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Immunology and Infection

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Published: May 06, 2018
doi:
10.3791/57322
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,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l’aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Abstract

Formazione di biofilm è un processo dinamico, multistadio che avviene nei batteri in condizioni ambientali difficili o periodi di stress. Per gli agenti patogeni enterici, una risposta di stress significativo è indotta durante il transito gastrointestinale e all’esposizione di bile, un normale componente di digestione umana. Per superare gli effetti battericidi di bile, molti agenti patogeni enterici formano un biofilm supposto per consentire la sopravvivenza durante il transito attraverso l’intestino tenue. Qui presentiamo metodologie per definire la formazione di biofilm tramite analisi di fase solida adesione così come rilevamento di matrice extracellulare sostanza polimerica (EPS) e la visualizzazione. Inoltre, valutazione di dispersione di biofilm è presentato per imitare l’analisi degli eventi provoca il rilascio di batteri durante il processo di infezione. Colorazione viola di cristallo viene utilizzato per rilevare batteri aderenti in un’analisi di aderenza ad alta velocità piastra a 96 pozzetti. Valutazione di produzione di EPS è determinato da due saggi, vale a dire la microscopia macchiatura della EPS matrice e analisi semi-quantitativa con una lectina legante il polisaccaride coniugato fluorescente. Infine, dispersione di biofilm è misurata attraverso Colonia conteggi e placcatura. Dati positivi da saggi multipli supportano la caratterizzazione di biofilm e possono essere utilizzati per identificare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in altri ceppi batterici.

Introduction

Formazione di biofilm è una strategia di sopravvivenza batterica importante indotta durante condizioni ambientali difficili. L’esposizione ai composti battericide come antibiotici o cambiamenti di sostanza nutriente o disponibilità di ossigeno induce uno stato sollecitato nei batteri che possono essere alleviati attraverso la formazione di biofilm. Un biofilm è caratterizzato da batterica allegato ad una superficie o altri batteri ed è accompagnato dalla secrezione di una matrice EPS composta principalmente da polisaccaridi1,2,3. Formazione di biofilm è un processo dinamico, in cui una cascata di eventi culmina nella formazione di una comunità batterica aderente matura1,2,3. I batteri producono adesine per facilitare il collegamento iniziale mentre spostando adesina profili di espressione genica per rafforzare allegato durante la maturazione del biofilm. Simultaneamente, produzione di EPS avviene a cappotto della comunità batterica in una matrice a proteggere le cellule dal fattore di sforzo iniziale. I batteri contenuti all’interno del biofilm sono a crescita lenta; e come tale, rende la maggior parte degli antibiotici inefficaci. Inoltre, la lenta crescita conserva l’energia fino a quando le condizioni cambiano per favorire la crescita batterica1,2,3. Dopo aver passato le dure condizioni, batteri disperdono il biofilm e riprendere un stile di vita planctonico1,2,3. Tradizionalmente, i biofilm sono osservati sulle superfici e rappresentano una sfida clinica persistente a causa di serbatoi di infezione presente su cateteri e dispositivi di in-abitazione1,2,3.

Formazione di biofilm recentemente è stato descritto per parecchi agenti patogeni enterici; batteri che infettano il piccolo intestino o del colon4. Per specie Shigella , l’infezione si verifica nel colon umano dopo un transito attraverso la maggior parte del tratto gastrointestinale. Durante il passaggio attraverso l’intestino tenue, Shigella è esposto alla bile; un detergente del lipido-degradanti secernuto nell’intestino per facilitare la digestione dei lipidi mentre simultaneamente uccidendo la maggior parte dei batteri5. Patogeni enterici hanno una capacità unica di resistere agli effetti battericidi di bile6. La nostra analisi recenti utilizzati in vivo-come combinazioni di glucosio e sali biliari per dimostrare la formazione di biofilm robusto in S. flexneri , nonché altre specie di Shigella, patogeni di Escherichia colie Salmonella4. In precedenza, serovar di Salmonella enterica Typhi è stato indicato per formano un biofilm indotta da bile a causa di colonizzazione unico della cistifellea durante l’infezione cronica7,8,9, 10. Inoltre, previa ricerca con Vibrio11e Campylobacter12 ha dimostrato la formazione di biofilm in risposta alla bile. Di conseguenza, le analisi estese le osservazioni di formazione di biofilm bile-indotta di altri agenti patogeni e contribuiscono a stabilire la dimostrazione di una risposta di agente patogeno enterico conservata alla bile. A differenza di biofilm cronico in cui trascrizione genica batterica è limitato e senescenza cellulare può verificarsi1,2,3, proponiamo che il biofilm enterico bile-indotta è più di natura transitorio. Questo transitorio, virulento biofilm è caratterizzato da un rapido smontaggio (come visto nell’analisi della dispersione) e ha migliorato l’espressione di gene di virulenza osservato in biofilm popolazione4,6. 

Come formazione di biofilm è un processo dinamico e poliedrico e l’uso dei sali di bile come un fattore d’inizio è stato solo recentemente descritto per patogeni enterici più, gli strumenti e le tecniche utilizzate sono applicazioni uniche e creative dei metodi tradizionali. Così, qui presentati sono gratuite tre strategie per quantificare le diverse caratteristiche importanti della formazione di biofilm indotta da sali biliari, inclusa l’adesione batterica, produzione della matrice EPS e dispersione di batteri vitali dal biofilm. Queste tecniche sono state utilizzate principalmente per la ricerca con Shigella; e pertanto, la valutazione di altri patogeni enterici può richiedere ottimizzazione. Tuttavia, dati positivi da tutti i tre saggi supportano l’identificazione del biofilm e stabilire protocolli riproducibile per la formazione di biofilm indotta da sali biliari.

Protocol

1. preparazione dei reagenti Sali biliari medio: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente sali biliari 0,4% (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 mL di TSB in autoclave. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fare fresco medio settimanale.Note: I sali biliari ordinariamente utilizzati è una miscela di 1:1 di sodio colato e sodio desossicolato isolato dalle cistifellea ovine e bovina. Come dimostrato in precedenza4, la presenza di glucosio è stato richiesta per la formazione di biofilm indotta da sali biliari. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo di Luria-Bertani (LB); e quindi, era sufficiente per indurre la formazione di biofilm in Shigella e gli agenti patogeni enterici analizzati. A seconda i batteri per essere analizzati, le concentrazioni differenti di glucosio o zucchero diversi requisiti potrebbero essere necessario. 0,5 viola di cristallo % p/v in acqua: sciogliere 2,5 g di cristalvioletto in 500 mL di acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Concanavalina A (ConA) coniugata con isotiocianato di fluorescina (FITC): ricostituire lo stock in PBS 1X. Diluire il brodo 10 mg concentrato con 400 μL di PBS 1X a una concentrazione finale di 25 µ g/mL e proteggerlo dalla luce. PBS + glucosio: Sciogliere 0,2 g di glucosio in 10 mL di PBS 1X (finale del glucosio di 2% w/v). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo. PBS + sali biliari: Sciogliere 40 mg in 10 mL di PBS 1X (0,4% w/v i sali biliari finali). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo. PBS + glucosio e sali biliari: sciogliere sali biliari 40mg e 0,2 g di glucosio in 10 mL di PBS 1X (2% w/v glucosio finale e sali biliari di 0,4% w/v). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo. Preparare piatti agar della libbra. Correzione di formaldeide/glutaraldeide: 810 aggiungere µ l formaldeide (soluzione di riserva del 37%, 3% concentrazione finale) e 125 glutaraldeide µ l (soluzione di riserva del 25%, 0,25% concentrazione finale) a 14 mL di PBS 1X. Mescolare accuratamente e conservare a 4 ° C. La correzione dovrebbe essere fredda per un uso corretto.Attenzione: La correzione è tossica e richiede lo smaltimento di rifiuti pericolosi. Montante Antifade soluzione: utilizzare il montante antifade soluzione contenente 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchia per inibizione di photobleaching di campioni immunofluorescente microscopia fluorescente macchiando il DNA dei batteri. 2. preparazione di batteri Crescere una notte colture di ceppi batterici per essere testata inoculando 3 mL di TSB con una colonia singola, ben isolata in un tubo di coltura sterile. Incubare a 37 ° C con agitazione a 225 giri/min per incubazione overnight (16-24 h).Nota: Ceppi dovrebbero essere restreaked dalle scorte congelatore ogni 2 a 4 settimane e mantenuto su piastre non più di 2 settimane di vita. 3. fase solida aderenza Assay Nota: Questo test quantifica aderenti batteri utilizzando un metodo di piastra a 96 pozzetti. I batteri sono coltivati in modo statico nelle piastre di fondo piatto. Lavaggio viene eseguito per rimuovere i batteri non aderente e batteri aderenti sono macchiati con la viola di cristallo. La macchia viola di cristallo lega peptidoglicano nella parete cellulare batterica e possa essere solubilizzata utilizzando etanolo. Il numero di batteri aderenti è determinato basato sulla conservazione di cristallo viola. Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + sali biliari (BS). Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette. Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione). In una piastra a 96 pozzetti sterile, chiara, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto (TSB e TSB + BS) per essere testato. Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata in tre pozzi e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia. Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico. Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come ‘vuoto’. Confermare che il mezzo di controllo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l’esperimento. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati, se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra ceppi batterici. Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea del vuoto delicatamente inclinando la piastra e aspirando lentamente il mezzo al bordo più basso del pozzo. Essere sicuri di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione batterica aderente situata sulla superficie di plastica. Se la matrice EPS è stato prodotto durante il periodo di incubazione, la matrice verrà visualizzata come un precipitato bianco. Non disturbare la matrice EPS. Lavare delicatamente i pozzetti una volta con 200 µ l di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto. Capovolgere la piastra ad asciugare. Consentire un minimo di 20 minuti ad asciugare.Nota: Poiché i biofilm deve essere completamente asciutto prima della colorazione, il protocollo può essere sospesa a questo punto per un paio d’ore o anche durante la notte. Il tempo di asciugatura aggiunto non modificherà la procedura di colorazione mentre essiccazione incompleta influenzerà la quantificazione dei risultati e riproducibilità. Aggiungere 150 µ l di cristalvioletto 0,5% per ogni sperimentale e controllo bene. Incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA). Lavare i pozzetti una volta con 400 µ l di acqua distillata. Il volume aggiunto aiuta a rimuovere residui cristalvioletto macchia dai lati dei pozzi. Rimuovere il lavaggio con la linea del vuoto. Lavare i pozzetti 5 volte con 200 µ l di acqua distillata. Rimuovere il lavaggio con la linea del vuoto.Nota: Lavaggio accurato è importante per la quantificazione. Quando i pozzetti del bianco sono chiaro dall’acqua distillata e non contengono alcun residuo cristalvioletto macchia, procedere al passaggio successivo. Capovolgere la piastra a secco, al riparo dalla luce. Garantire la completa asciugatura della piastra come indicato in precedenza. Decolorare i pozzetti con 200 µ l di etanolo al 95%. Incubare la piastra sull’agitatore per 30 min. Per evitare l’evaporazione, specialmente alle più alte temperature, eseguire questo passaggio a 4 ° C. Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD540.Nota: La lunghezza d’onda per assorbanza massima della viola di cristallo è vicino a 590 nm. La letteratura segnala una gamma da OD540 – OD5954,13,14,15,16 per assorbanza viola di cristallo; così scegliere una lunghezza d’onda disponibile basata su lettore della piastra. 4. EPS Matrix Detection Nota: Questi saggi gratuiti quantificare e visualizzare l’EPS. In entrambi, EPS viene rilevata utilizzando una lectina associare polisaccaridi. La proteina fluorescente coniugati permette di quantificazione (punto 4.1) o visualizzazione (punto 4.2). Determinazione semi-quantitativa del EPS Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS. Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette. Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (un 01:50 diluizione). In una piastra a 96 pozzetti sterile, nera, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto essere testato. Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata nei pozzetti e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia. Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico. Trasferire il terreno di coltura per una piastra a 96 pozzetti chiaro con una pipetta, idealmente una pipetta multicanale. Prestare attenzione a raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione aderente e/o l’EPS si trova sulla superficie di plastica. Mettere da parte. Fissare la piastra nera per 15 min a RT utilizzando 200 µ l/pozzetto di formaldeide/glutaraldeide in 1X PBS. Mentre la popolazione aderente è fissa, valutare il surnatante dal punto 4.1.6. Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come ‘vuoto’. Confermare che il mezzo di controllo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l’esperimento. In alternativa, il dosaggio intero può essere effettuato in un piatto fondo chiaro nero. Ciò premesso, i valori di600 OD possono essere registrati e il terreno di coltura può essere successivamente scartato prima di procedere al passo 4.1.7. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati nel caso non ci sono differenze significative nel tasso di crescita fra ceppi batterici. La correzione di rimuovere e smaltire nei rifiuti pericolosi. Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto delicatamente inclinando la piastra e aspirando lentamente il lavaggio al bordo più basso del pozzo. Aggiungere 150 µ l/pozzetto di 25 µ g/mL ConA-FITC e incubare per 15 minuti a TA. Lavare delicatamente due volte con 200 µ l di PBS. Aggiungere 150 µ l di PBS in ciascun pozzetto. Registrare la fluorescenza a 488 nm. Visualizzazione di microscopia confocale della produzione di EPS e calcolo dello spessore del biofilm Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS. Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette. Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione). Impostare una piastra a 24 pozzetti sterile con 12 mm sterili round vetrini coprioggetti. Aggiungere 400 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto essere testato. Aggiungere 400 µ l della coltura inoculata a pozzetti in duplicato e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate. Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico. Non confermare visivamente crescita nella condizione TSB, crescita ed EPS precipitato (bianco) nel TSB + condizione BS e nessuna crescita e/o precipitato bianco nei pozzetti di controllo sterile. Rimuovere i sovranatante. Difficoltà per 15 min a RT utilizzando 200 µ l/pozzetto di soluzione di formaldeide/glutaraldeide in 1X PBS. Rimuovere la correzione e lo smaltimento dei rifiuti pericolosi. Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto. Aggiungere 150 µ l/pozzetto di 25 µ g/mL ConA-FITC e incubare per 15 minuti a TA. Lavare delicatamente due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS. Montare con montante antifade soluzione con DAPI.Nota: La soluzione è una soluzione di montaggio Ready-Made, basati su glicerolo contenenti DAPI per preservare l’etichetta fluorescente mentre simultaneamente macchiando il DNA nelle cellule batteriche per la visualizzazione come un colorante di contrasto. Seguire le indicazioni e le raccomandazioni del kit per tempi di incubazione prima campioni di imaging. La procedura di colorazione DAPI può essere eseguita prima di applicare la soluzione antifade mountant non contenente DAPI. Valutare mediante microscopia confocale. Su un microscopio confocale, impostare il laser nm/519 eccitazione 495 nm/emissione per visualizzazione FITC. Impostare un secondo laser 360 nm/460 nm eccitazione/emissione di visualizzare DAPI. Individuare il biofilm focalizzando l’attenzione sul canale DAPI. Utilizzare canali DAPI sia FITC per determinare lo spessore completo e impostare superiore e inferiore di imaging confini. Registrare immagini di spessore completo dello stack Z catturando immagini ogni 0,25 µm dopo avere impostato i perimetri di parte superiore e inferiore dello z-stack. Per ulteriori informazioni su microscopia confocal, fare riferimento alle pubblicazioni di Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20 Ricostruire le immagini 3D in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) per visualizzare la formazione di biofilm completo e calcolare lo spessore del biofilm. Lo spessore medio ottenuto per S. flexneri sale biliare indotto biofilm era 14 µm4. 5. la dispersione Assay Nota: In questa analisi, lo smontaggio del biofilm attraverso dispersione batterica viene rilevato. Qui, i biofilm maturi sono stabiliti e successivamente (solitamente il giorno successivo), i media vengono sostituiti con PBS o completati PBS. Il surnatante componente è poi valutato per quantificare il numero di batteri che hanno dissociato dal biofilm. Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS. Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette. Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione). In una piastra a 96 pozzetti sterile, chiara, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto per essere testato. Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata tre pozzi e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia. Incubare la piastra per 4-24 h a 37 ° C in modo statico. Prima di continuare, caldo PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio a 37 ° C. Preparare questi quotidiano fresco di reagenti. Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come ‘vuoto’. Confermare che il mezzo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l’esperimento. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati, se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra ceppi batterici. Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea del vuoto. Essere sicuri di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione aderente situata sulla superficie di plastica. Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto. Sostituire il lavaggio con 130 µ l/pozzetto di in tre pozzi ogni quanto segue: PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio. Questi reagenti devono essere pre-riscaldati a 37 ° C. Incubare la piastra per 30 min a 37 ° C. Rimuovere delicatamente la piastra dall’incubatore 37 ° C. Trasferire i surnatanti di una piastra a 96 pozzetti sterile, fresca. Utilizzando un blocco di piastra o diluizione di 96 pozzetti, preparare 10 volte (01:10) diluizioni seriali del surnatante in PBS sterile.Nota: La serie di diluizione dovrebbero variare da non diluito a 10-6 a seconda del ceppo batterico per essere testato. Esperimenti pilota possono essere eseguiti per determinare l’intervallo di diluizione ottimale. Posto tavola 5 µ l di ciascuna diluizione su LB agar usando una pipetta multicanale. Incubare a 37 ° C durante la notte. Contare le colonie sul conto per il fattore di diluizione e di giorno successivo quando si determina il recupero unità formanti colonia (UFC). Per calcolare la dispersione percentuale rispetto la 1 x controllo PBS (impostato al 100%), dividere il recupero CFU da ciascuna condizione di trattamento di recupero CFU dal campione di controllo di PBS 1X.Nota: Piastre di media di Routine per il ceppo batterico di interesse possono anche essere utilizzati. Ad esempio, Shigella può essere placcato sulle piastre di colore rosso di Congo. Assicurarsi che le piastre siano asciutte per tecniche appropriate di posto-placcatura.

Representative Results

In Figura 1, formazione del biofilm è indotto nella maggior parte della crescita seguente testata sei patogeni enterici in media che contengono i sali biliari. Un aumento significativo nei batteri aderenti dopo esposizione di sali biliari è osservata in quasi tutti i ceppi testati. L’eccezione è ed Escherichia coli (CEEA); si noti, tuttavia, l’osservazione indotta del Δaaf mutante4. I risultati indicano …

Discussion

Analisi della formazione di biofilm è impegnativo a causa della natura dinamica del biofilm e la variabilità tra i ceppi, materiali, laboratori e le analisi. Qui, diverse strategie sono presentate per determinare la formazione di biofilm in patogeni enterici dopo esposizione di sali biliari con intuizione sperimentale fornito per promuovere la riproducibilità. Ci sono considerazioni aggiuntive per garantire la riproducibilità. Innanzitutto, si consiglia di eseguire almeno tre indipendenti esperimenti ciascuno con tri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-Chea per assistenza tecnica. Ringraziamo Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil per i ceppi utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Allergy e Grant K22AI104755 di malattie infettive (C.S.F). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000
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References

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Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).
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