Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per fotoconversione di Kaede proteina fluorescente in cellule endocardial del vivente degli embrioni di zebrafish che consente il tracciamento delle cellule endocardial durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e del canale atrioventricolare .

Abstract

Durante l'embriogenesi, le cellule subiscono cambiamenti dinamici nel comportamento delle cellule e decifrare la logica cellulare dietro a questi cambiamenti è un obiettivo fondamentale nel campo della biologia dello sviluppo. La scoperta e lo sviluppo di proteine di fotoconvertibile hanno aiutato la nostra comprensione di questi cambiamenti dinamici fornendo un metodo per evidenziare otticamente cellule e tessuti. Tuttavia, mentre fotoconversione, time-lapse microscopia e analisi delle immagini successive hanno dimostrato di essere molto successo nel scoprire dinamica cellulare in organi come il cervello o l'occhio, questo approccio è generalmente non utilizzato nel cuore in via di sviluppo a causa sfide posate dal movimento rapido del cuore durante il ciclo cardiaco. Questo protocollo è costituito da due parti. La prima parte descrive un metodo per photoconverting e successivamente tracking endocardial cellule (EdCs) durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e zebrafish canale atrioventricolare (AVC). Il metodo prevede di fermare temporaneamente il cuore con un farmaco in ordine per fotoconversione accurata a prendere posto. I cuori sono permesso di riprendere pestaggio dopo l'estrazione della droga e lo sviluppo embrionale prosegue normalmente fino a quando il cuore è fermato di nuovo per l'imaging ad alta risoluzione di photoconverted CDE in un momento dello sviluppo più tardi. La seconda parte del protocollo descrive un metodo di analisi di immagine per quantificare la lunghezza di una regione photoconverted o non photoconverted in AVC in giovani embrioni mappando il segnale fluorescente dalla struttura tridimensionale su una mappa bidimensionale . Insieme, le due parti del protocollo permette di esaminare l'origine e il comportamento delle cellule che compongono il zebrafish AVC e valvola cardiaca atrioventricolare e potenzialmente può essere applicato per lo studio di mutanti, morphants o embrioni che sono stati trattati con reagenti che interrompono lo sviluppo AVC e/o la valvola.

Introduzione

Zebrafish è attualmente uno dei più importanti modelli vertebrati per studiare i processi cellulari e dello sviluppo in vivo. Ciò è in gran parte dovuto trasparenza ottica di zebrafish e disponibilità allo studio della genetica, che lo rende un potente modello per l'applicazione di tecniche ottiche che coinvolgono geneticamente codificato fotoresponsivi proteina tecnologie¹. Specifico per lo studio dello sviluppo del cuore, zebrafish ricevere sufficiente ossigeno tramite diffusione tale che persino mutanti senza battito cardiaco possono sopravvivere attraverso la prima settimana di sviluppo, permettendo analisi sugli effetti dei geni dello sviluppo e perturbato flusso sanguigno sulla morfogenesi del cuore non è possibile nella maggior parte dei vertebrati².

Il tubo di cuore di zebrafish è formato da 24 ore post fertilizzazione (hpf). Poco dopo la sua formazione, il tubo di cuore inizia a battere attivamente. Da 36 hpf, una costrizione chiara separa l'atrio dal ventricolo. Questa regione di costrizione è chiamata il canale atrioventricolare (AVC) e cellule in questo cambiamento di regione da una morfologia squamosa a morfologia cuboidali³. Inizia di zebrafish valvola atrioventricolare morfogenesi circa 48 h post fertilizzazione. Da 5 giorni post fecondazione, due opuscoli della valvola estendono l'AVC e impediscono il riflusso del sangue dal ventricolo all'atrio durante il ciclo cardiaco⁴. Rilevamento delle cellule durante la formazione AVC e valvola è impegnativo come il rapido battito del cuore, rende difficile seguire le cellule tramite microscopia time-lapse tradizionale^5,6. Questo protocollo, adattato da Steed et al., 2016⁷, descrive un metodo che utilizza la linea transgenica Tg (fli1a:gal4FF^ubs, UAS:kaede)⁸ zebrafish, in cui la proteina fotoconvertibile Kaede è espressa in cellule endoteliali, tra cui l'endocardio. La droga 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) viene utilizzato per interrompere temporaneamente il cuore battere, permettendo fotoconversione accurata di EdCs tra 36 e 55 hpf e imaging ad alta risoluzione di photoconverted EdCs intervalli di tempo inerente allo sviluppo specifico. Precedentemente è stato indicato che photoconverted di EdCs utilizzando questo metodo può rimanere distinguibili dai loro vicini non convertiti per cinque giorni o più dopo il tempo di fotoconversione⁷. Questo protocollo anche i dettagli di un metodo utilizzato per l'analisi di immagine di photoconverted CDE in embrioni più giovani di 48 hpf, che è stato usato con successo per seguire i movimenti dei tessuti durante lo sviluppo AVC (Boselli et al., in stampa)⁹. Speriamo che i lettori sarebbero trovare questo protocollo utile per lo studio di sviluppo AVC e valvola in embrioni normali e mutanti, morphants o embrioni droga trattato. Per un protocollo più generale relative al rilevamento delle cellule mediante fotoconvertibile proteine durante lo sviluppo di zebrafish, vedere l'articolo di Lombardo et al., 2012¹⁰.

Protocollo

1. preparazione di stampi e montaggio dell'agarosi

1. Creare uno stampo con le dimensioni riportate in Figura 1 utilizzando una stampante 3D o strumenti di officina meccanica tradizionale.
2. Pipettare circa 1,5 mL di agarosio all'1% fuso in un piatto di montaggio in plastica 35 mm. Posizionare lo stampo plastica in agarosio liquido, avendo cura di evitare di inglobare aria tra lo stampo e l'agarosio. Posizionare il piatto a 4 ° C, aspetta che indurisce l'agarosio (l'operazione dura circa 5 minuti), quindi rimuovere la muffa di plastica.
3. Per memorizzare il piatto di montaggio per un uso successivo, coprire il piatto con il suo coperchio, quindi avvolgere il piatto sia il coperchio ermeticamente con parafilm. Il piatto di montaggio possa quindi essere archiviato lato coperchio rivolto verso il basso fino a 5 giorni a 4 ° C.
4. Preparare in anticipo le aliquote di 1ml di 0,7% basso punto di fusione dell'agarosi in 1,5 mL provette Eppendorf da utilizzare il giorno del montaggio.
   Nota: I pozzi dell'agarosi del piatto montaggio si deformano nel tempo come acqua evapora se parafilm non si avvolge strettamente attorno i piatti.

2. ottenimento di embrioni per la fotoconversione

1. Zione il Tg (fli1a:gal4FF^ubs, UAS:kaede) linea e crescere di circa 200 embrioni nel mezzo di embrione al buio a 28,5 ° C. Per maggiori dettagli su come attraversare linee di zebrafish, consultare il Giove Science Education Database¹¹.
2. Dopo 5 h ma prima 24h, trattare gli embrioni con 1-fenil-2-tiourea (PTU) per prevenire la formazione di pigmento (0,003% PTU nel mezzo di embrione).
3. Circa 1 h prima dell'inizio di fotoconversione, embrioni di schermo sotto uno stereoscopio fluorescente e selezionare 5 embrioni sani che sembrano esprimere la fluorescenza verde più brillante. Luce a bassa intensità quando visualizzare gli embrioni si consiglia di evitare l'esposizione degli embrioni alla luce ambientale al fine di evitare photoconverting Kaede in cellule aspecifiche.

3. incorporare

1. Preparare 10 mL di supporti di montaggio: 0,02% tricaina e 50mm BDM nel mezzo di embrione.
2. Aggiungere 2 mL di mezzo di montaggio al montaggio piatto e consentire 15-30 min per la soluzione di diffondere in agarosio.
3. Nel frattempo, sciogliere un'aliquota di 1 mL di 0,7% basso punto di fusione (LMP) agarosio inserendo il tubo in un blocco di calore 70 ° C per circa 5 min.
   1. Attendere l'agarosio LMP raffreddare leggermente, quindi aggiungere 25 µ l di soluzione di tricaina 8 mg/mL e 40 µ l di soluzione 1M BDM al tubo del basso punto di fusione dell'agarosi. Mix pipettando su e giù, quindi trasferire il filmato a un blocco di calore di 38 ° C per mantenere l'agarosio LMP allo stato liquido.
4. In un Petri dish con il mezzo di embrione, attentamente dechorionate gli embrioni pre-selezionati sotto lo stereomicroscopio usando il forcipe, avendo cura di non per danneggiare gli embrioni.
5. Trasferire gli embrioni per un piatto separato contenente 2 mL di supporti di montaggio.
   1. Quando vengono interrotti i cuori degli embrioni (dura circa 5-10 min), trasferimento degli embrioni per il montaggio piatto e organizzare gli embrioni nei pozzetti utilizzando pinze, in modo che essi si trovano ad un angolo di 25 gradi, coda rivolta verso la parte più profonda del pozzo, tuorlo rivolto verso l'alto.
   2. Quando gli embrioni sono all'incirca in luogo, rimuovere il supporto, incorporare gli embrioni in ~ 200 µ l del 0,7% LMP agarosio contenente tricaina e BDM e riadattare le posizioni degli embrioni, inclinando gli embrioni a sinistra o a destra se necessario.
6. Attendere fino a quando i set di agarosio LMP (dura circa 5 minuti), quindi aggiungere mezzo di montaggio al piatto. Gli embrioni sono ora pronti per essere photoconverted.
   Nota: La tricaina e BDM sono usati per anestetizzare gli embrioni e per fermare il cuore degli embrioni, rispettivamente. Mezzi di montaggio possono essere preparata il giorno prima di formazione immagine, ma assicuratevi di proteggere il supporto dalla luce.
   Nota: Il corretto posizionamento degli embrioni è importante per consentire un percorso chiaro laser alle cellule si vuole fotoconvertita. Posizionare la testa dell'embrione vicino all'inizio del pozzo in modo che la luce laser non è necessario andare lontano per raggiungere l'embrione, e affinché gli embrioni possono essere facilmente smontati dopo fotoconversione.

4. fotoconversione

1. Un microscopio confocale in posizione verticale (come Leica SP8) equipaggiato con un 405 nm, 488 nm e sorgente 561 nm, individuare l'embrione di cuore utilizzando trasmesso luce bianca (campo chiaro) e una lente obiettiva (come Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 obiettivo). Verifica per fluorescenza rossa di Kaede utilizzando il 561 nm laser (cioè, laser DPSS 561, al ~ 5% di intensità, rivelatore a 589-728 nm). Quindi, è possibile visualizzare l'endocardio utilizzando laser 488 nm (cioè, 30 mW laser di Argon su più righe a ~ 5% intensità, rivelatore a 502-556 nm).
2. Entrare in modalità "FRAP" del software di acquisizione di microscopio. Selezionare la potenza del laser ~ 1% per entrambi 488 nm e 561 nm laser.
3. Concentrarsi sul piano di interesse, selezionare una regione di interesse (ROI), poi fotoconvertita cellule usando il diodo 405 nm laser a potenza laser 25%, tre tempi di scansione sopra il ROI. Kaede insufficiente va photoconverted nel ROI, scansione laser 405 nm sopra la zona tre volte ancora. Ripetere questo passaggio per tutti i ROIs.
4. Tornare alla modalità "TCS SP8" sul software e acquisire un z-stack, utilizzando il 561 nm e 488 nm laser in sequenza. Assicurarsi di selezionare l'opzione 'bidirectional' per aumentare la velocità di formazione immagine.
   Nota: Quanto tempo ci vuole per fotoconvertita e immagine che ogni embrione varia. Battito cardiaco è conosciuto per essere importante per lo sviluppo di valvola del cuore normale, quindi evitare di tenere il cuore si è fermato per più di 30 min, anche se questo significa che non hai tempo per fotoconvertita 5 tutti gli embrioni.
   Nota: Durante il processo di fotoconversione, uso PMT rivelatori, mentre dopo fotoconversione, si consiglia di utilizzare rilevatori di ibrido impostati su modalità di conteggio. Infatti, i rivelatori di ibridi sono più sensibili e sono in grado di produrre immagini di qualità migliore, ma possono essere facilmente danneggiati da sovresposizione.

5. Smontare gli embrioni photoconverted

1. Dopo fotoconversione, utilizzare una pipetta di vetro premere verso il basso leggermente appena sopra la testa dell'embrione per rompere l'agarosio LMP, quindi aspirare delicatamente l'embrione.
   1. Espellere l'embrione dalla pipetta di vetro in una capsula Petri 35 mm contenente mezzo di embrione con PTU (per lavare via BDM contenente mezzo).
   2. Trasferimento dell'embrione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti embrioni mezzo con PTU. Durante questo passaggio, assicurarsi di tenere nota di quali embrione entra in che bene, come questo è essenziale per correlare la posizione delle cellule photoconverted alle versioni successive fasi di sviluppo.
2. Ora che gli embrioni vengono rimossi dal mezzo contenente BDM, loro cuori dovrebbero iniziare a battere nuovamente in circa 5 min ritorno embrioni al buio a 28,5 ° C per permettere embrioni continuare a svilupparsi normalmente.

6. imaging photoconverted cellule al più tardi stadi embrionali

1. Nella fase desiderata, fermare il cuore e ri-incorporare gli embrioni come sotto punto 3 del presente protocollo, con l'importante differenza che gli embrioni devono essere trattati con BDM in piatti separati, contrassegnati per tenere traccia di embrioni.
2. Per gli embrioni fino a 62 hpf, acquisire z-stack dell'endocardio utilizzando 561 nm e 488 nm per rosso e verde fluorescente segnali, rispettivamente. Per embrioni a livelli oltre 62 anni hpf, utilizzare un multifotonica laser insieme a 940 nm all'immagine verde Kaede invece il laser 488 nm.

7. image analysis per embrioni sotto il 48 hpf

Nota: I movimenti del tessuto dell'AVC possono essere difficili da analizzare grazie alla sua struttura tridimensionale complessa. Per quantificare la lunghezza di una regione di photoconverted in AVC tra due regioni di non-photoconverted o la lunghezza di una regione di non-photoconverted in AVC tra due regioni di photoconverted, può essere desiderabile per mappare la struttura tridimensionale su un mappa bidimensionale. Immagini di photoconverted embrioni ottenuti prima del 48 hpf possono essere analizzati usando il seguente metodo.

1. Importare le immagini acquisite in Matlab o software simili.
2. Delimitare manualmente il ROI, cioè l'endocardio e applicare una maschera per rimuovere il segnale fuori di questa regione.
3. Applicare una soglia di intensità sull'immagine per individuare i punti sull'endocardio e tracciarle in tre dimensioni. Isolare i punti corrispondenti alla parte più stretta e più dritta di AVC, cancellando manualmente i punti di nessun interesse sull'atrio ed il ventricolo utilizzando il comando Cancella nel software.
4. Utilizzare un cilindro per adattare i punti che rappresentano l'AVC così ottenuto.
5. Definire un sistema di riferimento per confrontare diversi campioni. Ad esempio, è possibile adottare il centro di massa dei punti AVC come l'origine del sistema di riferimento e l'asse del cilindro montato come l'asse z.
   1. Assicurarsi che il positivi z-posizioni corrispondono sempre sullo stesso lato del cuore (ventricolare o atriale).
   2. Proiettare i punti AVC sul piano x-y e utilizzare un'ellisse per farli stare.
   3. Ruotare i punti endocardial intorno all'asse z in modo che l'asse maggiore dell'ellisse e l'asse y del sistema di riferimento sono paralleli e y-valori positivi corrispondono al lato interno dell'AVC per quanto riguarda l'embrione.
6. Per segmentare l'AVC, tagliare il dataset tridimensionale con alcuni aerei ottenuti ruotando il semipiano {y = 0, x > 0} in direzione z.
   1. L'intensità dei pixel adiacenti del progetto su questi aerei e definire l'endotelio in modo coerente. Ad esempio, disegnare manualmente una linea da atriale al lato ventricolare dell'AVC a metà dello spessore dell'endotelio.
   2. Interpola i punti delle linee che rappresentano l'endotelio con una spline tridimensionale utilizzando la casella degli strumenti spline per rappresentare l'AVC con una superficie.
      Nota: Il numero dei piani di taglio determina sia l'accuratezza della segmentazione e il consumo di tempo di questo passaggio. Di solito, 8 aerei sono sufficienti per ottenere buoni risultati.
7. Definire la posizione azimutale di ogni punto sulla superficie AVC utilizzando coordinate cilindriche.
   1. Ad ogni posizione azimutale è possibile definire una curva parametrica lungo la superficie dell'AVC calcolando la lunghezza dell'arco sulla superficie tra punti consecutivi.
   2. Per ogni curva parametrica, definire il punto sulla curva più vicina al centro di AVC a zero. I punti dell'AVC sono così completamente descritto dalla loro posizione azimutale e loro posizione sulla curva parametrica.
8. Spiegare l'AVC in un'immagine bidimensionale utilizzando la posizione parametrica dei punti.
9. Trovare i bordi dell'area da quantificare come i bordi della soglia di immagine binaria il rapporto tra le intensità dei photoconverted e i canali non-photoconverted. Se necessario, correggere manualmente il risultato.
10. Calcolare la lunghezza dell'arco tra i bordi per calcolare la lunghezza del tessuto in funzione della posizione azimutale.

Risultati

Un esempio di un embrione photoconverted 48 hpf e ripreso nuovamente a 80 hpf è illustrato nella Figura 2, film 1 e 2. Esponendo Kaede a 405 nm luce irreversibilmente converte dalla proteina dalla sua forma verde fluorescente fluorescente rosso forma, consentendo il comportamento delle cellule identificate con il verde o loro forma rosso da seguire con rispettano alla loro differenzialmente colorata vicini di casa durante la ...

Discussione

Temporizzazione di fotoconversione: Kaede anche se rimane brillantemente espressa in EdCs anche a 96 hpf, va notato che l'embrione cresce, luce laser diffonde più prima che raggiunga l'AVC, rendendo più difficile la fotoconversione ristretti di Kaede. At embrionale fasi oltre 55 hpf, la mongolfiera del ventricolo e l'atrio significa anche che il raggio laser viola utilizzato per fotoconversione non può raggiungere le cellule AVC senza passare per l'atrio o ventricolo. Ciò significa che oltre 55 hpf, al fine di f...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali
Attrezzatura necessaria per allevare pesci e raccogliere uova (vedi il Zebrafish Book22 per i dettagli).
Stereomicroscopio
Microscopio confocale verticale (Dotato di laser operanti a 488 nm, 561 nm e 405 nm, un laser multifotone sintonizzabile e un obiettivo Leica HCX IRAPO L, 25 volte, N.A. 0,95)	Leica	Leica SP8
Blocco termico	ThermoScientific	88870001
35 mm x 10 mm Piatto per coltura tissutale	Falcon	353001
Piastra a 6 pozzetti	Falcon	353046
Petri
Pinze Pipetta
			in vetro
Stampo
Reagenti
8 mg/mL Soluzione madre di tricaina
1 M Soluzione
Agarosio ultrapuro a basso punto di fusione	Invitrogen	16520-050
Agarosio	Lonza	50004
PTU (1-fenil-2-tiourea)	Sigma Aldrich	P7629
Terreno embrionale: 30x soluzione
Software
Matlab dotato di strumenti per l'analisi delle immagini, l'adattamento della curva, i bioformati	MathWorks
8 mg/mL Soluzione madre di tricaina
200 mg di tricaina in polvere (acido etil-3-amminobenzoato metansolfonico)	Sigma-Aldrich	E10521
25 mL Danieau
Regolare a pH 7, aliquotare e conservare a -20 gradi C
1 M Soluzione madre BDM
1 g BDM	Sigma-Aldrich	112135
10 mL ddH2O
Aliquotare e conservare a -20 ° C
Embryo medium: 30x soluzione madre
50,7 g NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
0,78 g KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
1,47 g Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	7487-88-9
2,1 g Nitrito di calcio tetraidrato	Sigma-Aldrich	13477-34-4
19,52 g HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico)	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Regolare a pH 7,2 e conservare a temperatura
Mold
PlasCLEAR resina	Asiga
Plus 39  Stampante 3D Pico a forma libera	Asiga

madre BDM madre ambiente