accessibilità della cromatina fortemente aumentata al promotore IL8 di TNF-stimolato le cellule (Figura 3). L'accesso presso il promotore di IL-8 dopo stimolazione con TNF è addirittura superiore a quello trovato nel promotore ACTB mostrando un rimodellamento della cromatina drammatica in questa regione regolatrice. Come il rapporto di recupero ottenuto in questo caso è superiore a quello ottenuto nella regione di utilizzato come controllo positivo (promotore ACTB) il rapporto di recupero relativa è superiore a uno.

Figura 1: flusso di lavoro The FAIRE. Le cellule sono reticolati direttamente nel matraccio di cultura cellulare o piatto aggiungendo formaldeide (A). Dopo tempra della formaldeide, le cellule sono lavate tre volte con PBS freddo ghiaccio (B) e trasferite in una provetta di reazione dove vengono risospesi in tampone di lisi FAIRE e sonicati per inclinare il DNA (C). Un'aliquota della cromatina estratta è de-reticolato mediante riscaldamento a 65 ° C, per ottenere il riferimento del DNA totale (D), e in seguito il DNA libero viene estratto con il fenolo: cloroformio sia dal reticolato e le aliquote di de-reticolato (E). Infine, il DNA è quantificato, e il rapporto di gratis vs totale che DNA è calcolato (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: determinazione dell'accessibilità della cromatina nel gene del MHC classe II del cluster in cellule HEK293T. HEK293t cellule sono state analizzate da FAIRE. Il rapporto tra libero contro DNA totale (cioè., il rapporto di recupero relativa) è stata determinata per il promotore del gene di ACTB come controllo positivo, una regione di eterocromatina su Chr. 12 come controllo negativo e le regioni regolarici e organismi gene del MHC geni di classe II HLA-DMA e HLA-DPB1. La parte superiore mostra una rappresentazione schematica del locus e le posizioni dei primer. Barre di errore rappresentano deviazioni standard da due repliche biologiche misurati in triplici copie. La figura è stata modificata da un report pubblicato¹⁹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: modifiche dell'accessibilità del DNA presso il promotore IL8 in risposta al trattamento TNF. Cellule HeLa sono state stimolate con TNF (20 ng/mL) per 1 h e analizzati mediante FAIRE. Il rapporto tra libero contro total DNA è stato determinato per il promotore di ACTB (controllo positivo), una regione di eterocromatina su Chr. 12 (controllo negativo) e il promotore di IL8. Barre di errore rappresentano errori standard della media (SEM) da tre replicati biologici misurati in duplicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: ottimizzazione delle condizioni sonicazione. Cromatina estratta dalle cellule 293T era sonified utilizzando un sonicatore concentrato con tubi appropriati (Tabella materiali). La cromatina è stata sonicata per il tempo indicato con ripetizioni di 30 s con le seguenti impostazioni: potenza di picco 150, fattore 15, cicli al burst 500, seguita dalla potenza di picco 30 s: 2.5, fattore 15, cicli al burst 500. La cromatina risultante è stato de-reticolato, purificato dall'estrazione del fenolo: cloroformio e caricato in un gel di agarosio al 2%. Un macchiato gel di bromuro di etidio è mostrato, e le posizioni dei marcatori di peso molecolare sono indicate in bp. In questo esperimento, la dimensione ottimale della cromatina (200-300 bp) è stata ottenuta dopo 20 min di sonicazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Primer	Sequenza
ACTB-promotore-F	AAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-promotore-R	TTCCTCAATCTCGCTCTCGC
12. Chr. controllo negativo-F	ATGGTTGCCACTGGGGATCT
12. Chr. controllo negativo-R	TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-Box-F	CATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-Box-R	GCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-F	GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5'-R	AGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3'-F	TGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3'-R	AGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-Box-F	GTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-Box-R	TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-F	GCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-R	TGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3'-F	CCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-R	GCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Promotore-F	GTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Promotore-R	CTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabella 1: Primer per qPCR.

Tabella 2: esempio di calcolo dei rapporti di recupero relativi FAIRE. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

FAIRE è un metodo robusto e poco costoso che permette l'identificazione delle regioni indenni da nucleosoma. Si basa sul principio che il DNA avvolto intorno nucleosomi possa essere facilmente reticolato di istoni. Un'estrazione del fenolo: cloroformio viene utilizzata per separare i non reticolato e i frammenti di DNA privo di proteine dal DNA legato alle proteine, che si trova nella fase di fenolo inferiore e in una certa misura nel interphase (Figura 1). Di conseguenza, le regioni privo di nucleosomi sono sovrarappresentate nella frazione di DNA libero nella fase acquosa. Un numero di pubblicazioni descriva protocolli dettagliati del FAIRE metodo^23,24,25,26, che può essere consultata per completare la procedura descritta qui.

Simili ad altri metodi utilizzati per determinare la struttura della cromatina, il metodo FAIRE anche criticamente dipende dal taglio ottimale del DNA. Se i frammenti sono troppo lunghi, qualsiasi regione nucleosoma-free sarà mascherato dal DNA associato a cromatina adiacente. Se i frammenti sono troppo piccoli, il rilevamento di qPCR o sequenziamento profondo diventa molto difficile. Per questo motivo, la sonicazione del DNA è un parametro fondamentale che deve essere controllato e ottimizzato al fine di ottenere frammenti intorno 200-300 lunghezza di bp, che rappresentano 1-2 nucleosomi (Figura 4).

Un altro parametro che può influenzare il risultato finale è la reticolazione del campione. Anche se la procedura di fissazione qui descritta è valida per la maggior parte delle linee cellulari, il ricercatore deve valutare con attenzione questo passaggio per il particolare campione oggetto di studio, soprattutto quando si utilizzano tessuti, dove i tempi di fissazione più lunghi potrebbero essere necessari consentire il formaldeide per raggiungere le cellule in tutto il campione di tessuto.

A differenza di altri metodi, ad esempio dnasi I o ipersensibilità nucleasi di micrococcal, ChIP o ATAC, FAIRE non si basa su un'attività enzimatica o anticorpi specifici, e pertanto non necessita titolazione o ottimizzazione delle condizioni di reazione. Questo rende FAIRE un metodo ideale per misurare l'accessibilità della cromatina per laboratori con poca esperienza nel campo della cromatina. Inoltre, esperimenti pilota sono richiesti solo al fine di ottimizzare la fase di taglio del DNA e il tempo di reticolazione, quando necessario.

Il metodo è stato inizialmente sviluppato in lievito⁶, ma è stato esteso anche alle cellule di mammiferi. Il DNA purificato con il metodo FAIRE utilizzabile per sequenziamento profondo, che permette la caratterizzazione del genoma dello stato della cromatina. Questo ha già dimostrato utile in una serie di studi^{8,9,10,11,12,13,19,27, 28}.

Risultati da FAIRE-seq esperimenti mostrano un'ampia sovrapposizione con risultati ottenuti con altri metodi come ad esempio dnasi-seq¹⁴, anche se presentano alcune differenze. Ciò è dovuto le differenze metodologiche, come per esempio nucleosomi rilassati o ristrutturate ancora potrebbero ostacolare il clivaggio di dnasi I, mentre queste regioni di DNA sarebbero meno incline a produrre legami incrociati del DNA/proteine e così sarebbero state determinate come nucleosoma-free regioni con FAIRE⁹. Inoltre, la presenza di proteine non istoniche come polimerasi del RNA o proteine di lettore per segni epigenetici potrebbe comportare legami incrociati del DNA/proteine e così verrebbe interpretata come regioni più ricco di proteine FAIRE esperimenti. Queste limitazioni sono inerenti a ogni metodo utilizzato per la determinazione dello stato della cromatina, aumentando così la necessità di utilizzare una combinazione di diversi metodi per ottenere un quadro completo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fenolo:cloroformio:alcool isoamilico 25:24:1	Carl Roth	A156.1
Glicogeno, 20 mg/ml	Thermo Fisher	R0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox	Thermo Fisher	AB1162B
Proteinasi K, 20 mg/ml	Thermo Fisher	EO0491
RNasi A, 10 mg/ml	Thermo Fisher	EN0531
Leupeptin	Sigma	L8511
Aprotinin	Sigma	A1603
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)	Sigma	78830
milliTUBE 1 ml AFA Fiber	Covaris	520130
Holder milliTUBE 1ml	Covaris	500371
Covaris S220 Focalizzatore-ultrasuonatore	Covaris
Biosistemi applicati al	sistema di PCR in tempo reale StepOnePlus	4376600