Articolo metodologico

Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

DOI:

10.3791/57343

⸱

30 maggio 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocollo è presentato per estrazione di metaboliti, proteine e lipidi da un campione di terreno singolo simultaneamente, permettendo tempi di preparazione del campione ridotto e abilitazione multi-omic analisi di spettrometria di massa di campioni con quantità limitate.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic integrato, metabolomica e studi lipidomica (multi-omic) stanno trasformando la nostra capacità di comprendere e caratterizzare le comunità microbiche in sistemi ambientali e biologici. Queste misurazioni sono anche attivazione avanzate analisi delle comunità microbiche complesse del suolo, che sono i più complessi sistemi microbici noti fino ad oggi. Analisi multi-omic, tuttavia, sono sfide di preparazione del campione, poiché estrazioni separate sono in genere necessari per ciascuno studio di omic, amplificando così notevolmente il tempo di preparazione e la quantità di campione richiesto. Per risolvere questa limitazione, è stato creato un metodo 3-in-1 per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi (MPLEx) dallo stesso campione di suolo adattando un approccio a base di solvente. Questo protocollo MPLEx ha dimostrato di essere sia semplice e robusto per molti tipi di campioni, anche quando utilizzati per quantità limitate di campioni di terreno complesso. Il metodo MPLEx abilitato anche notevolmente le misurazioni di rapida multi-omic necessari per acquisire una migliore comprensione dei membri di ogni comunità microbica, mentre la valutazione dei cambiamenti in atto su perturbazioni biologiche ed ambientali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Valutazione comunità microbica del suolo ha importanti implicazioni per la comprensione di carbonio in bicicletta e il cambiamento climatico. Recenti studi hanno tuttavia evidenziato difficoltà, come la mancanza di genomi sequenziati per microbiota in vari tipi di suolo e la funzione sconosciuta di molte delle proteine rilevate. Questi risultato di sfide a causa del terreno essendo più complessa comunità microbica conosciuti alla data di1,2,3. Analisi multi-omic, che combinano risultati da metagenomica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomica e studi lipidomica, recentemente sono stati implementati in numerosi studi di terreno per ottenere una maggiore comprensione i microbi presenti, mentre ottenere informazioni complete circa i cambiamenti molecolari che avvengono a causa di perturbazioni ambientali1,4,5. Una sfida con multi-omic studi è che la spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic, metabolomica e lipidomica misurazioni in genere richiedono un processo di estrazione specifica per ogni omic MS compatibile6,7 , 8 , 9. queste precise procedure subordina l'applicazione estremamente difficili o impossibili quando solo una limitata quantità di campione è disponibile. Queste sfide ci hanno spinti a studiare una simultanea metabolita, della proteina e del lipido (MPLEx) metodo di estrazione capace di usando più piccoli volumi di campione o masse, migliorando la precisione e fornendo più veloce preparazione del campione per tutte le tre analisi 10. ad oggi, esistono procedure estrazione alternativi del suolo che possono raggiungere tutti questi obiettivi.

Per attivare globale multi-omic analisi di un campione di terreno unico, un protocollo di estrazione con solvente organico basato su cloroformio, metanolo e acqua separazioni era utilizzato10. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per lipido totale estrazioni9,11 e più recentemente è stato modificato per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi da un singolo campione12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, consentendo la meno quantità di campione e variabilità sperimentale10. Nel protocollo MPLEx, cloroformio non è miscibile con acqua, che costituisce la base per la separazione chimica trifasica dei costituenti del campione in frazioni distinte. Di conseguenza, la fase acquosa superiore contiene i metaboliti idrofili, seguiti da un disco di proteine e poi uno strato di lipidi nella fase di cloroformio di fondo (Figura 1). Quando MPLEx viene applicato alla maggior parte dei suoli, residui di particolato si accumulano nella parte inferiore dei tubi di campionamento e possono essere eliminato dopo aver raccolgono tutti i livelli. Ogni tipo di suolo può essere differente, tuttavia e in terreno altamente organico quali torba, i detriti del terreno rimane nello strato intermedio e non cadono sul fondo del tubo di campionamento. MPLEx offre diversi vantaggi quando isolare la molecola più tipi dallo stesso campione come 1) piccole quantità di campione può essere utilizzato per le analisi multi-omic, 2) multi-omic estrazioni dalla stessa diminuzione di campione variabilità nel complesso sperimentale, e 3) una maggiore quantità di campioni può essere preparato molto più veloce per maggiore velocità effettiva studi10. Insieme, questi vantaggi sono vitali per fornire la migliore capacità di misurazione per la valutazione di campioni di terreno e loro comunità microbiche complesse.

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Protocollo

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Nota: Terreni molto bagnati possono essere liofilizzati prima dell'estrazione senza pregiudicare l'efficacia dell'estrazione. Terreno bagnato può anche essere usato, ma dovrebbe essere considerato quando si aggiungono i reagenti specifici rapporti.

Nota: Si consiglia di utilizzare 20 g di peso secco del terreno per estrazione, che deve essere diviso tra due provette da 50 mL (massimo di suolo 10g per tubo da 50 mL). Le estrazioni possono essere scalate in su o in giù dipende dal campione disponibile.

Nota: I campioni di terreno asciutto possono essere setacciati attraverso uno schermo di 3 mm al fine di omogeneizzare e rimuovere rocce e piccole radici. Campioni di suolo bagnato, non del setaccio come il campione si blocca nella schermata.

1. terra lisi delle cellule e l'estrazione di metaboliti, proteine e lipidi (Timing ~ 1 d)

  1. Al campione di suolo di 20 g, pesare 10 g in due tubi separati 50 mL che sono metanolo/cloroformio compatibile. Essere molto attenti con i tubi scelti, come cloroformio percolare la maggior parte delle plastiche, contaminando i campioni. Utilizzare il vetro ogni volta che possibili o plastica tubi realizzati in polipropilene o politetrafluoroetilene (PTFE).
    Nota: Mantenere il terreno sul ghiaccio e come fresco come possibile durante le fasi iniziali di pesatura e omogeneizzazione.
  2. Aggiungere 10 mL di cloroformio-lavato in acciaio inox e granati perline ad ogni provetta. Il ghiaccio, aggiungere 4 mL di freddo ultrapura acqua (Vedi Tabella materiali per impianto di depurazione) in ogni provetta (uno campione split tra i due tubi) e trasferire i campioni in un secchio di ghiaccio in una cappa aspirante.
  3. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro di 25 mL, rapidamente aggiungere 20 mL di ghiaccio 2:1 cloroformio: metanolo (v/v).
    Attenzione: Cloroformio: metanolo ha effetti potenziali sulla salute acuti: pelle irritazione, possibili ustioni chimiche e irritazione alle vie respiratorie. Può interessare i reni, fegato e cuore. Indossare guanti, indumenti e occhiali di protezione adatti e lavorare sempre in una cappa aspirante.
  4. Serrare i coperchi e vortice nella soluzione. 2:1 choloroform:methanol aiuta a rompere la parete cellulare dei procarioti ed inattiva anche attività enzimatiche.
  5. Se possibile, fissare i tubi da 50 mL tubo vortex allegati e orizzontalmente vortexare per 10 min a 4 ° C all'interno di un frigorifero. Quindi, inserire i campioni all'interno di un congelatore-80 ° C per circa 15 min per raffreddare completamente.
  6. Utilizzando un sonicatore sonda all'interno di una cappa aspirante, Sonicare ogni campione con una sonda di 6 mm (1/4") a ampiezza 60% per 30 s ogni sul ghiaccio.
    Attenzione: Si consiglia di utilizzare un suono di cedimento, custodia e cuffie di protezione mentre sonicating. Alta tensione è presente il cavo di alimentazione e ad alta frequenza di alimentazione. Evitare di toccare la parte inferiore o i lati della nave del campione con una sonda attiva; si può rompere o fondere la plastica.
  7. Posizionare i campioni nel congelatore-80 ° C per circa 15 min, come sonicating può generare un sacco di calore.
  8. Ripetere i passaggi da 1.5-1.7.
    Nota: Assicurarsi che i campioni di rimanere freddi durante tutta la procedura di lisi.
  9. Centrifugare i campioni a 4.000 x g per 5 min, 4 ° C. A questo punto, il campione sarà divisi nello strato superiore del metabolita, l'intercalare di proteina e il più basso strato lipidico (e pallina restante di detriti). Vedere la Figura 1.
  10. I campioni su ghiaccio nel secchiello del ghiaccio e, all'interno di una cappa aspirante e utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL, rimuovere i livelli di metabolita superiore dalle due provette da 50 mL in flaconcino di vetro di grandi dimensioni una.
    Nota: Evitare di aspirare qualsiasi del livello di proteina nella pipetta; lasciare un piccolo strato di metabolita se necessario.
  11. Inclinare leggermente il tubo da 50 mL per rilasciare l'intercalare di proteina, in modo che è fluttuazione libera al momento lo strato lipidico inferiore. Con una spatola di laboratorio testa piatta di acciaio inossidabile pulito accuratamente scoop entrambi degli intercalari proteina e metterli insieme in una nuova provetta da 50 mL.
  12. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro 25ml, rimuovere gli strati più bassi del lipido in un flaconcino di vetro di grandi dimensioni.
    Nota: Cercate di evitare gli aspiranti particelle di suolo; Tuttavia, alcuni suolo detriti e particelle aspiravano lungo con i lipidi verranno rimosso in un secondo momento.
  13. Posto membrane traspiranti sopra la parte superiore del metabolita e lipidica flaconi in vetro e asciugare in un concentratore a vuoto fino a secchezza (lipidi ~ 4-5 h, metaboliti durante la notte).
  14. La provetta del campione di proteina e i rimanenti tubi pellet di detriti, aggiungere 20 mL di metanolo ghiacciato a ciascuno e vortex. Questo viene fatto per i pellet di detriti per lavare via cloroformio prima di tentare di solubilizzare eventuali possibili proteine restanti fuori i detriti prima di buttarla.
  15. Centrifugare i detriti pellet e le proteine dello strato intermedio a 4.000 x g per 5 min, 4 ° C, poi decantare il metanolo in un contenitore di rifiuti pericolosi all'interno di una cappa aspirante.
  16. Congelare le palline di proteine e detriti in azoto liquido e asciugare in un liofilizzatori (con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C a causa di metanolo con un molto basso punto di congelamento di-98 ° C) per ~ 2 ore.
    Nota: Non asciugare troppo i pellet, quanto saranno più difficili da sciogliere.
  17. Aggiungere 10 mL di buffer di solubilizzazione della proteina (4% SDS, 100mM DTT (DL-dithiothreitol) in tampone tris 50mM, pH 8.0; si veda Supplementari reagente set-up) al tubo dello strato intermedio della proteina e 20 mL a ciascuno dei pellet detriti.
    Attenzione: SDS causa tossicità acuta ed è infiammabile. È una pelle, occhi e irritante delle vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
  18. Nella cappa fumi, sonda ultrasuoni i campioni ad ampiezza di 20% per 30 s per portarli in soluzione. Vortex per 2 min.
  19. Inserire l'esempio dello strato intermedio di proteina in un rotatore del tubo di laboratorio a 300 giri/min, 50 ° C, per 30 minuti per solubilizzare le proteine.
  20. Orizzontalmente vortice i campioni di detriti per altri 10 min a lisare eventuali restanti cellule intatte, quindi ruotare con i campioni dello strato intermedio della proteina per il restante 20 min.
  21. Tutti i campioni a 4.500 x g per 10 min, temperatura ambiente (TA), centrifugare e raccogliere il surnatante da ciascuna provetta per campione in due provette da 50 mL.
  22. Aggiungere 10 mL di solubilizzazione del buffer al pellet di proteine dello strato intermedio, quindi sottoporre ad ultrasuoni e vortice in soluzione e centrifugare di nuovo come prima.
  23. Combinare ugualmente i surnatanti nelle due provette da 50 mL e centrifugare a 8.000 x g per 10 min, 4 ° C, in un rotore ad angolo fisso.
    Nota: Una centrifugazione finale è necessaria rimuovere sostanze umiche contaminazione eccessiva.
  24. Decantare i surnatanti in due provette da 50 mL in modo che c'è 30 mL in ciascuna. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL, aggiungere 7,5 mL di TCA (acido tricloroacetico) ad ogni provetta. Vortice in soluzione. Questo rende 20% TCA in ciascun campione di 30 mL (regolare di conseguenza),
    Attenzione: TCA è caustica, tossica e maggio causare ustioni della pelle. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
  25. Posizionare i campioni in un congelatore a-20 ° C per 2 h per una notte.
    Nota: Proteine precipitano in genere entro 1 h ma possono essere lasciato durante la notte (fino a 18 h).
    Nota: Non lasciare che l'estrazione del TCA andare più di 18 h a causa di possibile idrolisi acida della proteina. Se il campione è congelato, scongelare su ghiaccio; non lasciare che il campione scaldare passato disgelo.
  26. Per pellet la proteina precipitata, centrifugare il campione a 4.500 x g per 10 min, 4 ° C e decantare il supernatante in rifiuti.
  27. Aggiungere 10 mL di acetone ghiacciata 100% per ogni pallina di proteina, vortice e si combinano come pellet in una provetta.
  28. Centrifugare la provetta contenente il pellet combinato (usando una bilancia) e quindi decantare il supernatante in rifiuti.
    Attenzione: Acetone può causare delle vie respiratorie e irritazione cutanea e oculare ed è un liquido e vapori infiammabili. Indossare un camice da laboratorio e occhiali di protezione guanti, lavoro in una cappa aspirante.
  29. Lavare la pallina due volte con 1,5 mL di acetone e infine trasferimento in una provetta da 2 mL per la centrifuga finale a 10.000 x g per 5 min.
  30. Decantare il supernatante in rifiuti e lasciar invertito il pellet ad asciugare su una salvietta di carta in una cappa per ~ 20 min o sotto un flusso di azoto fino a quando la pallina inizia leggermente a crepa.
  31. 100-200 µ l di buffer di solubilizzazione di proteina, a seconda della dimensione del pellet.
    Nota: Tenere il volume di tampone di solubilizzazione aggiunto al campione più basso possibile. Successivi filtro Aided campione preparazione (FASP) può utilizzare solo fino a 50 μL di campione solubilizzato per colonna; qualsiasi più deve essere suddiviso in più colonne FASP.
  32. Sottoporre ad ultrasuoni e vortice la pallina nella soluzione. Si noti che il campione può essere viscoso a causa di sostanze umiche precipitando insieme con la proteina, che sarà rimossi con una successiva centrifugazione.
  33. Agitare il campione in un incubatore/agitatore per 30 min a 300 giri/min, 40 ° C, per solubilizzare le proteine in soluzione e procedere alla digestione delle proteine.
  34. Snap congelare il campione in azoto liquido e conservare in un congelatore a-80 ° C fino al momento per la digestione delle proteine.

2. lipidi preparazione (temporizzazione ~ 20 min)

  1. Una volta che i campioni del lipido sono asciutti, aggiungere 200 μL di 2:1 cloroformio: metanolo nel flaconcino, vortice in soluzione e trasferimento in una provetta da 1,5 mL in polipropilene, di aggiungere un ulteriore 200 μL al vetro fiala, vortice e pipettare i lipidi rimanenti e trasferire al tubo.
  2. Centrifugare i detriti fuori il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C.
  3. Trasferire il surnatante in un flaconcino di vetro del lipido e conservare a-20 ° C fino all'analisi LC-MS/MS (ulteriori dettagli per LC-MS/MS in Metodi supplementari).
  4. Se i campioni non possono essere analizzati immediatamente dopo la preparazione, i lipidi devono essere memorizzati in solvente a-20 ° C per evitare ossidazione e degradazione.

3. metabolita preparazione e derivatizzazione (temporizzazione ~ 5 h)

  1. Il giorno dopo l'estrazione, rimuovere i campioni di metabolita dal Vac velocità e memorizzare secco a-20 ° C fino al momento per la derivatizzazione e analisi sul GC. Se non in esecuzione i metaboliti su un GC, poi prepararli utilizzando il protocollo appropriato per lo strumento.
  2. Immediatamente prima di derivatizzante i metaboliti per analisi sul GC, trasferirli dalle fiale di vetro di grandi dimensioni con l'aggiunta di 200 μL di metanolo, Vortex e aggiungendo ad un tubo in polipropilene 1,5 mL. Ripetere una volta.
  3. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 10 min, 4 ° C. Trasferire il surnatante in piccole fiale di vetro, aggiungere una membrana traspirante nella parte superiore e completamente asciutta in un Vac di velocità.
  4. I metaboliti di derivatizzare aggiungendo 20 µ l di soluzione di dimethylamine la fiala del campione e vortex per 30 s su un Vortex a velocità media.
    Attenzione: Dimethylamine cloridrato provoca gravi ustioni e gravi lesioni oculari, può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Indossare occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cappa aspirante.
  5. Utilizzare un sonicatore vasca per garantire che il campione è completamente sciolto.
  6. Incubare il campione in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione mantenuto a 37 ° C per 1 h e 30 min con 1.000 giri/min agitazione.
  7. Capovolgere il flaconcino una volta per mescolare i campioni con gocce di condensate sulla superficie del tappo. Selezione del campione verso il basso a 1.000 x g per 1 min, RT
  8. Eseguire la sililazione aggiungendo 80 µ l (usando una siringa) di N-metil - N-(trimetilsilile) trifluoroacetamide con trimethylchlorosilane di 1%. Vortexare per 10 sec.
    Attenzione: Massimiliano + 1% TMC può causare corrosione cutanea, lesioni oculari gravi e tossicità d'organo specifica ed è un liquido e vapori infiammabili. Indossare occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cappa aspirante.
  9. Incubare il campione in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione mantenuto a 37 ° C per 30 min con 1.000 giri/min agitazione.
  10. Capovolgere il flaconcino una volta per mescolare i campioni con gocce di condensate sulla superficie del tappo.
  11. Selezione del campione verso il basso per 5 min a 2.000 x g, RT
  12. Trasferire la soluzione ha reagita in fiale appropriati per l'analisi GC-MS.

4. proteine digestione (tempi d ~ 1)

  1. Centrifugare il campione a 15.000 x g per 5 min, RT, a pellet eventuali detriti.
  2. Eseguire filtro-Aided--preparazione del campione (FASP) la digestione utilizzando FASP Kit (Vedi Tabella materiali) seguente modifica istruzioni31,32 del produttore:
    1. Aggiungere 400 μL di buffer urea 8 M in una colonna FASP (500 μL 30K MWCO filtro spin).
    2. Una volta che il campione ha finito di centrifugazione, pipettare il sovranatante (scartare il pellet) e aggiungere fino a 50 μL del campione a 400 μL di 8m urea nella colonna.
      Nota: Aggiungere solo fino a 50 μL di campione per ogni colonna. Se non c'è più di 50 μL di campione, utilizzare più colonne e combinare i peptidi dopo la digestione. È meglio lasciare questo volume più basso possibile (30 µ l è ideale) al fine di garantire la FASP colonna rimuoverà tutti della SDS che può interferire notevolmente con analisi massa spec.
    3. Sistemare la colonna nel tubo incluso 1,5 mL e centrifugare il campione a 14.000 x g per 30 min, RT
    4. Rimuovere il flusso continuo in rifiuti e aggiungere 400 μL di 8m urea alla colonna e centrifugare nuovamente.
    5. Ripetere il passaggio precedente ancora una volta per un totale di 3 urea risciacqui.
      Nota: Assicurarsi che il campione va vicino secchezza sulla colonna, se c'è qualche più di ~ 30 µ l restante del filtro dopo ogni giro, continuare la centrifugazione.
    6. Aggiungere 400 μL di 50mm NH4HCO3 e centrifugare a 14.000 x g per 20 min, eliminare i rifiuti e ripetere una volta.
    7. Trasferire le colonne in una provetta da centrifuga pulito 1,5 mL.
    8. Aggiungere 75 μL di tampone di digestione della tripsina alle colonne e incubare a 37 ° C per 3 h in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione a 750 giri/min.
    9. Aggiungere 40 µ l di 50mm NH4HCO3 alle colonne.
    10. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 15 min raccogliere i peptidi nel tubo, mantenendo i contaminanti di alto peso molecolare in cima alla colonna.
    11. Aggiungere 40 μL di 50mm NH4HCO3 per la colonna e centrifugare di nuovo.
  3. Scartare la colonna, a secco giù i peptidi nel tubo una Vac velocità di ~ 30 µ l e l'analisi BCA (kit di dosaggio di proteina acida bicinconinico; Vedi Tabella materiali) i peptidi.
  4. Facoltativamente, eseguire un passaggio di pulizia se sospetta contaminazione SDS (visibili bolle)33. Un'estrazione in fase solida deve essere fatto in seguito se si sceglie questa opzione. Informazioni dettagliate su questo metodo di pulizia sono disponibile nei Metodi supplementari.
  5. Diluire il campione per analisi MS o facoltativamente procedere al frazionamento di HPLC (due passaggi successivi).
  6. Per frazionare, diluire i campioni ad un volume di 400 µ l con tampone di 10 mM ammonio formiato (pH 10.0).
  7. Risolvere su una colonna C18 (Vedi Tabella materiali) separando a 0,5 mL/min utilizzando un sistema HPLC con formiato di ammonio di fasi mobili (A) 10 mM, pH 10.0 e (B) formiato di ammonio 10 mM, pH 10.0/acetonitrile (10:90).
    1. Regolare il gradiente alla 100% al 95% A oltre il primo min 10, 95% A 65% A oltre min 10 a 70, A 65% a 30% A oltre 70 a 85, mantenere alla 30% A oltre min 85 a 95 min.
    2. Riequilibrare con 100% A oltre min 95 a 105 e tenere al 100% A fino a 120 min.
    3. Raccogliere le frazioni ogni 1,25 min (96 frazioni sopra l'intera sfumatura) e infine combinare ogni riga per un totale di 12 campioni o alterni per 24 campioni (ciascuno con n = 8 o n = 4 frazioni in pool).
  8. Asciugare tutte le frazioni sotto vuoto e aggiungere 15 µ l di acqua ultrapura a ciascuno per la conservazione a-20 ° C fino all'analisi LC-MS/MS.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quando il protocollo MPLEx è stato utilizzato per estrarre le molecole da Kansas prairie nativo suolo (un Mollisol), l'analisi triplice copia fornito risultati per 3376 peptidi, 105 lipidi e 102 metaboliti polari (tutte le identificazioni uniche). Mentre il protocollo MPLEx è stato ben stabilito per estrazione generali di lipidi e metaboliti12,13,14,15,

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È importante notare che non tutti i laboratori avranno la stessa attrezzatura disponibile così determinati metodi, ad esempio il passaggio di Lisi, possono essere adattati. Qui usiamo nel vortex e sonicating, tuttavia l'uso di un battitore di perlina grande 50 mL avrebbe funzionato. Se non sono disponibile un liofilizzatori con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C, i campioni possono essere essiccati sotto un flusso di azoto. Anche i tipi di suolo variano notevolmente e possono includere sabbia, limo, argil...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrei ringraziare Nathan Johnson per la sua assistenza nel preparare le figure. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma Pan-omics che è finanziato da l'US Department of Energy Office di biologico e la ricerca ambientale (Genomic Science Program), il microbiomi in transizione (menta) laboratorio diretto lo sviluppo della ricerca Iniziativa presso il Pacific Northwest National Laboratory, come pure la nazionale istituti di salute nazionali Institute di Environmental Health Sciences (R01 ES022190) e NIH (P42 ES027704). KEBJ vorrei ringraziare R21 HD084788 sostegno finanziario sviluppare e validare nuovi multi-omic tecniche di estrazione. Quest'opera è stata eseguita nel W. R. Wiley ambientale molecolare Scienze laboratorio (EMSL), un impianto di utente scientifico nazionale DOE al laboratorio nazionale di nord-ovest Pacifico (PNNL). PNNL è un laboratorio nazionale multi-programma operato da Battelle per il DOE sotto contratto DE-AC06-76RL01830.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CloroformioSigma-Aldrich650498conservato a -20 gradi C ! Attenzione il cloroformio ha effetti acuti sulla salute, irritazione della pelle e possibili ustioni chimiche, irritazione del sistema respiratorio, può colpire i reni, il fegato, il cuore. Indossare occhiali, indumenti e guanti protettivi adeguati, lavorare in cappa aspirante.
MetanoloSigma-Aldrich34860Conservato a -20 gradi C ! Attenzione Il metanolo può causare irritazione alle vie respiratorie, alla pelle e agli occhi, può danneggiare i nervi, i reni e il fegato. Indossare occhiali, indumenti e guanti protettivi adeguati, lavorare in cappa aspirante.
Acqua purificata dalsistema di purificazione dell'acquaMillipore Milli-Q
Sodio dodecil solfatoSigma-AldrichL6026! Attenzione La SDS provoca tossicità acuta ed è infiammabile. È irritante per la pelle, gli occhi e le vie aeree. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
Kit per l'estrazione delle proteine del suoloMoBio, Kit per l'estrazione delle proteine del suolo NoviPure, Qiagen30000-20
DL-ditiotreitoloSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
Acido tricloroaceticoSigma-AldrichT0699! Attenzione Il TCA è caustico, tossico e può causare ustioni cutanee. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
AcetoneSigma-Aldrich650501conservato a -20 gradi C ! Attenzione L'acetone può causare irritazione alle vie respiratorie e alla pelle e agli occhi. Liquido e vapore infiammabili. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
UreaSigma-Aldrich208884! Attenzione L'urea è irritante per gli occhi e la pelle, utilizzare guanti e occhiali di sicurezza
Bicarbonato di ammonioFluka09830
TripsinaPromegaV528A20µ g fiale Kit per
il dosaggio delle proteine dell'acido bicinchoninicoPierce23227
Formiato di ammonioSigma-Aldrich09735
AcetonitrileSigma-Aldrich34998! Attenzione L'acetonitrile è irritante per la pelle e gli occhi. Facilmente infiammabile. Indossare guanti e occhiali di sicurezza. Lavorare in una cappa aspirante.
Acido trifluoroaceticoSigma-AldrichT6508! Attenzione Il TFA è estremamente pericoloso in caso di contatto con la pelle, contatto con gli occhi, ingestione e inalazione. Può provocare danni ai tessuti, in particolare alle mucose degli occhi, della bocca e delle vie respiratorie. Il contatto con la pelle può produrre ustioni. Indossare guanti, camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e lavorare in una cappa aspirante.
Metossiamina cloridratoSigma-Aldrich226904! Attenzione La metossiamina cloridrato provoca gravi ustioni e gravi danni agli occhi, può causare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
PiridinaSigma-Aldrich270970! Attenzione La piridina può causare irritazione della pelle e degli occhi, depressione del sistema nervoso centrale. Il vapore può causare incendi flash. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetammide con 1% di trimetilclorosilanoSigma-Aldrich69478! Attenzione MSTFA + 1% TMCS può causare corrosione della pelle, gravi danni agli occhi e tossicità specifica per organi bersaglio. Liquido e vapore infiammabili. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
Cloruro di potassioSigma-AldrichP9541
Sistema di purificazione dell'acqua Milli-QModello MilliporeMPGP04001
VortexScientific IndustriesSI-0236Vortex Genie 2
Sonicatore a sondaFisherBrandmodello FB505
Centrifuga refrigerataEppendorfmodello 5810R
Provetta da 50 ml rotore a secchiello oscillanteEppendorfA-4-44
rotore ad angolo fisso da 50 mlEppendorfFA-45-6-30
BalanceOHAUSmodello V22PWE150IT
Pipetta sierologica Eppendorf12-654-100
pipette sierologiche in vetro da 10 ml, 25 mlFisherBrand13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer con ThermotopEppendorf5382000015, 5308000003
0,9 - 2,0 mm miscela di perline di acciaio inossidabileNextAdvanceSSB14B
0,15 mm perline di granatoMoBio13122-500
Piastra di agitazione magneticaFisherBrand11-100-16SH
Barra di agitazione magneticaFisherBrand14512130
strisce di carta per pH, pH gamma 0– 14FisherBrandM95903
Provetta da centrifuga in polipropilene conica da 15 ml, 50 mlGenesee Scientific21-103 21-108compatibile con cloroformio
50 ml attacco a vorticeMoBio13000-V1-50
Secchiello per il ghiaccioFisherBrand02-591-44
Fiale in vetro da 27,25x70 mmFisherBrand03-339-22K
Respira Membrane per piastre più faciliMidwest ScientificBERM-2000
Salviette imbevute di alcolDiversified BiotechBPWP-1000
Incubatore con agitatore di riscaldamentoBenchmark, Incu-Shaker Mini
rotatore analogico per tubi girarrostoSoCal BioMed, LLC82422001
Kit di preparazione del campione assistito da filtroFASP; Expedeon44250
Lettore di micropiastreBiotek, EPOCH-20
gradi Celsius CongelatoreFisher13986149-80
gradi Celsius StirlingUltracoldSU78OUE
Q-Exactive Spettrometro di massa a trappola ionicaThermo Scientific
Agilent 7890A accoppiato a un singolo quadrupolo spettrometro di massa 5975CAgilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap VeloThermo Scientific
Waters NanoEquityTM Sistema UPLCMillford, MA
Flacone per terreni da 250 mlFisherBrand1395-250
Fiala per acqueWaters186002805
Glass Flaconcino per campioni MS e insertiMicroSolv9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass Fiala HPLC e tappi a scattoMicroSolv9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC piastra a 96 pozzettiAgilent5042-6454
Fiala in vetro grande 27,25x70mmFisherBrand03-339-22K
LiofilizzatoreLabconco7934021
Spatola a testa piatta in acciaio inox lucidoSpoonula; FisherBrand14-375-10
Salviette KimKimberly-Clark34721
XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 μ M con colonna di protezione da 4,6x20 mmWaters186003117, 186003064
Sistema HPLC Agilent serie 1100Agilent TechnologiesG1380-90000
Provetta da centrifuga da 1,7 mlHamilton Sorenson11700
, 5 ml, 50µ L e 250µ LHamilton81517, 80975, 81175
Pipette PasteurFisherBrand13-678-20A
Pipette Pasteur PipetteSigma-AldrichZ111597
Bagno SonicatoreBranson 1800 Pulitore ad
CentrifugaLabconco Centrivap Sistema
Colonne MicroSpin, C18 SiliceIl Gruppo NidoSEM SS18V
. Siringhe in vetro ultrasuoni sottovuoto di concentratore resistente agli acidi

Riferimenti

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