La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.
Introduzione
Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.
1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)
- Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.
- Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verific.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell'attivazi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione dissociante cellulare non enzimatica | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Unguento | Dechra | 620300 | |
| 22G Catetere | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Sutura intrecciata in seta non assorbibile | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato | Corning | 21-031-CM | |
| Blocco Fc per mouse | BD Biosciences | 553142 | |
| Tampone di lisi (kit di RNA PureLink) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoetanolo | Millipore-Sigma | M6250 | |
| Selezionatore cellulare FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamina (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xilazina (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNasi I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μ filtro cellulare m | Corning | 352360 | |
| Blocco Fc umano | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Contacellule automatizzato Countess II | Thermo Fisher Scientific | ||
| Soluzione blu di tripano | Thermo Fisher Scientific | ||
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Siero fetale bovino | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| linea cellulare L-929 | Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillina/Streptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| Piruvato di sodio | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Pallone per coltura tissutale | Thermo Fisher Scientific | ||
| piatto di coltura da 60 mm | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Provetta conica | Corning | 352097 | |
| provetta conica da 50 mL | Corning | 352098 | |
| LSRControllo cellulare di erba | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Software di analisi |
| Anti-CD45 (Topo) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC coniugato |
| Anti-CD11b (Topo) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 coniugato |
| Anti-CD11c (Topo) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 coniugato |
| Anti-I-Ab (Topo) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 coniugato |
| Anti-Siglec-F (Topo) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 coniugato |
| Anti-Siglec-H (Topo) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE coniugato |
| Anti-F4/80 (Topo) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 coniugato |
| Anti-Ly-6C (Topo) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 coniugato |
| Anti-CD64 (Topo) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 coniugato |
| Anti-CD24 (Topo) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 coniugato |
| Anti-CD103 (Topo) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 coniugato |
| Anti-CD317 (Topo) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC coniugato |
| Anti-CXCR1 (Topo) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 coniugato |
| Anti-CD45 (Umano) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 coniugato |
| Anti-CD11b (Umano) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 coniugato |
| Anti-HLA-DR (Umano) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 coniugato |
| Anti-CD169 (Umano) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC coniugato |
| Anti-CD206 (Umano) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE coniugato |
| Anti-CD163 (Umano) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 coniugato |
Riferimenti
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages devel....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
