Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Summary

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Abstract

Bioelettricità, elettrico di segnalazione endogena mediata dai canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare, svolge i ruoli importanti nella segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili e molti altri processi biologici, come embrionali patterning inerente allo sviluppo. Tuttavia, c'è una necessità per il monitoraggio di attività elettrica in vivo nell'embriogenesi dei vertebrati. I progressi degli indicatori di tensione fluorescenti geneticamente codificato (GEVIs) hanno reso possibile fornire una soluzione per questa sfida. Qui, descriviamo come creare una tensione transgenici indicatore zebrafish utilizzando l'indicatore di tensione stabilito, ASAP1 (accelerato di sensore di potenziali di azione 1), come esempio. Il kit Tol2 e un promotore di zebrafish onnipresente, ubi, sono stati scelti in questo studio. Spieghiamo anche i processi di clonazione site-specific di Gateway, Tol2 basati su trasposone zebrafish transgenesi e il processo di imaging per tumori di embrioni e pesce pesce di fase iniziale utilizzando microscopi normali epifluorescente. Usando questa linea di pesce, abbiamo trovato che ci sono variazioni di tensione elettrica cellulare durante l'embriogenesi zebrafish e pesce larvale movimento. Inoltre, è stato osservato che in alcuni tumori del fodero del nervo periferico maligno zebrafish, il tumore le cellule erano generalmente polarizzate rispetto ai tessuti normali circostanti.

Introduction

Bioelettricità si riferisce a segnali elettrici endogeno mediato da canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare¹. Lo scambio ionico attraverso la membrana cellulare e le modifiche correnti e potenziali elettriche accoppiate, è essenziale per la segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili. Inoltre, bioelettricità e gradienti ionici hanno una varietà di altre importanti funzioni biologiche, tra cui la conservazione dell'energia, biosintesi e trasporto del metabolita. Bioelettrica di segnalazione è stato scoperto anche come regolatore della formazione embrionale modello, come assi di corpo, il ciclo cellular....

Protocol

Zebrafish sono alloggiati in una struttura animale AAALAC-approvato, e tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo i protocolli approvati dalla Purdue Animal Care and uso Comitato (PACUC).

1. Tol2 trasposone Miniprep costrutto

Nota: Tol2, un trasposone che è stato scoperto nei pesci medaka, ampiamente è stato utilizzato nello zebrafish ricerca comunità^8,9. È stato adottato per il Gateway del sito ricombinazione clonazione sistema basato e conosciuto come il Tol2 kit¹⁰con successo. Il kit Tol2 permette per un modo più convenie....

Results

In un'iniezione di successo, più di embrioni di pesce 50% iniettato visualizzerà un certo grado di fluorescenza verde nelle cellule somatiche, e la maggior parte di loro sarà positiva dall'analisi di Tol2 trasposone accise (Figura 2). Dopo 2-4 generazioni di fuori-croce con pesce wildtype (fino a quando il pesce fluorescente raggiungere il 50%, il rapporto previsto mendeliano), i pesci transgenici sono stati utilizzati per l'esperimento di formazione immagine.......

Discussion

Sebbene le attività di elettrico livello cellulare e tissutale durante lo sviluppo embrionale e malattia umana sono stati scoperti molto tempo fa, i cambiamenti dinamici elettrici in vivo e loro ruoli biologici ancora rimangono in gran parte sconosciuti. Una delle sfide principali è quello di visualizzare e quantificare i cambiamenti elettrici. Tecnologia di patch clamp è un'innovazione per tenere traccia delle singole cellule, ma la sua applicazione agli embrioni vertebrati è limitato perché sono composte di mo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette per colture cellulari da 14 ml	VWR	60818-725	Coltura di E.Coli
Vasca per elettroforesi di agarosio	Thermo Scientific	Owl B2	Eletroforesi del DNA
Agarosio RA	Amresco	N605-500G	Per la produzione dei gel per iniezione
Attb1-ASAP1-F primer	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplificazione della regione codificante ASAP1 per il subclonaggio
Attb2-ASAP1-R primer	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTTTCTGTGAAGCCA	Amplificazione della regione codificante ASAP1 per il subclonaggio
Ambito di dissezione in campo chiaro	Nikon	SMZ 745	Decrioinazione, microiniezione, montaggio
Telecamera a colori	Zeiss	AxioCam MRc	Embrione di pesce registrazione di immagini
Vetrino concavo	VWR	48336-001	Per la conservazione di embrioni di pesce durante il processo di imaging
Pipetta di trasferimento monouso da 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Embrioni di pesce e trasferimento d'acqua
Enzima endonucleasi, non I	NEB	R0189L	Per linearizzare il DNA plasmidico
Ambito di applicazione del composto epifuorescente	Zeiss	Axio Imager.A2	Pesce imaging di embrioni
Endoscopio di dissezione stereo epifuorescente	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Imaging di embrioni di pesce
Sorgente luminosa fluorescente	Dinamica del lume	X-cite seris 120	Sorgente luminosa per microscopi a fluorescenza
Pinze #5	WPI	500342	Dechorionazione e rottura dell'ago
Gateway BP Clonase II Miscela di enzimi	Thermo Scientific	11789020	Clonazione a ricombinazione Gateway BP
Gateway LR Clonasi II Plus enzima	Thermo Scientific	12538120	Clonazione a ricombinazione Gateway LR
Kit di recupero del DNA Kit di recupero del DNA	Zymo Research	D4002	Purificazione del gel del DNA
Punta di caricamento	Eppendorf	930001007	Per caricare la soluzione iniettabile negli aghi capillari
Metilcellulosa (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montaggio di embrioni di pesce
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	M9140	Sopprime i focolai fungini nelle piastre di Petri
Stampo per microiniezione	Strumenti di scienza adattiva	TU-1	Per preparare il vassoio dello stampo in agaorse per contenere embrioni di pesce durante l'iniezione
Microiniettore	WPI	Iniettore pneumatico Picopump PV820
Micro-manipolatore	WPI	Microiniettore MM3301R	Operazione di microiniezione
Estrattore per micropipette Strumento		Sutter P-1000	Per la preparazione dell'ago capillare
Olio minerale	Amresco	J217-500ml	Per la calibrazione del volume di iniezione
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione	Thermo Scientific	AM1340	mRNA in vitro
Telecamera monocolore	Zeiss	AxioCam MRm	Registrazione di immagini di embrioni di pesce
Kit di minipreparazione plasmidico	Zymo Research	D4020	Preparare piccole quantità di DNA plasmidico
Piastre di Petri in plastica	VWR	25384-088	Per trattenere pesci o embrioni di pesce durante il processo di imaging
RNA Clean & Concentratore-5	Zymo Research	R1015	Pulizia dell'mRNA dopo trascrizione in vitro
Spettrofotometro	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Per la misurazione delle concentrazioni di DNA e RNA
Micrometro da palcoscenico	Am Scope	MR100	Calibrazione del volume di microiniezione
Termociclatore	Bio-Rad	T100	Amplificazione del DNA per la clonazione genica
Parete sottile capillari in vetro	WPI	TW100F-4	Vetro grezzo per la realizzazione di ago cappilare
Tol2-exL1 primer	IDT DNA	GCACAACACCAGAAAATGCCCTC	Tol2 assay excise Tol2-exR
primer	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAAAAAG	Tol2 excise test
TOP10 Chimicamente competente E. coli	Thermo Scientific	C404006	Utilizzato per la trasformazione durante il clonaggio genico
Tricaina mesilato	Sigma-Aldrich	A5040	Per l'anestetizzazione di pesci o embrioni di pesce
Trans-illuminatore UV 302nm	UVP	M-20V	Visualizzazione del DNA Bagno
d'acqua	Thermo Scientific	2853	Per il processo di trasformazione del clonaggio genico