Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.
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Articolo metodologico
Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere la funzione di barriera emato - encefalica in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che promettono di migliorare la fornitura di droga del cervello, migliorare la protezione del cervello e trattare il cervello disturbi. Tuttavia, studiare la funzione umana barriera emato - encefalica è impegnativo. Così, c'è un bisogno fondamentale per modelli appropriati. A questo proposito, capillari cerebrali isolati da tessuto cerebrale umano rappresentano uno strumento unico per studiare la funzione di barriera come vicino alla situazione umana in vivo come possibile. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari dal tessuto di cervello umano a un alto rendimento e con purezza e qualità costante. I capillari sono isolati dal tessuto di cervello umano fresco mediante filtrazione, centrifugazione in gradiente di densità e omogeneizzazione meccanica. Dopo l'isolamento, i capillari del cervello umano possono essere utilizzati per varie applicazioni tra cui saggi di perdite, live cell imaging e le analisi basate su immunitario per studiare l'espressione della proteina e funzione, l'attività enzimatica o segnalazione intracellulare. Cervello umano isolato capillari sono un modello unico per delucidare il regolamento della funzione umana barriera emato - encefalica. Questo modello può fornire intuizioni nella patogenesi del sistema nervoso centrale (SNC), che aiuterà lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento di disordini dello SNC.
Introduzione
La barriera emato - encefalica è un'interfaccia strettamente controllata tra il sangue e il cervello che determina ciò che entra ed esce dal cervello. Anatomicamente, cellule endoteliali compongono la barriera emato - encefalica e forma una complessa, continua rete capillare. Fisiologicamente, questa rete capillare fornisce il cervello con l'ossigeno e le sostanze nutrienti mentre contemporaneamente smaltimento dell'anidride carbonica e le scorie metaboliche. Cosa importante, la prova sostiene che le modifiche alla barriera contribuiscano a numerose patologie, tra cui il morbo di Alzheimer, epilessia e ictus1,2
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Protocollo
Le informazioni di seguito si basano su sicurezza attuale e gli standard normativi presso l'Università del Kentucky, Lexington, KY, Stati Uniti d'America. Come precauzione di sicurezza, consultare programma sicurezza biologica dell'istituzione e delle più attuali normative e raccomandazioni prima di lavorare con tessuti umani.
Attenzione: Il tessuto umano può essere una fonte di sangue agenti patogeni, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV) e altri. Lavoro con tessuto umano comporta il rischio di infezione da patogeni presenti nel sangue. Di conseguenza, alcune considerazio....
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Risultati
Gli isolamenti da tessuto cerebrale umano resa una sospensione arricchita nei capillari del cervello umano (Figura 1B) con piccole quantità di navi più grandi, cellule di anima rosse, altre cellule singole e alcuni detriti cellulari. Alcuni capillari sono ramificati, e, in alcuni, globuli rossi sono intrappolate in lumen capillare. Il capillare tipico ha un diametro di 3 – 7 µm ed è circa 100-200 µm lungo con lumen aperta; la maggior parte delle estremità cap.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive l'isolamento dei capillari del cervello umano intatta e vitale dal tessuto fresco. In questa sezione discutiamo dettagliatamente quanto segue: 1) modifiche al protocollo, 2) risoluzione dei problemi di errori comuni, 3) le limitazioni della tecnica, 4) il significato del modello rispetto alle esistenti e modelli alternativi barriera emato - encefalica, e 5). potenziali applicazioni per i capillari del cervello umano isolato.
Il protocollo descritto qui è ottimiz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo e riconoscere Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson presso la banca del tessuto di cervello UK-ADC per la fornitura di cervello umano tutti i campioni di tessuto (NIH concedere numero: P30 AG028383 dal National Institute on Aging). Ringraziamo Matt Hazzard e Tom Dolan, servizi di Information Technology, tecnologia accademico e impegno di facoltà, Università del Kentucky per assistenza grafica. Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione numero 1R01NS079507 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (a B.B.) e dalla concessione numero 1R01AG039621 dall'Istituto nazionale su invecchiamento (per A.M.S.H.). Il contenuto è di esclusiva respon....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dispositivi di protezione individuale (DPI) | |||
| Diamond Grip Plus Guanti in lattice, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | DPI |
| Camici protettivi monouso | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | DPI; a causa della natura del materiale di origine umana, si consiglia l'uso di un camice da laboratorio monouso |
| Visiera, monouso | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | DPI; a causa della natura del materiale di origine umana, si consiglia l'uso di una visiera monouso |
| Materiali | |||
| Clavies Sacchetti per autoclave ad alta temperatura 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | per coprire le aree di lavoro |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | per bisturi usati |
| Candeggina 8,2% Clorox germicida 64 oz. | Centro di approvvigionamento del Regno Unito, Lexington, KY, Stati Uniti | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 ° C Frigorifero | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 Misuratore di pH | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Controllo | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuga | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Microscopio da dissezione | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | utilizzato per rimuovere le meningi | |
| POLYTRON PT2500 Omogeneizzatore | Kinematica AG, Lucerna, Svizzera | 9158168 | |
| Scala P-403 | Denver Instrument, Boemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flask Azoto Liquido Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | usato per congelare il tessuto? |
| Bilancia analitica Voyager Pro | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | utilizzato per controllare capillari isolati | |
| Tools e vetreria | |||
| Finnpipette II Pipetta 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | lavare via i capillari filtro |
| Finnpipette II Pipette 100-1.000 µ L | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | pellet di risospensione in BSA |
| Pipet | Boy Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Provette Falcon 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | per tritare il tessuto cerebrale |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | per coprire becher e pallone volumetrico |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | per lavare i capillari dal filtro |
| Siringa da 60 mL con Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | utilizzato con anello di connessione per filtrare i capillari |
| Manico per bisturi #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | utilizzato per tritare |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | utilizzato per rimuovere le meningi |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 mL volume, liquidazione: 150-230 μ m |
| Omogeneizzatore a dounce | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volume, liquidazione: 80-130 μ m |
| Filtri in tessuto Spectra/Mesh (300 &; micro; m) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Utilizzato per filtrare la sospensione capillare per rimuovere eventuali meningi che possono essere rimaste |
| pluriFiltri (dimensione dei pori: 30 &; micro; m) | pluriSelect Life Science, Lipsia, Germania | 43-50030-03 | |
| Anello connettore | pluriSelect Life Science, Lipsia, Germania | 41-50000-03 | riutilizzo più volte |
| Pallone | per la preparazione del tampone di isolamento | ||
| Bicchiere | per la preparazione dell'1% di | ||
| Stir Bar | BSAper la preparazione di 1% BSA e Ficoll® Flacone | ||
| Schott (60 ml) | per la preparazione di Ficoll® | ||
| Ice Bucket | per mantenere tutto freddo | ||
| Petri da 100 mm | per tritare il tessuto cerebrale | ||
| Raschietto cellulare per colture tissutali | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | per rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | preparare in DPBS con Ca2+ & Mg2+ il giorno prima. Evitare le bolle durante la preparazione. Conservare in frigorifero. Mescolare lentamente per 10 minuti prima dell'uso. |
| DPBS con Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - parte del tampone di isolamento |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | La misurazione esatta è importante qui. Pesare in bottiglia con ancoretta di combustione. Agitare viguramente dopo aver aggiunto DPBS. Conservare in frigo O/N. Sarà sereno al mattino. Mescolare delicatamente per 10-15 minuti prima dell'uso. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso. |
| Glucosio (D-(+) destrosio) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Concentrazione di glucosio (D-(+) destrosio): 5 mM |
| Soluzione standard di idrossido di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | per regolare il pH del DPBS |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentrazione: 1 mM |
Riferimenti
- Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
- Hartz, A. M., et al.
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Ristampe e permessi
