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Articolo metodologico

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

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DOI:

10.3791/57346

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12 settembre 2018

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1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Abstract

Comprendere la funzione di barriera emato - encefalica in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che promettono di migliorare la fornitura di droga del cervello, migliorare la protezione del cervello e trattare il cervello disturbi. Tuttavia, studiare la funzione umana barriera emato - encefalica è impegnativo. Così, c'è un bisogno fondamentale per modelli appropriati. A questo proposito, capillari cerebrali isolati da tessuto cerebrale umano rappresentano uno strumento unico per studiare la funzione di barriera come vicino alla situazione umana in vivo come possibile. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari dal tessuto di cervello umano a un alto rendimento e con purezza e qualità costante. I capillari sono isolati dal tessuto di cervello umano fresco mediante filtrazione, centrifugazione in gradiente di densità e omogeneizzazione meccanica. Dopo l'isolamento, i capillari del cervello umano possono essere utilizzati per varie applicazioni tra cui saggi di perdite, live cell imaging e le analisi basate su immunitario per studiare l'espressione della proteina e funzione, l'attività enzimatica o segnalazione intracellulare. Cervello umano isolato capillari sono un modello unico per delucidare il regolamento della funzione umana barriera emato - encefalica. Questo modello può fornire intuizioni nella patogenesi del sistema nervoso centrale (SNC), che aiuterà lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento di disordini dello SNC.

Introduzione

La barriera emato - encefalica è un'interfaccia strettamente controllata tra il sangue e il cervello che determina ciò che entra ed esce dal cervello. Anatomicamente, cellule endoteliali compongono la barriera emato - encefalica e forma una complessa, continua rete capillare. Fisiologicamente, questa rete capillare fornisce il cervello con l'ossigeno e le sostanze nutrienti mentre contemporaneamente smaltimento dell'anidride carbonica e le scorie metaboliche. Cosa importante, la prova sostiene che le modifiche alla barriera contribuiscano a numerose patologie, tra cui il morbo di Alzheimer, epilessia e ictus1,2,3,4,5 , 6 , 7. cervello cellule endoteliali anche servono come una barriera al trattamento bloccando l'assorbimento del farmaco nel cervello, ad es., chemioterapia del multiforme di glioblastoma seguito tumore resezione8,9, 10. A questo proposito, i capillari del cervello umano isolato rappresentano un unico ex vivo barriera emato - encefalica modello che ricorda da vicino barriera proprietà in vivo, che consente lo studio della funzione della barriera e della disfunzione in salute e la malattia. In questo articolo, forniamo un protocollo per isolare i capillari del cervello dal cervello umano a una qualità costantemente elevata capillare e resa per studiare la barriera emato - encefalica.

Nel 1969, Siakotos et al. 11 sono stati i primi a segnalare l'isolamento dei capillari del cervello dal tessuto di cervello bovino e umano usando densità gradiente centrifugazione e vetro perlina colonna di separazione. Più tardi, Goldstein et al. 12 migliorato questo metodo aggiungendo più passaggi di filtrazione per diminuire la quantità di tessuto necessaria per studiare i capillari cerebrali isolati dai ratti, pur mantenendo l'attività metabolica di trasporto del glucosio. Da allora, i ricercatori hanno ottimizzato la procedura di isolamento capillare numerose volte, miglioramento del metodo e cervello modello capillare con ciascuna iterazione13,14,15. Ad esempio, atomo et al. 16 isolato bovina capillari tramite digestione enzimatica piuttosto che omogeneizzazione meccanica e quindi successivamente passata una sospensione capillare attraverso un filtro a rete 210 µm e una colonna di perlina di vetro. Queste modifiche migliorato la macchia di esclusione del trypan blu dei capillari cerebrali isolato e quindi, aumentato di attuabilità delle cellule endoteliali. Nel 1990, Dallaire et al. 17 isolato capillari bovini e ratto che erano chiare di un neurone contaminazione e mantenuto l'attività metabolica di γ-glutamil transpeptidasi (γ-GTase) e della fosfatasi alcalina. Nel 2000, Miller et al. 18, usato isolati del ratto e capillari cerebrali suina in combinazione con microscopia confocale per mostrare l'accumulo dei substrati di trasporto nel lumen dei vasi capillari. Successivamente, il nostro laboratorio ha continuato ad ottimizzare la procedura di isolamento capillare del cervello e abbiamo stabilito i saggi di trasporto per determinare la P-glicoproteina (P-gp)19,20,21, cancro al seno resistenza della proteina (BCRP)22,23e multi-farmaco resistenza proteina 2 (Mrp2) attività di trasporto di24 . Nel 2004, abbiamo pubblicato due relazioni dove abbiamo usato capillari cerebrali isolati del ratto per studiare varie vie di segnalazione. A Hartz et al. 21, abbiamo trovato che il peptide endotelina-1 rapidamente e reversibilmente ridotta funzione di trasporto P-gp in capillari cerebrali agendo attraverso del recettore dell'endotelina recettori B (ETB), l'ossido nitrico sintasi (NOS) e protein chinasi C (PKC). In Bauer et al. 19, abbiamo dimostrato l'espressione del recettore recettore nucleare pregnane X (PXR) e ha mostrato PXR-modulazione della funzione di espressione e di trasporto P-gp nei capillari del cervello. Negli esperimenti con i topi transgenici di PXR umanizzati, abbiamo ampliato questa linea di ricerca e ha dimostrato in vivo di serraggio della barriera di upregulating P-gp attraverso l'attivazione di hPXR25. Nel 2010, Hartz et al. 26 utilizzato questo approccio per ripristinare l'espressione della proteina P-gp e attività nei topi di proteina (hAPP) precursore dell'amiloide umana transgenici che sovraesprimono hAPP di trasporto. Inoltre, ripristino di P-gp in hAPP topi significativamente riducono di beta amiloide (Aβ)40e livelli del cervello Aβ42.

Oltre a studiare le vie di segnalazione, capillari cerebrali isolato possono essere utilizzati per determinare cambiamenti nella permeabilità capillare che ci riferiamo come perdita capillare. In particolare, l'analisi di perdita Texas Red è usata per valutare la perdita della tintura fluorescente Texas Red dal lume capillare nel tempo e questi dati vengono quindi utilizzati per analizzare i tassi di perdita. Tassi di perdita capillare aumentato rispetto a quelli da capillari di controllo indicano cambiamenti nell'integrità fisica della barriera emato - encefalica2. Questo è prezioso perché ci sono numerosi Stati di malattia connessi con rottura della barriera, ad es., epilessia, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer e cerebrali traumatiche lesioni27,28,29, 30. Altri gruppi hanno anche utilizzato isolati capillari per discernere le vie di segnalazione che regolano l'espressione della proteina e l'attività di trasporto delle proteine31,32,33,34, 35,36,37. Infine, abbiamo continuato ad ottimizzare questo metodo per l'isolamento dei capillari del cervello umano e, recentemente, abbiamo mostrato l'espressione aumentata di P-gp umana barriera emato - encefalica nei pazienti con epilessia rispetto a individui di controllo di grippaggio-libero38 . Presi insieme, questi sviluppi dimostrano che i capillari cerebrali isolato possono servire come un modello versatile per studiare la funzione della barriera.

Vari in vivo, ex vivoe in vitro di barriera emato - encefalica modelli sono stati utilizzati nella ricerca di base e lo screening di stupefacenti industriali, principalmente con l'obiettivo della prova di consegna della droga per il cervello39,40,41 ,42,43,44. Oltre alle isolato ex vivo capillari cerebrali, attuale barriera emato - encefalica modelli includono modelli in silico , in vitro di colture cellulari di cellule endoteliali dei capillari del cervello isolato o linee cellulari immortalizzate da vari specie, coltura in vitro di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che si differenziano in cellule endoteliali dei capillari del cervello e modelli di microfluidica su un chip.

In silico modelli sono più comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci per la selezione di candidati farmaci basati sul predetto assorbimento, distribuzione, metabolismo e l'escrezione (ADME) proprietà. Metodi quali modelli di relazione (QSPR) quantitative struttura-proprietà e modelli di relazione (QSAR) quantitativa struttura-attività sono metodi comuni utilizzati in high throughput screening di librerie prevedere cervello penetrazione di candidati farmaci 45 , 46. questi modelli sono utili per molecole di schermo per le proprietà di penetrazione della barriera.

Betz et al. 47 monostrati di cellule endoteliali dei capillari cerebrali coltivate, ricavandone un sistema modello in vitro della barriera emato - encefalica. In vitro modelli della coltura cellulare utilizzando tessuto fresco o linee cellulari endoteliali immortalizzate come le cellule endoteliali del microvessel cerebrale umana (hCMECs) possono essere un altro strumento di screening ad alta resa per la penetrazione di cervello o studi meccanicistici. Tuttavia, modelli di cultura delle cellule endoteliali capillari del cervello mancano la sollecitazione di taglio fisiologica del flusso sanguigno all'interno del lume capillare, sono limitate nella complessità nel complesso biologico e subiscono cambiamenti nell'espressione e localizzazione dei componenti importante barriera come le proteine di giunzione stretta, ioni, trasportatori, enzimi e recettori di superficie canali48,49,50. Al contrario, monostrati endoteliali derivati da hPSCs, hanno saccarosio bassa permeabilità rispetto alle culture hCMEC/D3 e contengono espressione polarizzata di alcuni trasportatori di barriera emato - encefalica, molecole di adesione e giunzioni strette51, 52. Tuttavia, queste cellule sono anche soggetti a modifica proprietà nella cultura, e il sistema deve essere validato per la ricapitolazione di in vivo proprietà barriera52.

Le tendenze più recenti nella barriera emato - encefalica ricerca includono utilizzando sistemi di coltura del tessuto 3D per creare capillari artificiali, utilizzando la tecnologia di organo-on-chip per generare dispositivi microfluidici, o che utilizzano la tecnologia a fibra cava53, 54 , 55. capillari artificiali, tuttavia, sono significativamente più grandi diametri (100 – 200 µm) di capillari cerebrali (3 – 7 µm). Quindi, il taglio forze in vitro non completamente simile la situazione in vivo . Questo viene affrontato in dispositivi microfluidici "blood-brain-barrier-on-a-chip", dove compartimenti di "sangue" e "cervello" di forma membrane artificiali e fluidi vengono pompati attraverso questi dispositivi che generano forze di taglio di microfluidica. Allo stesso modo, co-colture di cellule endoteliali in varie combinazioni con gli astrociti e cellule muscolari lisce vascolari sono stati anche utilizzate con la tecnologia a fibra cava per ricreare i parametri reologici presenti sotto nel vivo condizioni56 , 57 , 58. Tuttavia, non è chiaro quanto bene questo modello riflette altre proprietà della barriera sangue - cervello come trasporto, metabolismo, segnalazione e altri. Questi modelli artificiali capillare e chip sono adatti per high throughput screening di farmaci, ma le cellule utilizzate per generare questi modelli sono anche soggetti a modifiche durante la coltura.

Fette del cervello congelato e fisso o colture di cellule endoteliali capillari sono ulteriori modelli che possono essere utilizzato perlo studio del microcircolo umano5,59,60,61primario del cervello. Ad esempio, immunoistochimica del tessuto cerebrale fisso viene utilizzato per determinare la localizzazione della proteina, e l'espressione in sano rispetto al tessuto malato.

Oltre alle fettine di tessuto e i modelli in vitro capillari cerebrali di cui sopra, appena isolate possono essere utilizzati per studiare la funzione di barriera emato - encefalica. Limitazioni di questo modello capillare isolato includono la difficoltà per ottenere il tessuto cerebrale umano fresco, assenza di astrociti e neuroni e un processo relativamente lungo isolamento. Un vantaggio del modello capillare del cervello isolato è che questo modello ricorda da vicino la situazione in vivo e, pertanto, può essere utilizzato per caratterizzare la disfunzione e la funzione di barriera. Importante, può anche essere utilizzato per discernere i meccanismi di segnalazione utilizzando una moltitudine di saggi e tecniche molecolari3,19,62,63.

Il nostro laboratorio ha accesso a sia il tessuto fresco e congelato del cervello umano attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M)64. In questo contesto, le autopsie seguono un protocollo standard, cervelli sono ottenuti < 4h e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Dato questo unico accesso al tessuto cerebrale umano, abbiamo stabilito e ottimizzato un protocollo per isolare i capillari del cervello dal tessuto di cervello umano che si traduce in un alto rendimento dei capillari del cervello umano intatto, praticabile. Due endpoint comune di interesse sono per determinare l'espressione della proteina e l'attività. A questo proposito, noi ed altri abbiamo stabilito vari saggi che possono essere utilizzati con capillari cerebrali isolato per studiare l'espressione della proteina e livelli di attività. Questi test includono Western blotting, analisi di Western semplice, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), zimografia, analisi di attività di trasporto, e saggi di perdita capillare. Queste analisi permettono ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella funzione della barriera in condizioni patologiche umane, determinare le vie che regolano l'attività e l'espressione della proteina e identificare bersagli farmacologici per il trattamento della barriera emato - encefalica associata malattie.

Presi insieme, appena capillari cerebrali isolato possono servire come un modello affidabile e riproducibile della barriera sangue - cervello. In particolare, questo modello può essere abbinato molti diversi saggi per determinare una vasta gamma di endpoint per studiare la funzione di barriera.

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Protocollo

Le informazioni di seguito si basano su sicurezza attuale e gli standard normativi presso l'Università del Kentucky, Lexington, KY, Stati Uniti d'America. Come precauzione di sicurezza, consultare programma sicurezza biologica dell'istituzione e delle più attuali normative e raccomandazioni prima di lavorare con tessuti umani.

Attenzione: Il tessuto umano può essere una fonte di sangue agenti patogeni, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV) e altri. Lavoro con tessuto umano comporta il rischio di infezione da patogeni presenti nel sangue. Di conseguenza, alcune considerazioni di sicurezza e normativi sono indispensabili quando si lavora con tessuti umani per proteggere il personale di laboratorio. Lavorare con tessuto umano negli Stati Uniti richiede un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, nonché precauzioni di sicurezza e formazione secondo NIH sezione IV-B-7, OSHA Act del 1970 clausola 5(a)(1) e programma istituzionale sicurezza biologica dell'utente. In generale, approvazione Comitato istituzionale biosicurezza e/o Institutional Review Board deve essere ottenuto prima di svolgere qualsiasi ricerca che coinvolge umani materiali (tessuti, fluidi corporei). La formazione è necessaria per tutti coloro che lavorano con materiali umani e include training di sicurezza di laboratorio di base, ad es., chimica igiene e sicurezza del laboratorio, nonché formazione specifica sulla sicurezza biologica, rifiuti pericolosi e umani patogeni presenti nel sangue. Tutti coloro che lavorano con materiali umani è altamente raccomandati per ottenere le vaccinazioni di epatite B, prima di lavorare con materiali umani. Personale sono tenuto a indossare specifici dispositivi di protezione individuale durante il lavoro con materiali umani, ad es., un camice da laboratorio con risvolto e una faccia scudo e indossare i guanti in ogni momento. Tutto il lavoro viene eseguito in una cappa di biosicurezza (classe 2). Tutte le apparecchiature che viene in contatto con materiali di umani e ogni rifiuti da materiali umani viene gestita in modo appropriato per evitare contaminazione e/o infezione del personale. Tutte le attrezzature e le superfici vengono pulite con etanolo al 10% candeggina e il 75% dopo ogni procedura che coinvolga materiali umani. Una fuoriuscita con materiali umani dovrà essere immediatamente pulita. La cristalleria è sterilizzato nell'autoclave dopo ogni utilizzo. Rifiuti, compreso il tessuto umano non fissato, sono raccolti in un sacchetto di rifiuti con etichetta biohazard e sterilizzati in autoclave. Sharps sono raccolti in un contenitore di puntura e antiperdita etichettato come biologici pericoloso. Tutti i rifiuti da materiali umani sono stato eliminato secondo norme di sicurezza biologica dell'istituzione.

Nota: Il nostro laboratorio ottiene i campioni freschi corteccia frontale da individui deceduti attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M). Criteri di inclusione sono: registrazione in studio del gruppo di analisi longitudinale UK-ADC e un intervallo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autopsie seguono un protocollo standard e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Un breve PMI di meno di 4 ore è di massima importanza per garantire redditività capillare dopo l'isolamento. Possono essere utilizzati tessuti sia freschi che congelati. Se il congelamento è necessario, tessuto cerebrale umano appena ottenuti dovrebbe essere scossa-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C. Tessuto fresco o scongelato dovrebbe essere memorizzato nel buffer di isolamento (Vedi sotto) ed elaborato rapidamente. Troviamo che 10 g di tessuto umano fresco rendimenti circa 100 mg di capillari cerebrali (peso umido).

1. installazione

  1. Preparazione del tampone
    Nota: Il volume di tampone necessario dipende dalla quantità di tessuto. Tutti i volumi di buffer nel protocollo seguente sono basati su 10 g di tessuto di corteccia del cervello umano.
    1. L isolamento Buffer: Utilizzare 1,5 L di soluzione tampone fosfato e di Dulbecco (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completare con 5 mM D-glucosio (1,35 g ) e 1 mM sodio piruvato (0,165 g). Dopo l'aggiunta del glucosio e del piruvato, regolare a pH 7.4 con idrossido di sodio. Raffreddare e conservare il buffer a 4 ° C prima dell'uso.
    2. Albumina di siero bovino (BSA): Aggiungere 10 g di polvere di BSA a 1 L di tampone di isolamento a una concentrazione finale di BSA 1%. Mescolare lentamente per evitare bolle, regolare a pH 7.4 e conservare a 4 ° C durante la notte. Immediatamente prima dell'uso, mescolare delicatamente; evitare la formazione di bollicine per evitare la denaturazione di albumina.
    3. medio di gradienti di densità: pesare 18 g di medio gradiente di densità in una bottiglia di vetro e aggiungere un ancoretta magnetica. Aggiungere 60 mL di buffer di isolamento e agitare vigorosamente per 5 minuti fino a quando tutti i polvere viene sospesa. Archivio durante la notte a 4 ° C per consentire allo densità gradiente a sciogliere. Mescolare per 10 min destra prima dell'uso.
    4. Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C; mantenere tutti gli strumenti e buffer sul ghiaccio durante la procedura di isolamento intero. Mescolare tutti i buffer prima dell'uso.
  2. Messa a punto sperimentale
    1. Montare il pestello del macinino Potter-Chazen tessuto sull'agitatore elettronico. Posto il Potter-Chazen tessuto smerigliatrice e l'omogeneizzatore lisata con pestello su ghiaccio sotto il cofano. Preparare una maglia del filtro 300 µm (5 x 5 cm2), piegarlo ad un cono e inserire e allegarlo a un 50 mL tubo Falcon con nastro (Figura 1A).
    2. Inserire anelli di collegamento e filtri di ceppo di cella (dimensione dei pori: 30 µm) su provette Falcon da 50 mL. Preparare sacchetti di rifiuti a rischio biologico. Collocare tutte le necessarie attrezzature nella biosicurezza armadio (Vedi Tabella materiali).

2. preparazione del campione cervello

Nota: La Figura 1A Mostra il diagramma di flusso di lavoro della procedura intero isolamento descritta di seguito. Tessuto di cervello umano può provenire da qualsiasi parte della corteccia e può essere utilizzato fresco o congelato. Tessuto cerebrale congelati possa essere scongelato a temperatura ambiente (nessun buffer; ~ 30 min per 10 g). Per ottenere risultati comparabili, il tessuto cerebrale dovrebbe essere ottenuto dalla stessa regione del cervello per ogni esperimento. Questo protocollo è ottimizzato per fresh (PMI < 4h) corteccia cerebrale umana che non è stato congelato.

  1. Preparazione del tessuto di cervello umano: documentare il peso del tessuto cerebrale. Tutti i numeri nel seguente protocollo sono adatti per 10 g di tessuto cerebrale umano fresco. Posizionare il tessuto cerebrale in un 100mm di Petri. Rimuovere con cura tutte le meningi con il forcipe. Utilizzare un bisturi per tagliare la materia bianca.
  2. Macinazione del tessuto cerebrale umano: attentamente tagliare il tessuto cerebrale e usa mezzi con un bisturi. Tritare per circa 5 min (2 – 3 mm pezzi). Trasferire il tessuto cerebrale per la smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen. Aggiungere 30 mL di buffer di isolamento.
    Nota: I pezzi di tessuto macinate sono difficili da vedere dato che il tessuto cerebrale si trasforma in poltiglia attraverso il processo di macinazione.

3. omogeneizzazione

  1. Smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen (clearance: 150 – 230 µm): omogeneizzare ogni campione con 100 colpi ad una velocità di omogeneizzatore di 50 giri/min. Documentare il tempo ogni 25 colpi e il tempo totale necessario per 100 colpi. Vedere la tabella 1 per un protocollo di omogeneizzazione proposto; il tempo totale per l'omogeneizzazione di 10 g di corteccia frontale umana è circa 22 min. Non si mescoli in aria per evitare bolle.
  2. Lisata omogeneizzatore (clearance: 80 – 130 µm): trasferire l'omogeneizzato in un omogeneizzatore lisata sul ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione con 20 colpi (~ 6 s/corsa, totale di ~ 2 min). Evitare le bolle.

4. centrifugazione

  1. Distribuire equamente omogeneato del cervello in quattro provette da 50 mL centrifugazione e il volume totale dell'omogeneato del documento. Distribuire 50 mL di tampone di gradienti di densità nelle provette centrifugazione (12,5 mL per tubo). Utilizzare 10 mL di buffer di isolamento per sciacquare il pestello e omogeneizzatore e dividere i quattro tubi di centrifugazione (~2.5 mL per tubo).
  2. Chiudere bene le provette per centrifuga con tappi. Mescolare l'omogeneato, densità gradiente medio e buffer agitando vigorosamente i tubi. Centrifugare a 5.800 x g per 15 min a 4 ° C (rotore ad angolo fisso); Selezionare una velocità di decelerazione media di mantenere il pellet fissato al tubo. Scartare il surnatante e risospendere in 2 mL di BSA 1% ciascuna.

5. filtrazione

Nota: Per separare i capillari da globuli rossi e altri detriti cellulari, sono necessari diversi passaggi di filtrazione.

  1. maglia di 300 µm: dopo la ri-sospensione il pellet, filtrare la sospensione attraverso la maglia di 300 µm. Capillari vengono filtrati attraverso la rete, considerando che le navi più grandi e più grande cervello detriti rimangono sulla mesh. Lavare accuratamente la mesh con fino a 50 mL di BSA 1%. Scartare la mesh.
    Nota: Questo passaggio di filtrazione Cancella la sospensione capillare da qualsiasi più grandi vasi o porzioni di detriti di cervello.
  2. Filtro di ceppo di celle 30 µM
    Nota: Questo passaggio di filtrazione separa capillari da globuli rossi e altri detriti di cervello.
    1. Distribuire il capillare filtrato da 6.1 scavalcare i filtri di ceppo di cella cinque 30 µm (circa 10 mL di filtrato capillare al filtro di ceppo di celle). I capillari sono ostacolati da questo filtro, considerando che globuli rossi, altre singole cellule e detriti piccolo cervello passano attraverso il filtro e vengono raccolti nel filtrato.
    2. Lavare ogni filtro con 25 mL di BSA 1%. In seguito, versare filtrati tutti sopra il sesto filtro per aumentare il rendimento. Lavare ogni filtro con 50 mL di BSA 1%; mantenere la cella ceppo filtri con contenente i capillari e scartare il filtrato.

6. prelievo

  1. Capovolgere i filtri e lavare i capillari di BSA 1% per ogni filtro 50 ml in provette da 50 mL. Applicare pressione con la punta della pipetta un pipettatore 5ml delicatamente e spostarlo attraverso il filtro per lavare via i capillari del cervello.
  2. Assicurarsi di lavare tutti i capillari cerebrali, soprattutto dal bordo del filtro. Evitare le bolle poiché questo rende più difficile il processo di filtrazione e aumenta la probabilità di perdita capillare.

7. lavaggio

  1. Dopo aver raccolto i capillari, centrifugare tutti i campioni a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C (rotore oscillante). Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in circa 3 mL di buffer di isolamento. Combinare tutti i pellet sedimento da un campione in una provetta conica da 15 mL e riempirlo con buffer di isolamento. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C e lavare due volte.
  2. Documentare la purezza capillare con un microscopio (ingrandimento 100 X) e la macchina fotografica (Figura 1B).
    Nota: La resa capillare del cervello da 10 g di tessuto cerebrale umano è in genere circa 100 mg. I capillari del cervello isolato possono ora essere utilizzati per esperimenti, elaborati (ad es., lisato, isolamento di membrana), o essere flash-congelati e conservati a-80 ° C in provette per criogenia per un minimo di 6 – 12 mesi (evitare più cicli di gelo-disgelo).

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Risultati

Gli isolamenti da tessuto cerebrale umano resa una sospensione arricchita nei capillari del cervello umano (Figura 1B) con piccole quantità di navi più grandi, cellule di anima rosse, altre cellule singole e alcuni detriti cellulari. Alcuni capillari sono ramificati, e, in alcuni, globuli rossi sono intrappolate in lumen capillare. Il capillare tipico ha un diametro di 3 – 7 µm ed è circa 100-200 µm lungo con lumen aperta; la maggior parte delle estremità cap...

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Discussione

Il presente protocollo descrive l'isolamento dei capillari del cervello umano intatta e vitale dal tessuto fresco. In questa sezione discutiamo dettagliatamente quanto segue: 1) modifiche al protocollo, 2) risoluzione dei problemi di errori comuni, 3) le limitazioni della tecnica, 4) il significato del modello rispetto alle esistenti e modelli alternativi barriera emato - encefalica, e 5). potenziali applicazioni per i capillari del cervello umano isolato.

Il protocollo descritto qui è ottimiz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo e riconoscere Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson presso la banca del tessuto di cervello UK-ADC per la fornitura di cervello umano tutti i campioni di tessuto (NIH concedere numero: P30 AG028383 dal National Institute on Aging). Ringraziamo Matt Hazzard e Tom Dolan, servizi di Information Technology, tecnologia accademico e impegno di facoltà, Università del Kentucky per assistenza grafica. Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione numero 1R01NS079507 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (a B.B.) e dalla concessione numero 1R01AG039621 dall'Istituto nazionale su invecchiamento (per A.M.S.H.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo o l'Istituto nazionale su invecchiamento. Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dispositivi di protezione individuale (DPI)
Diamond Grip Plus Guanti in lattice, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636DPI
Camici protettivi monousoVWR, Radnor, PA, USA470146-214DPI; a causa della natura del materiale di origine umana, si consiglia l'uso di un camice da laboratorio monouso
Visiera, monousoThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA19460102DPI; a causa della natura del materiale di origine umana, si consiglia l'uso di una visiera monouso
Materiali
Clavies Sacchetti per autoclave ad alta temperatura 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32per coprire le aree di lavoro
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272per bisturi usati
Candeggina 8,2% Clorox germicida 64 oz.Centro di approvvigionamento del Regno Unito, Lexington, KY, Stati Uniti323775
Equipment
4 ° C FrigoriferoThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA13-986-148
Accume BASIC AB15 Misuratore di pHThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAAB15
Heidolph RZR 2102 ControlloHeidolph, Elk Grove Village, IL, USA501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR CentrifugaThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75004521
Leica L2 Microscopio da dissezioneLeica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USAutilizzato per rimuovere le meningi
POLYTRON PT2500 OmogeneizzatoreKinematica AG, Lucerna, Svizzera9158168
Scala P-403Denver Instrument, Boemia, NY, USA0191392
Standard mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA1151050
Thermo-Flask Azoto Liquido DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Cusato per congelare il tessuto?
Bilancia analitica Voyager ProOHAUS, Parsippany, NJ, USAVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USAutilizzato per controllare capillari isolati
Tools e vetreria
Finnpipette II Pipetta 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1lavare via i capillari filtro
Finnpipette II Pipette 100-1.000 µ LThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1pellet di risospensione in BSA
PipetBoy Integra, Hudson, NH, USA739658
50 mL Provette Falcon 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCO Scalpel BladesThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Cper tritare il tessuto cerebrale
PARAFILMVWR, Radnor, PA, USA52858-000per coprire becher e pallone volumetrico
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304per lavare i capillari dal filtro
Siringa da 60 mL con Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USABD309653utilizzato con anello di connessione per filtrare i capillari
Manico per bisturi #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13utilizzato per tritare
Dumont Forceps #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10utilizzato per rimuovere le meningi
Potter-Elvehjem Tissue GrinderThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E2550 mL volume, liquidazione: 150-230 μ m
Omogeneizzatore a dounceVWR, Radnor PA USA62400-64215 mL volume, liquidazione: 80-130 μ m
Filtri in tessuto Spectra/Mesh (300 &; micro; m)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA146424Utilizzato per filtrare la sospensione capillare per rimuovere eventuali meningi che possono essere rimaste
pluriFiltri (dimensione dei pori: 30 &; micro; m)pluriSelect Life Science, Lipsia, Germania43-50030-03
Anello connettorepluriSelect Life Science, Lipsia, Germania41-50000-03riutilizzo più volte
Palloneper la preparazione del tampone di isolamento
Bicchiereper la preparazione dell'1% di
Stir BarBSAper la preparazione di 1% BSA e Ficoll® Flacone
Schott (60 ml)per la preparazione di Ficoll®
Ice Bucketper mantenere tutto freddo
Petri da 100 mmper tritare il tessuto cerebrale
Raschietto cellulare per colture tissutaliVWR, Radnor, PA, USA89260-222per rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA9647-500gpreparare in DPBS con Ca2+ & Mg2+ il giorno prima. Evitare le bolle durante la preparazione. Conservare in frigorifero. Mescolare lentamente per 10 minuti prima dell'uso.
DPBS con Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - parte del tampone di isolamento
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375La misurazione esatta è importante qui. Pesare in bottiglia con ancoretta di combustione. Agitare viguramente dopo aver aggiunto DPBS. Conservare in frigo O/N. Sarà sereno al mattino. Mescolare delicatamente per 10-15 minuti prima dell'uso. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
Glucosio (D-(+) destrosio)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528Concentrazione di glucosio (D-(+) destrosio): 5 mM
Soluzione standard di idrossido di sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474per regolare il pH del DPBS
Piruvato di sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256Concentrazione: 1 mM
di sicurezza volumetrico da 1 L da 1 L Piastra di

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