Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

Summary

Un protocollo è presentato per estrazione di metaboliti, proteine e lipidi da un campione di terreno singolo simultaneamente, permettendo tempi di preparazione del campione ridotto e abilitazione multi-omic analisi di spettrometria di massa di campioni con quantità limitate.

Abstract

Spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic integrato, metabolomica e studi lipidomica (multi-omic) stanno trasformando la nostra capacità di comprendere e caratterizzare le comunità microbiche in sistemi ambientali e biologici. Queste misurazioni sono anche attivazione avanzate analisi delle comunità microbiche complesse del suolo, che sono i più complessi sistemi microbici noti fino ad oggi. Analisi multi-omic, tuttavia, sono sfide di preparazione del campione, poiché estrazioni separate sono in genere necessari per ciascuno studio di omic, amplificando così notevolmente il tempo di preparazione e la quantità di campione richiesto. Per risolvere questa limitazione, è stato creato un metodo 3-in-1 per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi (MPLEx) dallo stesso campione di suolo adattando un approccio a base di solvente. Questo protocollo MPLEx ha dimostrato di essere sia semplice e robusto per molti tipi di campioni, anche quando utilizzati per quantità limitate di campioni di terreno complesso. Il metodo MPLEx abilitato anche notevolmente le misurazioni di rapida multi-omic necessari per acquisire una migliore comprensione dei membri di ogni comunità microbica, mentre la valutazione dei cambiamenti in atto su perturbazioni biologiche ed ambientali.

Introduction

Valutazione comunità microbica del suolo ha importanti implicazioni per la comprensione di carbonio in bicicletta e il cambiamento climatico. Recenti studi hanno tuttavia evidenziato difficoltà, come la mancanza di genomi sequenziati per microbiota in vari tipi di suolo e la funzione sconosciuta di molte delle proteine rilevate. Questi risultato di sfide a causa del terreno essendo più complessa comunità microbica conosciuti alla data di^1,2,3. Analisi multi-omic, che combinano risultati da metagenomica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomica e studi lipidomica, recen....

Protocol

Nota: Terreni molto bagnati possono essere liofilizzati prima dell'estrazione senza pregiudicare l'efficacia dell'estrazione. Terreno bagnato può anche essere usato, ma dovrebbe essere considerato quando si aggiungono i reagenti specifici rapporti.

Nota: Si consiglia di utilizzare 20 g di peso secco del terreno per estrazione, che deve essere diviso tra due provette da 50 mL (massimo di suolo 10g per tubo da 50 mL). Le estrazioni possono essere scalate in su o in giù dipende dal campione disponibile.

Nota: I campioni di terreno asciutto possono essere setacciati attraverso uno schermo di 3 mm al fine di omogeneiz....

Results

Quando il protocollo MPLEx è stato utilizzato per estrarre le molecole da Kansas prairie nativo suolo (un Mollisol), l'analisi triplice copia fornito risultati per 3376 peptidi, 105 lipidi e 102 metaboliti polari (tutte le identificazioni uniche). Mentre il protocollo MPLEx è stato ben stabilito per estrazione generali di lipidi e metaboliti^12,13,14,15,

Discussion

È importante notare che non tutti i laboratori avranno la stessa attrezzatura disponibile così determinati metodi, ad esempio il passaggio di Lisi, possono essere adattati. Qui usiamo nel vortex e sonicating, tuttavia l'uso di un battitore di perlina grande 50 mL avrebbe funzionato. Se non sono disponibile un liofilizzatori con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C, i campioni possono essere essiccati sotto un flusso di azoto. Anche i tipi di suolo variano notevolmente e possono includere sabbia, limo, argil.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloroformio	Sigma-Aldrich	650498	conservato a -20 gradi C ! Attenzione il cloroformio ha effetti acuti sulla salute, irritazione della pelle e possibili ustioni chimiche, irritazione del sistema respiratorio, può colpire i reni, il fegato, il cuore. Indossare occhiali, indumenti e guanti protettivi adeguati, lavorare in cappa aspirante.
Metanolo	Sigma-Aldrich	34860	Conservato a -20 gradi C ! Attenzione Il metanolo può causare irritazione alle vie respiratorie, alla pelle e agli occhi, può danneggiare i nervi, i reni e il fegato. Indossare occhiali, indumenti e guanti protettivi adeguati, lavorare in cappa aspirante.
Acqua purificata dal	sistema di purificazione dell'acqua	Millipore Milli-Q
Sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	L6026	! Attenzione La SDS provoca tossicità acuta ed è infiammabile. È irritante per la pelle, gli occhi e le vie aeree. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
Kit per l'estrazione delle proteine del suolo	MoBio, Kit per l'estrazione delle proteine del suolo NoviPure, Qiagen	30000-20
DL-ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Acido tricloroacetico	Sigma-Aldrich	T0699	! Attenzione Il TCA è caustico, tossico e può causare ustioni cutanee. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	conservato a -20 gradi C ! Attenzione L'acetone può causare irritazione alle vie respiratorie e alla pelle e agli occhi. Liquido e vapore infiammabili. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
Urea	Sigma-Aldrich	208884	! Attenzione L'urea è irritante per gli occhi e la pelle, utilizzare guanti e occhiali di sicurezza
Bicarbonato di ammonio	Fluka	09830
Tripsina	Promega	V528A	20µ g fiale Kit per
il dosaggio delle proteine dell'acido bicinchoninico	Pierce	23227
Formiato di ammonio	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998	! Attenzione L'acetonitrile è irritante per la pelle e gli occhi. Facilmente infiammabile. Indossare guanti e occhiali di sicurezza. Lavorare in una cappa aspirante.
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508	! Attenzione Il TFA è estremamente pericoloso in caso di contatto con la pelle, contatto con gli occhi, ingestione e inalazione. Può provocare danni ai tessuti, in particolare alle mucose degli occhi, della bocca e delle vie respiratorie. Il contatto con la pelle può produrre ustioni. Indossare guanti, camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e lavorare in una cappa aspirante.
Metossiamina cloridrato	Sigma-Aldrich	226904	! Attenzione La metossiamina cloridrato provoca gravi ustioni e gravi danni agli occhi, può causare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
Piridina	Sigma-Aldrich	270970	! Attenzione La piridina può causare irritazione della pelle e degli occhi, depressione del sistema nervoso centrale. Il vapore può causare incendi flash. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetammide con 1% di trimetilclorosilano	Sigma-Aldrich	69478	! Attenzione MSTFA + 1% TMCS può causare corrosione della pelle, gravi danni agli occhi e tossicità specifica per organi bersaglio. Liquido e vapore infiammabili. Indossare occhiali di sicurezza, guanti e camice da laboratorio, lavorare in una cappa aspirante.
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9541
Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q	Modello Millipore		MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Sonicatore a sonda	FisherBrand		modello FB505
Centrifuga refrigerata	Eppendorf		modello 5810R
Provetta da 50 ml rotore a secchiello oscillante	Eppendorf	A-4-44
rotore ad angolo fisso da 50 ml	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		modello V22PWE150IT
Pipetta sierologica Eppendorf		12-654-100
pipette sierologiche in vetro da 10 ml, 25 ml	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer con Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0,9 - 2,0 mm miscela di perline di acciaio inossidabile	NextAdvance	SSB14B
0,15 mm perline di granato	MoBio	13122-500
Piastra di agitazione magnetica	FisherBrand	11-100-16SH
Barra di agitazione magnetica	FisherBrand	14512130
strisce di carta per pH, pH gamma 0– 14	FisherBrand	M95903
Provetta da centrifuga in polipropilene conica da 15 ml, 50 ml	Genesee Scientific	21-103 21-108	compatibile con cloroformio
50 ml attacco a vortice	MoBio	13000-V1-50
Secchiello per il ghiaccio	FisherBrand	02-591-44
Fiale in vetro da 27,25x70 mm	FisherBrand	03-339-22K
Respira Membrane per piastre più facili	Midwest Scientific	BERM-2000
Salviette imbevute di alcol	Diversified Biotech	BPWP-1000
Incubatore con agitatore di riscaldamento	Benchmark, Incu-Shaker Mini
rotatore analogico per tubi girarrosto	SoCal BioMed, LLC	82422001
Kit di preparazione del campione assistito da filtro	FASP; Expedeon	44250
Lettore di micropiastre	Biotek, EPOCH-20
gradi Celsius Congelatore	Fisher	13986149-80
gradi Celsius Stirling	Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive Spettrometro di massa a trappola ionica	Thermo Scientific
Agilent 7890A accoppiato a un singolo quadrupolo spettrometro di massa 5975C	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM Sistema UPLC	Millford, MA
Flacone per terreni da 250 ml	FisherBrand	1395-250
Fiala per acque	Waters	186002805
Glass Flaconcino per campioni MS e inserti	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass Fiala HPLC e tappi a scatto	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC piastra a 96 pozzetti	Agilent	5042-6454
Fiala in vetro grande 27,25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Liofilizzatore	Labconco	7934021
Spatola a testa piatta in acciaio inox lucido	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Salviette Kim	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 μ M con colonna di protezione da 4,6x20 mm	Waters	186003117, 186003064
Sistema HPLC Agilent serie 1100	Agilent Technologies	G1380-90000
Provetta da centrifuga da 1,7 ml	Hamilton Sorenson	11700
, 5 ml, 50µ L e 250µ L	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pipette Pasteur	FisherBrand	13-678-20A
Pipette Pasteur Pipette	Sigma-Aldrich	Z111597
Bagno Sonicatore	Branson 1800 Pulitore ad
Centrifuga	Labconco Centrivap Sistema
Colonne MicroSpin, C18 Silice	Il Gruppo Nido	SEM SS18V