Articolo metodologico

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

DOI:

10.3791/57322

⸱

6 maggio 2018

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1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Abstract

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Formazione di biofilm è un processo dinamico, multistadio che avviene nei batteri in condizioni ambientali difficili o periodi di stress. Per gli agenti patogeni enterici, una risposta di stress significativo è indotta durante il transito gastrointestinale e all'esposizione di bile, un normale componente di digestione umana. Per superare gli effetti battericidi di bile, molti agenti patogeni enterici formano un biofilm supposto per consentire la sopravvivenza durante il transito attraverso l'intestino tenue. Qui presentiamo metodologie per definire la formazione di biofilm tramite analisi di fase solida adesione così come rilevamento di matrice extracellulare sostanza polimerica (EPS) e la visualizzazione. Inoltre, valutazione di dispersione di biofilm è presentato per imitare l'analisi degli eventi provoca il rilascio di batteri durante il processo di infezione. Colorazione viola di cristallo viene utilizzato per rilevare batteri aderenti in un'analisi di aderenza ad alta velocità piastra a 96 pozzetti. Valutazione di produzione di EPS è determinato da due saggi, vale a dire la microscopia macchiatura della EPS matrice e analisi semi-quantitativa con una lectina legante il polisaccaride coniugato fluorescente. Infine, dispersione di biofilm è misurata attraverso Colonia conteggi e placcatura. Dati positivi da saggi multipli supportano la caratterizzazione di biofilm e possono essere utilizzati per identificare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in altri ceppi batterici.

Introduzione

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Formazione di biofilm è una strategia di sopravvivenza batterica importante indotta durante condizioni ambientali difficili. L'esposizione ai composti battericide come antibiotici o cambiamenti di sostanza nutriente o disponibilità di ossigeno induce uno stato sollecitato nei batteri che possono essere alleviati attraverso la formazione di biofilm. Un biofilm è caratterizzato da batterica allegato ad una superficie o altri batteri ed è accompagnato dalla secrezione di una matrice EPS composta principalmente da polisaccaridi1,2,3. Formazione di biofilm è un processo dinamico, ....

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Protocollo

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1. preparazione dei reagenti

  1. Sali biliari medio: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente sali biliari 0,4% (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 mL di TSB in autoclave. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fare fresco medio settimanale.
    Note: I sali biliari ordinariamente utilizzati è una miscela di 1:1 di sodio colato e sodio desossicolato isolato dalle cistifellea ovine e bovina. Come dimostrato in precedenza4, la presenza di glucosio è stato richiesta per la formazione di biofilm indotta da sali biliari. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo di Luria-Bertani (LB); e quindi, er....

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Risultati

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In Figura 1, formazione del biofilm è indotto nella maggior parte della crescita seguente testata sei patogeni enterici in media che contengono i sali biliari. Un aumento significativo nei batteri aderenti dopo esposizione di sali biliari è osservata in quasi tutti i ceppi testati. L'eccezione è ed Escherichia coli (CEEA); si noti, tuttavia, l'osservazione indotta del Δaaf mutante4. I risultati indicano che .......

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Discussione

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Analisi della formazione di biofilm è impegnativo a causa della natura dinamica del biofilm e la variabilità tra i ceppi, materiali, laboratori e le analisi. Qui, diverse strategie sono presentate per determinare la formazione di biofilm in patogeni enterici dopo esposizione di sali biliari con intuizione sperimentale fornito per promuovere la riproducibilità. Ci sono considerazioni aggiuntive per garantire la riproducibilità. Innanzitutto, si consiglia di eseguire almeno tre indipendenti esperimenti ciascuno con triplic.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-Chea per assistenza tecnica. Ringraziamo Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil per i ceppi utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Allergy e Grant K22AI104755 di malattie infettive (C.S.F). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Brodo di soia tripticoSigma-Aldrich22092-500G
Crystal VioletSigmaC6158-50
Concanavalin-A FITCSigmaC7642-10mg
GlucosioSigmaG7021-1KG
Sali biliariSigmaB8756-100G
LB AgarSigmaL7533-1KG
Provette per coltura da 14 mL, 17 x 100 mm, plastica, steriliFisher14-959-11B
Vectashield hard-set antifade con DAPIVector LaboratoriesH-1500
FormaldeideSigma-AldrichF1635-500
GluteraldeideSigma-AldrichG6257
Piastre a 96 pozzetti a fondo piatto (trasparenti)TPP92696
Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti (nere)Greiner Bio-One655076
Piastre a fondo piatto a 24 pozzetti (trasparenti)TPP92424
Vetrini coprioggetti in vetro 12 mm, rotondiFisher08-774-383
Lettore di piastre a 96 pozzettiSpectramax
Lettore di piastre fluorescentiBiotek Synergy 2
Confocale o fluorescente MicroscopioNikon A1 microscopio confocale
37° C Incubatore a scuotimentoNew Brunswick Scientific Excella E25
37° Incubatore a piastre CThermolyne Serie 5000

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R....

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Biofilm da sali biliariColorazione con cristal violettoRilevazione di EPSDispersione del biofilmConta delle colonieSaggio con lectine fluorescentiSaggio in piastra a 96 pozzettiIncubazione staticaLavaggio con PBS

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