Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Summary

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Abstract

Bioelettricità, elettrico di segnalazione endogena mediata dai canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare, svolge i ruoli importanti nella segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili e molti altri processi biologici, come embrionali patterning inerente allo sviluppo. Tuttavia, c'è una necessità per il monitoraggio di attività elettrica in vivo nell'embriogenesi dei vertebrati. I progressi degli indicatori di tensione fluorescenti geneticamente codificato (GEVIs) hanno reso possibile fornire una soluzione per questa sfida. Qui, descriviamo come creare una tensione transgenici indicatore zebrafish utilizzando l'indicatore di tensione stabilito, ASAP1 (accelerato di sensore di potenziali di azione 1), come esempio. Il kit Tol2 e un promotore di zebrafish onnipresente, ubi, sono stati scelti in questo studio. Spieghiamo anche i processi di clonazione site-specific di Gateway, Tol2 basati su trasposone zebrafish transgenesi e il processo di imaging per tumori di embrioni e pesce pesce di fase iniziale utilizzando microscopi normali epifluorescente. Usando questa linea di pesce, abbiamo trovato che ci sono variazioni di tensione elettrica cellulare durante l'embriogenesi zebrafish e pesce larvale movimento. Inoltre, è stato osservato che in alcuni tumori del fodero del nervo periferico maligno zebrafish, il tumore le cellule erano generalmente polarizzate rispetto ai tessuti normali circostanti.

Introduction

Bioelettricità si riferisce a segnali elettrici endogeno mediato da canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare¹. Lo scambio ionico attraverso la membrana cellulare e le modifiche correnti e potenziali elettriche accoppiate, è essenziale per la segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili. Inoltre, bioelettricità e gradienti ionici hanno una varietà di altre importanti funzioni biologiche, tra cui la conservazione dell'energia, biosintesi e trasporto del metabolita. Bioelettrica di segnalazione è stato scoperto anche come regolatore della formazione embrionale modello, come assi di corpo, il ciclo cellulare e di differenziazione delle cellule¹. Pertanto, è fondamentale per la comprensione di molte malattie congenite umane che derivano da mis-regolamento di questo tipo di segnalazione. Anche se toppa morsetto è stato ampiamente utilizzato per la registrazione di singole cellule, è ancora lungi dall'essere ideale per il monitoraggio simultaneo di più celle durante lo sviluppo embrionale in vivo. Inoltre, tensione sensibili piccole molecole non sono anche ideali per applicazioni in vivo a causa della loro specificità, sensibilità e tossicità.

La creazione di una varietà di geneticamente codificato fluorescente tensione indicatori (GEVIs) offre un nuovo meccanismo per superare questo problema e permette per una facile applicazione studiare lo sviluppo embrionale, anche se essi sono stati originariamente inteso per monitoraggio neurale cellule di^2,3. Uno della GEVIs attualmente disponibile è il sensore accelerato di potenziali di azione 1 (ASAP1)⁴. Si compone di un ciclo extracellulare di un dominio di rilevamento di tensione di tensione sensibile fosfatasi e una proteina fluorescente verde circolarmente permutata. Pertanto, ASAP1 permette la visualizzazione dei cambiamenti potenziali elettrici cellulari (polarizzazione: verde brillante; depolarizzazione: verde scuro). ASAP1 ha 2 ms on-e off cinetica e può tenere traccia di sottosoglia potenziale cambiamento⁴. Così, questo strumento genetico permette un nuovo livello di efficacia nel monitoraggio in tempo reale bioelettrica in cellule vive. Ulteriore comprensione dei ruoli di bioelettricità nello sviluppo embrionale e molte malattie umane, quali il cancro, sarà gettato nuova luce sui meccanismi sottostanti, che è fondamentale per la prevenzione e trattamento della malattia.

Zebrafish hanno dimostrato un potente modello animale per studiare biologia inerente allo sviluppo e malattie umane, compreso cancro^5,6. Essi condividono geni ortologhi di 70% con gli esseri umani, e hanno simile vertebrati biologia⁷. Zebrafish fornire cura relativamente facile, una dimensione di grande frizione delle uova, trattabile genetica, transgenesi facile e trasparente esterno sviluppo embrionale, che li rendono un sistema superiore per in vivo imaging^5,6. Una grande fonte di linee di pesci mutanti già presenti e un genoma completamente sequenziato, zebrafish fornirà una gamma relativamente illimitata della scoperta scientifica.

Per studiare in vivo in tempo reale attività elettrica delle cellule, approfittiamo del sistema modello zebrafish e ASAP1. In questo articolo, descriviamo come incorporare il biosensore fluorescente tensione ASAP1 il genoma di zebrafish utilizzando Tol2 trasposone transgenesi e visualizzare attività elettrica cellulare durante lo sviluppo embrionale, il pesce movimento larvale e nel tumore dal vivo .

Protocol

Zebrafish sono alloggiati in una struttura animale AAALAC-approvato, e tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo i protocolli approvati dalla Purdue Animal Care and uso Comitato (PACUC).

1. Tol2 trasposone Miniprep costrutto

Nota: Tol2, un trasposone che è stato scoperto nei pesci medaka, ampiamente è stato utilizzato nello zebrafish ricerca comunità^8,9. È stato adottato per il Gateway del sito ricombinazione clonazione sistema basato e conosciuto come il Tol2 kit¹⁰con successo. Il kit Tol2 permette per un modo più conveniente di creare costrutti di espressione personalizzata, ma anche di aumentare l'efficienza della transgenesi. Così, era una decisione facile da prendere vantaggio di questo sistema e creare un'onnipresente ASAP1 espressione zebrafish riga utilizzando un promotore convalidato ubiquitina guidare ASAP1¹¹.

1. Creazione di una costruzione centrale voce ASAP1: pDONR221-ASAP1
   1. Acquisire il codificato geneticamente Tensione sensore ASAP1 costruire, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), da Addgene. Per amplificare la regione di codificazione di ASAP1, è possibile impostare una PCR utilizzando i primer su misura (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) fiancheggiati da sequenze di attB all'estremità 5' dei primer (Figura 1). Phusion DNA polimerasi è stato scelto per la sua elevata efficienza e condizioni di PCR sono state ottimizzate basati sul protocollo precedentemente pubblicato¹².
   2. Caricare i prodotti di PCR 50 µ l in un 1% TAE gel utilizzando una pipetta regolare con punte di 200 µ l ed eseguire l'elettroforesi a 160 V in un serbatoio orizzontale gel per circa 30 min.
   3. Verifica il gel sotto un transilluminatore UV (353 nm), asportare fuori la banda desiderata utilizzando un bisturi a lama/sotto un transilluminatore UV come precedentemente pubblicati^13,14e mettere il campione di DNA contenente gel in una microcentrifuga pulito 1,5 mL tubo.
   4. Eseguire purificazione del gel per i prodotti di PCR di ASAP1. Recuperare il DNA nel gel asportato utilizzando un kit di purificazione dei gel DNA commerciale seguendo le istruzioni del fabbricante ed eluire il DNA in 20 µ l di acqua. Prendere 1 µ l come un campione e misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Le istruzioni del software utilizzando l'acqua come un controllo vuoto¹⁵del flusso.
   5. Prendere 100 ng di purificato prodotto di PCR e mescolarla con 150 ng di plasmide pDONR221 a 10 µ l di TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)¹⁶. Aggiungere 2 µ l di BP Clonase II nella reazione e incubare la reazione a temperatura ambiente durante la notte.
   6. Il secondo giorno, aggiungere 1 µ l di proteinasi K nella reazione e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
   7. Eseguire la trasformazione. La reazione di trasferimento e mescolare con 50 µ l di Top10 competenti Escherichia coli cellule e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min. Poi, trasferire la provetta di reazione in bagnomaria a 42 ° C per 1 min. immediatamente rimuovere il tubo e incubare in ghiaccio per 2 min. Successivamente, mettere il tubo in uno shaker di 37 ° C ed incubare per 1 h.
   8. Estrarre il tubo e piastra le cellule su un piatto di kanamicina LB. Successivamente, incubare la piastra durante la notte (16-18 h) a 37 ° C.
   9. Scegli colonie singole e ben separate e inoculare loro in provette di coltura cellulare di 14 mL con 3 mL di terreno LB. Li della coltura durante la notte a 37 ° C in uno shaker con una velocità di rotazione di 250 giri/min (rotazione al minuto).
   10. Eseguire miniprep utilizzando un kit commerciale miniprep seguendo il manuale di istruzioni¹⁷.
   11. Sequenza 3-4 plasmidi con Sanger sequenziamento per identificare positivo pDONR221-ASAP1 cloni utilizzando primer di sequenziamento di M13F e M13R.
2. Creando il costrutto Tol2 per il microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
   1. Scegliere che il sequenziamento verificato misura e pDONR221-ASAP1 clone sua concentrazione di DNA usando un seguito di spettrofotometro l'istruzione software usando l'acqua come un vuoto di controllo¹⁵.
   2. Prendere 100 µ g di pDONR221-ASAP1 e mescolare con 100 µ g del Tol2 kit 5-fine del plasmide (pENTR5'_ubi, Addgene n. 27320), 100 µ g di p3E-polyA (Tol2 kit #302) e 150 µ g di pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Regolare volume totale a 8 µ l utilizzando il buffer di TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) in una microcentrifuga da 1,5 mL provetta e mescolare bene da un vortice breve di 2-5 s. Quindi, aggiungere 2 µ l di LR Clonase II plus e incubi la reazione a temperatura ambiente durante la notte.
   3. Il secondo giorno, aggiungere 1 µ l di proteinasi K nella reazione usando una pipetta a 10 µ l e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
   4. Eseguire la trasformazione e identificare i cloni positivi come descritto sopra (punti 1.1.7-11).
   5. Misura la concentrazione di DNA di sequenziamento verificato pDestTol2-ubi-ASAP1 clone (Figura 1B) utilizzando un spettrofotometro¹⁵. La concentrazione è solitamente intorno 200ng / µ l.

2. preparare Tol2 Transposase mRNA e soluzione iniettabile

1. Striscia e. coli glicerolo stock di pCS2FA-transposase plasmide (Tol2 kit #396) su una piastra di LB (con 100 ampicillina µ g/mL) utilizzando un ciclo di inoculazione sterilizzato. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore per una notte. Il giorno successivo, prendere una singola Colonia e inoculare esso in 3 mL di LB (ampicillina 100 µ g/mL) usando una pipetta sterilizzata di 10 µ l. Della coltura durante la notte a 37 ° C in uno shaker con una velocità di rotazione di 250 giri/min.
2. Eseguire miniprep sulla cultura di e. coli utilizzando un kit commerciale miniprep seguendo il manuale di istruzioni. Eluire il DNA del plasmide in 30-50 µ l di tampone di TE da 1 minuto Centrifugare a 14.000 giri/min e misurare la sua concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.
3. Linearizzare µ g di 1-2 del plasmide con non ho endonucleasi e purificare il DNA con un DNA pulizia kit seguendo il manuale di istruzioni dopo che non ho la digestione. Eluire il DNA in 5 µ l di acqua mediante centrifugazione a 14.000 rpm per 1 minuto. La concentrazione attesa è di circa 200-300 ng / µ l.
4. Eseguire la trascrizione in vitro con non linearizzato pCS2FA-transposase come un modello di DNA utilizzando un kit di trascrizione SP6 commerciale.
5. Una volta terminata la reazione, purificare Tol2 transposase mRNA usando una pulizia commerciale RNA kit seguendo le istruzioni del produttore. Infine, eluire mRNA in acqua RNAse-libera di 20 µ l e misurare la concentrazione di RNA in uno spettrofotometro. La concentrazione attesa è di circa 1-3 µ g / µ l. campioni possono essere conservati in un congelatore a-80 ° C, se necessario.
6. Preparare la soluzione di microiniezione mescolando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-transposase ASAP1 e Tol2 mRNA (100 ng / µ l) in un tubo del microcentrifuge pipettando. Per impedire la degradazione dell'acido nucleico causata da scongelamento ripetuti e ricongelare, aliquotare 6 µ l per provetta e memorizzarlo in un congelatore-80 ° C per un uso futuro.

3. microiniezione

1. Impostare 4-6 vasche di allevamento con almeno 2 maschi e 2 femmine il pomeriggio prima dell'iniezione. Questi pesci non devono essere alimentati nel pomeriggio. Questo passaggio verrà ridurre la quantità di rifiuti di pesce e risparmiare tempo per pulire fuori la mattina successiva, aiutando anche per indurre una risposta di allevamento.
2. La mattina seguente, rimuovere la soluzione preparata iniezione (pDestTol2 -ubi-ASAP1 costrutto e Tol2 mRNA) dal congelatore-80 ° C e posizionarlo sul ghiaccio.
3. Tirare i divisori nel pesce di allevamento serbatoi e consentire il pesce ad accoppiarsi. In generale, pesci depongono le uova all'interno di 20-30 minuti dopo aver tirato fuori il divisore. Se non, attendere 1-2 ore in più. Alcuni pesci non possono affatto depongono le uova. In questo caso, è possibile ripetere questo esperimento per la raccolta di embrioni di pesce.
4. Durante l'attesa, assicurarsi che non ci sono aghi preparati con la punta rotta in un angolo che crea un bordo smussato con forcipe o rompendo il tergicristallo un compito delicato.
   1. Tirare aghi da vetro capillare su un estrattore micropipetta utilizzando i seguenti parametri: calore 545; tirare 60; velocità 80; tempo 250; pressione 500. Rompere l'ago con una pinza sotto un ambito di dissezione (con oculare righello per la stima del diametro) tenendo il forcipe a un angolo di circa 45 °. Diametri degli aghi desiderata possono essere variabile a seconda delle impostazioni di microinjector, ma più piccolo diametro è comodo per fare diminuire la mortalità embrionale.
5. Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglierli in un diametro di 10 cm di Petri e portarli all'ambito di dissezione. Rimuovere tutti gli embrioni anormali e rifiuti di pesce.
6. Dispensare gli embrioni fecondati nell'iniezione di preparati agarosio al 3% della muffa. Rimuovere l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in luogo.
7. Una volta che tutte le righe sono pieni di embrioni vitali, disporli in modo che le singole celle tutti rivolti nella stessa direzione verso l'ago, che è circa un angolo di 45° in orizzontale. Questo faciliterà iniezione molto più tardi.
8. Anche con i guanti, utilizzare una pipetta di caricamento di 20 µ l punta e rimuovere 5 µ l del costrutto preparato dal tubo sul ghiaccio.
9. Inserire delicatamente la punta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino a dove inizia a tapper, come per ottenere il reagente più vicino alla punta. Se ci sono ancora delle bolle d'aria, agitare l'ago, facendo attenzione a non rompere la punta.
10. Inserire l'ago direttamente nel porta-aghi microiniezione e serrare con cautela fino a quando l'ago rimane al suo posto. Regolare l'angolo di circa 45°.
11. Una volta che l'ago è preparato e collegato, accendere il microscopio e gas serbatoio a pressione. Delle imprese CO₂ serbatoi sono generalmente buoni per questo scopo. Il volume di iniezione viene regolato dalla pressione di detenzione ed espulsione: approssimativa 0,5 psi per detenzione e a 30 psi per espulsione. Assicuratevi di controllare che la soluzione viene fuori quando si preme il pedale.
12. Utilizzando un micrometro con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a ~ 150 µm di diametro (circa 2 nL). Assicurarsi che la pressione posteriore vi permetterà una piccola quantità di gocciolare fuori dell'ago. Se non c'è abbastanza pressione, azione capillare provoca liquido inserire l'ago e distruggere il mRNA.
13. Una volta che l'ago è calibrato, cominciare a iniettare il costrutto la singola cella degli embrioni fecondati.
    Nota: Questo richiede una grande quantità di pratica, pazienza e finezza, a causa della membrana delle cellule, essendo difficile da perforare. È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo, per la generazione di zebrafish transgenici. Questo è diverso dall'iniezione di morpholino. Non importa quale lato l'ago entra nella cellula fintanto che il costrutto va nella cella. La transgenesi avrà un tasso molto basso di successo se iniettato nel tuorlo invece della cella. Cella singola fase iniezione è anche importante, o pesce chimera somatico verrà creato. Questo ridurrà le possibilità del transgene andando alle cellule germinali.
14. Utilizzare il bordo della tacca gel per fornire un supporto che mantiene l'embrione in posizione e permette l'ago applicare pressione senza spostare l'embrione. Una volta che la punta dell'ago è nella cella singola, premere il pedale per rilasciare la quantità desiderata di soluzione. Ripetere questo processo per tutti gli embrioni.
15. Al termine dell'operazione, è possibile trasferire gli embrioni iniettati in un piatto con etichettato risciacquandole fuori la tacca di agarosio con acqua sistema di pesci e delle pipette monouso 3,4 mL. Conservare gli embrioni in un incubatore di 28,5 ° C per far loro sviluppare. Controllare indietro per tutto il giorno di rimozione di embrioni di pesce morto e sostituire l'acqua con blu di metilene 0,1% in acqua pesci.
16. Circa 6-8 ore dopo l'iniezione, individuo di prendere 10 iniettato embrioni di pesce e preparare il DNA genomico da loro usando il metodo di Hotshot¹⁸.
17. La mattina seguente, utilizzare un microscopio di dissezione con una sorgente di luce di fluorescenza per ordinare fuori gli embrioni risultati GFP nei tessuti non-tuorlo. Questi embrioni di pesce dovrebbero contenere il costrutto iniettato.
18. Eseguire analisi di accise Tol2 per controllare l'attività di trasposizione come descritto in precedenza¹⁹. Se asportato plasmide può essere rilevata, mantenere l'iniettato embrioni di pesce e farli crescere. Se nessun plasmide asportata può essere rilevato, ripetere il processo di sintesi e microiniezione di Tol2 mRNA fino a raggiungere i risultati positivi del test delle accise Tol2.

4. stabilire dei pesci transgenici ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)

1. Come descritto in precedenza nel libro zebrafish²⁰, sollevare il pesce iniettato (generazione₀ F) fino all'età adulta. Questo di solito dura circa 4 mesi.
2. Prendere un singolo adulto F₀ pesce e attraversarlo con un unico fronte genere wildtype pesce. Raccogliere pesci embrioni dopo la nidificazione nel corso della giornata. Tenere gli embrioni di pesci raccolti nell'incubatrice 28,5 ° C nei pesci di acqua con 0,1% di blu di metilene.
3. Il terzo giorno, controllare gli embrioni di pesce sotto un microscopio fluorescente dissezione con un filtro GFP. Risolvere gli embrioni di pesce verde, se ne esistono e farli crescere fino all'età adulta come pesci transgenici di F₁ generazione, Tg (ubi: ASAP1).
   Nota: Rapporto mendeliana non dovrebbe dato che la maggior parte del pesce₀ F parentale sono chimere genetica germinale.
4. Attraversare il singolo F₁ adult pesce con pesce wildtype e raccogliere embrioni di pesce. Ordina fuori embrioni di pesce verde e farli crescere fino all'età adulta come pesce di generazione₂ F.
   Nota: Verde e gli embrioni non-verde pesce dovrebbero essere vicino a 1:1 se c'è un transgene singolo.
5. Per visualizzare le modifiche potenziali elettriche nel tumore come tumori del fodero del nervo periferico maligno (MPNST), attraversare la generazione F di₂ Tg (ubi: ASAP1) pesce con pesce rpl35^hi258/wt . È noto che i tumori visibili iniziano a essere trovato nel 6-8 mese vecchio adulti^21,22.

5. imaging

1. Immagine di embrioni di zebrafish, prendere più fondatore di generazione₂ F pesce e li attraversano con wildtype pesce in singole coppie. Raccogliere pesci embrioni a diversi stadi di sviluppo desiderati secondo zebrafish Guida²³di gestione temporanea.
2. Per le fasi iniziali di embrioni di pesce, sbucciare e rimuovere chorions degli embrioni con attenzione usando un paio di pinze in un ambito di dissezione in un diametro di 10 cm di Petri con acqua sistema di pesci.
3. Trasferire alcuni embrioni di pesce su un vetrino concavo con metilcellulosa 3% utilizzando una pipetta monouso 3,4 mL. Regolare gli embrioni nelle posizioni desiderate per visualizzare l'attività GFP cellulare utilizzando un ago sotto un ambito di dissezione fluorescente.
4. Per le fasi di movimento di embrioni di pesce (più vecchi di 12 stadi somite), è possibile utilizzare mesylate tricaina 0.05% per anestetizzare gli embrioni di pesce prima di trasferirli a diapositive. Brevemente, embrioni di pesce erano emerse in 0.05% tricaina mesylate in pesci d'acqua fino a quando hanno smesso di nuotare ed equilibrio corpo perdita. Inoltre, aggiungere una goccia di 0.05% tricaina mesylate con la metilcellulosa sulla diapositiva.
5. Per meno di 12 embrioni somite fase pesce, è necessario utilizzare un microscopio composto di epi-fluorescenza con una fotocamera compatibile e software per l'imaging. Per più di 12 embrioni di pesce fase somite, utilizzare un microscopio di dissezione di fluorescenza.
6. A immagine di tensione delle cellule del tumore, in primo luogo identificare il pesce con i tumori MPNST. Quindi, anestetizzare il pesce con 0.05% tricaina mesylate. Per l'intero supporto imaging, mettere il pesce in un diametro di 10 cm di Petri. Per visualizzare l'attività elettrica delle cellule del tumore, i tumori pesce potrebbero essere dissecati fuori dopo formazione immagine intero supporto.

Results

In un'iniezione di successo, più di embrioni di pesce 50% iniettato visualizzerà un certo grado di fluorescenza verde nelle cellule somatiche, e la maggior parte di loro sarà positiva dall'analisi di Tol2 trasposone accise (Figura 2). Dopo 2-4 generazioni di fuori-croce con pesce wildtype (fino a quando il pesce fluorescente raggiungere il 50%, il rapporto previsto mendeliano), i pesci transgenici sono stati utilizzati per l'esperimento di formazione immagine...

Discussion

Sebbene le attività di elettrico livello cellulare e tissutale durante lo sviluppo embrionale e malattia umana sono stati scoperti molto tempo fa, i cambiamenti dinamici elettrici in vivo e loro ruoli biologici ancora rimangono in gran parte sconosciuti. Una delle sfide principali è quello di visualizzare e quantificare i cambiamenti elettrici. Tecnologia di patch clamp è un'innovazione per tenere traccia delle singole cellule, ma la sua applicazione agli embrioni vertebrati è limitato perché sono composte di mo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette per colture cellulari da 14 ml	VWR	60818-725	Coltura di E.Coli
Vasca per elettroforesi di agarosio	Thermo Scientific	Owl B2	Eletroforesi del DNA
Agarosio RA	Amresco	N605-500G	Per la produzione dei gel per iniezione
Attb1-ASAP1-F primer	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplificazione della regione codificante ASAP1 per il subclonaggio
Attb2-ASAP1-R primer	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTTTCTGTGAAGCCA	Amplificazione della regione codificante ASAP1 per il subclonaggio
Ambito di dissezione in campo chiaro	Nikon	SMZ 745	Decrioinazione, microiniezione, montaggio
Telecamera a colori	Zeiss	AxioCam MRc	Embrione di pesce registrazione di immagini
Vetrino concavo	VWR	48336-001	Per la conservazione di embrioni di pesce durante il processo di imaging
Pipetta di trasferimento monouso da 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Embrioni di pesce e trasferimento d'acqua
Enzima endonucleasi, non I	NEB	R0189L	Per linearizzare il DNA plasmidico
Ambito di applicazione del composto epifuorescente	Zeiss	Axio Imager.A2	Pesce imaging di embrioni
Endoscopio di dissezione stereo epifuorescente	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Imaging di embrioni di pesce
Sorgente luminosa fluorescente	Dinamica del lume	X-cite seris 120	Sorgente luminosa per microscopi a fluorescenza
Pinze #5	WPI	500342	Dechorionazione e rottura dell'ago
Gateway BP Clonase II Miscela di enzimi	Thermo Scientific	11789020	Clonazione a ricombinazione Gateway BP
Gateway LR Clonasi II Plus enzima	Thermo Scientific	12538120	Clonazione a ricombinazione Gateway LR
Kit di recupero del DNA Kit di recupero del DNA	Zymo Research	D4002	Purificazione del gel del DNA
Punta di caricamento	Eppendorf	930001007	Per caricare la soluzione iniettabile negli aghi capillari
Metilcellulosa (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montaggio di embrioni di pesce
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	M9140	Sopprime i focolai fungini nelle piastre di Petri
Stampo per microiniezione	Strumenti di scienza adattiva	TU-1	Per preparare il vassoio dello stampo in agaorse per contenere embrioni di pesce durante l'iniezione
Microiniettore	WPI	Iniettore pneumatico Picopump PV820
Micro-manipolatore	WPI	Microiniettore MM3301R	Operazione di microiniezione
Estrattore per micropipette Strumento		Sutter P-1000	Per la preparazione dell'ago capillare
Olio minerale	Amresco	J217-500ml	Per la calibrazione del volume di iniezione
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione	Thermo Scientific	AM1340	mRNA in vitro
Telecamera monocolore	Zeiss	AxioCam MRm	Registrazione di immagini di embrioni di pesce
Kit di minipreparazione plasmidico	Zymo Research	D4020	Preparare piccole quantità di DNA plasmidico
Piastre di Petri in plastica	VWR	25384-088	Per trattenere pesci o embrioni di pesce durante il processo di imaging
RNA Clean & Concentratore-5	Zymo Research	R1015	Pulizia dell'mRNA dopo trascrizione in vitro
Spettrofotometro	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Per la misurazione delle concentrazioni di DNA e RNA
Micrometro da palcoscenico	Am Scope	MR100	Calibrazione del volume di microiniezione
Termociclatore	Bio-Rad	T100	Amplificazione del DNA per la clonazione genica
Parete sottile capillari in vetro	WPI	TW100F-4	Vetro grezzo per la realizzazione di ago cappilare
Tol2-exL1 primer	IDT DNA	GCACAACACCAGAAAATGCCCTC	Tol2 assay excise Tol2-exR
primer	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAAAAAG	Tol2 excise test
TOP10 Chimicamente competente E. coli	Thermo Scientific	C404006	Utilizzato per la trasformazione durante il clonaggio genico
Tricaina mesilato	Sigma-Aldrich	A5040	Per l'anestetizzazione di pesci o embrioni di pesce
Trans-illuminatore UV 302nm	UVP	M-20V	Visualizzazione del DNA Bagno
d'acqua	Thermo Scientific	2853	Per il processo di trasformazione del clonaggio genico