Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Attività neuronale nei mammiferi è coordinato dalle oscillazioni di rete, che assistono il trasferimento di informazioni all'interno e tra le regioni del cervello^1,2,3,4. Ritmi del cervello sono oscillazioni che vanno da molto lento (< 0,8 Hz) fino a frequenze di ultraveloce (> 200 Hz). Un grande corpo di prova sostiene il coinvolgimento delle oscillazioni di rete nelle funzioni cerebrali diverse, tra cui cognizione^5,6,7,8,9,10 , comportamenti innati^11,12 , come pure i disordini neuropsichiatrici quali morbo di Parkinson e l'epilessia^13,14,15. Metodi selettivi e temporalmente precisi per manipolazione sperimentale delle oscillazioni di rete sono quindi essenziali per lo sviluppo di modelli fisiologicamente plausibile di sincronizzazione e per stabilire relazioni causali con comportamento.

Sincronizzazione di rete è mediata da diversi substrati biologici e processi, che vanno dalla identità molecolare dei canali ionici e loro cinetica di neuromodulazione dell'eccitabilità e della connettività di rete. Il disegno biologico del ritmo generatori¹⁶ è stato rivelato per molti ritmi del cervello, aspetti distinti di cui (ad esempio, frequenza, ampiezza) sono spesso causata da dinamiche di tipi cellulari e reti. Per esempio, interneuroni inibitori targeting il somata delle cellule principali sono i giocatori più importanti attraverso bande di frequenza e cervello regioni^17,18, tra cui theta^19,20, gamma^{20 , 21}e ripple (140-200 Hz)²² oscillazioni. A sua volta, sincronizzazione di fase delle cellule distanti è assicurata dalla robusta feed-forward segnalazione delle cellule piramidali, che reimposta l'infornamento di interneuroni. Un parametro cruciale delle oscillazioni, la dimensione della popolazione neuronale sincronizzata, è strettamente correlato alla ampiezza di oscillazione di LFP misurato e, almeno per veloce oscillazioni, dipende l'unità eccitatorio sulla interneuroni². Al contrario, oscillazioni più lente, come delta e theta ritmi, vengono generate dai cicli rientrante a lungo raggio, formate da cortico-thalamic^23,24 e proiezioni settale mediale hippocampal^{25, 26,27}, rispettivamente. Oscillazioni in tali circuiti sono provocate da interazioni di ritardi di propagazione del segnale, eccitabile risposte e la loro preferenza di frequenza in cellule partecipanti^{28,29,30, 31 , 32}. inibitorie proiezioni da parvalbumina GABAergici (PV)-positive sono cellule del setto mediale (MS) a interneuroni in ippocampo^25,33, parahippocampal regioni e corteccia di entorhinal²⁶ essenziale per la generazione delle oscillazioni di teta nel lobo temporale mediale. Così, i meccanismi fisiologici delle oscillazioni di rete e sincronizzazione neuronale possono essere manipolate usando optogenetica con una precisione in tempo reale.

Cella tipo-specific optogenetica manipolazioni sono state applicate per lo studio delle oscillazioni ippocampali e corticali in vitro^{34,35,36,37,38} e in vivo^{30,39,40,41,42,43,44,45}, tra cui funzionale le indagini di gamma^{5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52} e ripple oscillazioni^40,53,54 e sonno mandrini^55,56. Recentemente abbiamo espresso un virus ChR2 Cre-dipendente negli Stati membri, una regione chiave per la generazione del ritmo Teta hippocampal, di PV-Cre topi. Utilizzando questa preparazione, caratteristiche delle oscillazioni Teta hippocampal (frequenza e stabilità temporale) sono stati controllati da optogenetica stimolo inibitorio proiezioni del MS in ippocampo¹¹. Inoltre, lo stimolo optogenetica Teta-frequenza delle proiezioni setto-ippocampale inibitorie evocato ritmo theta durante sveglio immobilità. Il optogenetically trascinato ritmo theta visualizzato proprietà delle oscillazioni spontanee theta nel topo a livello di attività neuronale e LFP.

Caratteristiche principali di questo protocollo includono: (1) utilizzo di una via inibitoria che è fisiologicamente fondamentale per le oscillazioni spontanee Teta, evitando effetti aspecifici sull'eccitabilità hippocampal; (2) assonale, cioè, la stimolazione di proiezione specifiche per ridurre al minimo un'influenza diretta sulla non-ippocampale MS efferenze; (3) locale theta-ritmica stimolazione luminosa, assicurando una minima interferenza diretta con dinamiche septo-hippocampal theta-ritmica e un trascinamento globale bilaterale delle oscillazioni theta; (4) parametrici Teta oscillazioni frequenza e regolarità; e (5) quantificazione della fedeltà di trascinamento con elevata risoluzione temporale utilizzando LFP per consentire un'analisi quantitativa di causalità a comportarsi gli animali. Poiché questa preparazione essenzialmente capitalizza un ruolo ben noto della disinibizione setto-ippocampale in theta generazione^25,30, permette la regolazione robusto sopra diversi parametri delle oscillazioni di teta in topi si comporta. Gli studi dove altri meno studiati percorsi e tipi di cellule della circuiteria septo-hippocampal sono stati manipolati^{38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} rivelare ulteriori meccanismi del ritmo theta.

PV-Cre topi knock-in maschio⁵⁹, 10-25 settimane, sono stati utilizzati. Topi sono stati stabulati in condizioni standard nella struttura animali e tenuti su un ciclo luce/buio di 12 h. Tutte le procedure sono state effettuate in conformità alle linee guida nazionali ed internazionali e sono state approvate dalle autorità sanitarie locali (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. virale iniezione

1. Durante l'intera procedura, seguire le linee guida di sicurezza biologica⁶⁰. Indossare un camice, mascherina chirurgica, una retina e due paia di guanti.
2. Tubazione con un bisturi sterile o forbici del taglio di circa 1 m di lunghezza, inserirlo nel blocco siringa titolare della pompa e risolvere il problema.
   1. Utilizzando la siringa, riempire il tubo interamente con olio di silicone.
   2. Verificare se le bolle d'aria visibili nella tubazione. Se si osservano bolle d'aria, riempire nuovamente il tubo con olio.
   3. Difficoltà lo stantuffo per il blocco di pusher.
   4. Far avanzare lentamente il pestello verso il blocco di porta siringa fino a quando la punta dello stantuffo tocca il tubo.
   5. Inserire la punta del pistone nel tubo e spostare automaticamente il blocco di spintore avanti a bassa velocità selezionando "Infondere" nella finestra di comando e un tasso di infusione bassa (ad esempio, 500 nL/min) fino a raggiungere il blocco porta siringa.
3. Preparare l'ago per iniezione (34G).
   1. Rimuovere il mozzo dell'ago con un chiaro taglio utilizzando un trapano fresatore precisione collegato a un disco di taglio. Se necessario, utilizzare un ago per rimuovere residui metallici dalla superficie appena tagliata.
   2. Filettatura tubi capillari (3-4 cm di lunghezza) attraverso l'ago.
   3. Incollare l'ago al tubo con colla super.
   4. Collegare l'ago per iniezione all'estremità della tubazione, che collega alla pompa microsiringa.
4. Montare l'ago al titolare stereotassica.
5. Estrarre aria fino a quando una bolla d'aria nel tubo trasparente sopra l'ago è visibile.
6. Anestetizzare il mouse con isoflurane 1.5-3% in ossigeno. Attendere circa 2-3 min, quindi confermare che il mouse è completamente anestetizzato valutando la sua risposta a un pizzico di punta. In tutta la chirurgia monitorare la respirazione dell'animale e regolare la concentrazione di isoflurane se necessario.
7. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica con non-traumatico ear holder.
8. Proteggere gli occhi del mouse con un gel di lipidi.
9. Iniettare lidocaina 0,1 mL per via intradermica sotto la pelle di testa usando un 0,01-1 mL siringa e una cannula di iniezione 26G.
10. Rasatura e disinfettare la testa del mouse utilizzando la soluzione di etanolo. Poi si alternano tre volte 2% clorexidina con etanolo per disinfettare il sito chirurgico.
11. Eseguire un'incisione del midline usando forbici sottili e taglienti, andando da tra il retro delle orecchie al livello degli occhi, in modo che il bregma e lambda sono visibili.
12. Pulire il teschio applicando circa 50 µ l di NaCl usando una siringa e asciugare con un fazzoletto di carta e un soffio di aria.
13. Posizionare la testa del mouse regolando il livello di dorso-ventrale del morsetto naso affinché il bregma e lambda sono allo stesso livello del dorso-ventrale (± 0,3 mm).
14. Praticare un foro sopra il MS (AP 0,98 e L 0,5 mm in riferimento il bregma).
15. A questo punto, sbrinamento un'aliquota del virus (deve contenere almeno 2 µ l di AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) per circa 5 min a temperatura ambiente (TA).
16. Centrifugare l'aliquota a circa 4.000 x g a RT per 1 min.
17. Pipetta il 2 µ l del virus su un pezzo di Parafilm; usare il lato protetto in precedenza.
18. Immergere la punta dell'ago per iniezione nel liquido e prelevare con cautela a circa 500 nL/min osservando il livello del liquido. Per evitare l'aspirazione di aria, è necessario interrompere ritiro prima che il virus è completamente preso. Regolare la frequenza di prelievo secondo la viscosità della soluzione; un tasso più veloce può facilitare il prelievo di un virus con maggiore viscosità.
19. Pulire l'ago con un fazzoletto di carta.
20. Verificare che il virus è contenuto nel tubo e il virus e l'olio sono separati da una bolla d'aria. Contrassegnare il livello del virus sul tubo al fine di controllare se virus è infuso con successo durante l'iniezione.
21. Posizionare l'ago sopra il craniotomy e inserirla lentamente nel cervello al primo punto di iniezione (AP 0,98, L 0.5, V -5.2, laterale di 5,5 °).
22. Iniettare 450 nL del virus a un tasso di 100-150 nL/min attendere 10 min attentamente spostare l'ago fino a 0,1 mm e attendere un altro 5 min.
    1. Spostare l'ago per il secondo punto di iniezione (AP 0,98, L 0.5, V -4,6) e iniettare un altro 450 nL a 100-150 nL/min.
    2. Attendere ancora per 10 min prima di spostare l'ago fino a 0,1 mm. aspettare un altro 5 minuti prima di rimuovere l'ago.
23. Sutura l'incisione con sutura seta nero intrecciato con nodi quadrati. Caldo l'animale con una luce rossa per accelerare il recupero. Amministrare gli antibiotici (0,3 mL Erycinum (1:4 in soluzione sterile di NaCl)) e carprofen i.p. giornaliere 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
24. Tagliare il tubo sopra il segno che indicava il livello del virus. Il tubo può essere utilizzato per ulteriori iniezioni. Preparare un ago per iniezione fresco prima di ogni iniezione.
    Nota: Questo intervento chirurgico richiede circa 1-1.5 h. L'animale si sveglia in genere entro 5 min dopo la chirurgia. Attendere un minimo tempo di 6 settimane per sufficiente espressione axonal ma non più di 5 mesi prima di eseguire gli impianti stereotassica, come i livelli di espressione cominciano a diminuire di circa 6 mesi dopo l'iniezione di virus.

2. preparazione di fibre ottiche (Figura 1A)

1. Utilizzare la fibra ottica multimodale (105 µm core, vetro rivestito con nucleo di silice, NA 0.22). Rivestimento con nastri 125 µm di nucleo della fibra utilizzando una micro-spogliarellista, mentre la fibra è ancora attaccata alla bobina della fibra.
2. Tagliare la fibra ad una lunghezza di circa 2-3 cm con un coltello di diamante.
3. Inserire la fibra in un puntale di ceramica bastone di zirconia (ID: 126 µm). Circa 0,5-1 mm della fibra ottica deve sporgere dal lato convesso della ghiera.
4. Utilizzando un ago, applicare una goccia di colla a resina epossidica a entrambe le estremità della ghiera, ma non sui lati della ghiera. In alternativa, utilizzare colla super.
5. Consentire la colla si asciughi per almeno 30 min.
6. Polacco il lato convesso della ferrula utilizzando diamante lappatura fibra lucidatura pellicola (3 µm grane).
7. Testare la fedeltà di luce trasferimento utilizzando un misuratore di potenza ottica.
   1. Impostare la lunghezza d'onda il misuratore di potenza alla stessa lunghezza d'onda come il laser viene utilizzato.
   2. Posizionare il cavo di patch con la punta rivolta verso il centro del sensore. Accendere il laser e leggere la potenza luminosa dal misuratore di potenza. Registrare il valore.
   3. Collegare la fibra ottica per il cavo di patch tramite un manicotto di accoppiamento e posizionarlo con la punta della fibra rivolto verso il centro del sensore. Accendere il laser e leggere la potenza luminosa dal misuratore di potenza. Registrare il valore.
   4. Calcolare il tasso di trasmissione: dividere il secondo valore dal primo valore. Se la velocità di trasmissione è inferiore a 0,5, scartare la fibra, in caso contrario utilizzarlo per l'impianto.
   5. Testare la velocità di trasmissione per ogni fibra prima dell'impianto.
   6. Per esperimenti successivi, regola l'uscita di intensità della luce del laser per la velocità di trasmissione della fibra ottica: impostare l'uscita luce dalla punta cavo di zona a 5-15 diviso per il tasso di trasmissione per ottenere un output finale di luce dalla punta della fibra del 5-15 mW.
      Nota: Vedere anche Rif. ⁶¹ per la preparazione di fibre ottiche.

3. preparazione del filo di tungsteno matrici per LFP registrazioni (Figura 1B)

1. Diversi (per esempio 6) colla 100 µm guide di tubo di silice in parallelo con il lato di un pezzo di nastro adesivo. Tagliare un pezzo, circa 4-6 mm, per un filo di montaggio di matrice.
2. Filo formvar-isolamento di fili di tungsteno 45 µm attraverso i tubi di guida usando il forcipe.
3. Striscia sei isolati smalto rame raffinato incollaggio fili (circa 5 mm di lunghezza) e un filo di messa a terra (circa 2-3 cm di lunghezza) utilizzando un bisturi per raschiare via l'isolamento su entrambe le estremità. Saldarli ai pin nanoconnector.
4. Collegare ogni legame di filo di uno tungsteno utilizzando una goccia di vernice conduttiva argento, rispettivamente. Lasciare asciugare per almeno 30 min.
5. Applicare una minima quantità di cemento per coprire i fili. Non applicare il cemento sui fili di tungsteno, che verranno inseriti nel tessuto cerebrale o sulla parte superiore della nanoconnector. Lasciate che il cemento asciutto per almeno 30 min.
6. Eseguire un taglio angolare (5-20°) i fili di tungsteno usando smussato in acciaio inox forbici per attivare l'impianto affidabile di fili qui sotto o sopra la zona ventralmente adiacente il corneum pyramidale, cui l'ampiezza di teta è troppo bassa per la stima della fedeltà di trascinamento.
7. Deinsulate la punta (circa 2 mm) del cavo di terra utilizzando un bisturi per raschiare via l'isolamento. Trattare con flusso e presolder.
8. Potenziale di controllo cross-talk tra elettrodi utilizzando una fotocamera digitale multimetro. A tale scopo, collegare i pin del connettore per il multimetro, che deve essere impostato la modalità di misurazione di resistenza. Verifica pairwise combinazioni di canali; una lettura del multimetro sotto 5 MΩ indica significativa diafonia.
9. Verificare l'impedenza di ciascun elettrodo filo in Salina utilizzando un misuratore di impedenza. I valori di impedenza tipica sono sotto 100 kΩ.
10. Per facilitare l'impianto, colla una fibra ottica nella matrice di filo in modo che la punta della fibra è al livello del filo più breve e la punta della fibra è nelle immediate vicinanze, ma non toccare i fili di tungsteno. Mantenere l'angolo della fibra più piccolo possibile per evitare danni ai tessuti durante l'impianto.
    Nota: Vedere anche Rif. ⁶² per la fabbricazione di matrici di filo di tungsteno.

4. stereotassica Implantations

1. Eseguire preparazioni come descritto nei passaggi 1.6-1.13.
2. Rimuovere il tessuto connettivo dalla parte superiore del cranio e spingere verso il basso i muscoli del collo accuratamente di circa 2 mm per evitare artefatti muscolari durante la registrazione.
3. Pulire il cranio utilizzando un cotton-fioc e saline e 4 fori (2 nella parte anteriore) e 2 sopra il cervelletto, diametro 0,8 mm per posizionare le viti di acciaio inossidabile di osso (00-96 x 1/16) per terra e la stabilizzazione dell'impianto (Figura 1). Posizionare la vite di terra, collegata a un filo di rame (circa 2-3 cm di lunghezza) sopra il cervelletto.
4. Coprire la vite a terra completamente con il cemento per evitare artefatti muscolari durante le registrazioni elettrofisiologiche. Costruire un anello di cemento che collega tutte le viti (Figura 1E).
5. Eseguire una craniotomia sopra il lato impianto (ippocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 in riferimento il bregma). Applicare circa 5 µ l di soluzione sterile di NaCl sulla superficie del tessuto cerebrale.
6. Abbassare lentamente la matrice di filo utilizzando stereotaxis nel craniotomy. Per le registrazioni unitarie, impiantare una sonda in silicone invece un filo matrice⁶³; al fine di evitare artefatti luce optoelectric, impiantare la fibra ottica separatamente nell'ippocampo con la punta della fibra non direttamente di fronte la sonda (Figura 1 -io). Per indagine del coordinamento di trascinamento tra gli emisferi, impiantare una fibra ottica supplementare nella zona CA1 hippocampal controlaterale.
7. Applicare circa 5 µ l di olio di cera/paraffina liquida calda, preriscaldato a 70 ° C, con una siringa sopra il sito di impianto per proteggere il tessuto cerebrale.
8. Applicare il cemento intorno a matrice metallica e coprire il cranio con il cemento.
9. Applicare una goccia di flusso per il filo di terra/riferimento presoldered e il presoldered filo collegato alla vite di massa utilizzando per esempio un ago e si fondono i fili utilizzando una macchina di saldatura.
10. Coprire il filo di terra intera con cemento.
11. Amministrare 0,3 mL Erycinum (1:4 in soluzione sterile di NaCl) e i.p. carprofen (5mg/mL) dopo l'intervento chirurgico e per almeno i due giorni successivi. Il mouse si sveglia in genere entro 15 min dopo la chirurgia. Caldo l'animale con una luce rossa per accelerare il recupero.
12. Monitorare quotidianamente il peso del mouse per la prima settimana dopo l'intervento, o fino a quando il peso è stabile. Perdita di peso non deve superare il 10% del peso del mouse registrato prima della chirurgia. Per accelerare la stabilizzazione del peso, è necessario fornire il mouse con cibo umido e latte condensato durante i primi giorni dopo l'intervento.
13. Per registrare l'attività cellulare hippocampal durante il trascinamento, impiantare una sonda in silicone nell'ippocampo (AP-1.94, 1.4 L, V 1, con conseguente abbassamento) come descritto in rif. ⁶² (Figura 1 -io). Impiantare la fibra ottica nell'ippocampo presso AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudale rostrale. Impiantare una fibra ottica supplementare in MS (AP +0.98, 1 L, V 3.9, laterale di 15 °) se la stimolazione di somata cella è desiderata.

5. optogenetica stimolazione e acquisizione dati elettrofisiologici

1. Habituate il mouse per il setup di registrazione (ad esempio, sessioni di 15 min, 1-2 sessioni al giorno per 3 giorni). Esaminare il comportamento dell'animale prima di iniziare con i primi esperimenti. Se il mouse viene spostato nella camera, esplorare l'ambiente, sniffing, esecuzione di allevamenti, ecc., iniziare la prima sessione sperimentale.
2. Posizionare il mouse in una camera familiare in assenza di altri animali nella stessa stanza.
3. Collegare un LED a testa-stage utilizzando nastro adesivo per tracciare la posizione dell'animale. Assicurarsi che la luce del LED è catturata dalla fotocamera durante tutto il periodo che l'animale sta esplorando la camera di registrazione prima di iniziare gli esperimenti. Registrare nel buio al fine di monitorare la luce del LED. Posizionare una telecamera sopra la camera di registrazione.
4. Verifica la potenza luminosa dal cavo di patch. Stimare la potenza luminosa dalla punta della fibra dopo la connessione a seconda della velocità di trasmissione della fibra impiantato. Assicurarsi che la potenza luminosa dalla punta della fibra è tra 5-15 mW, per consentire il trascinamento affidabile.
5. Collegare il preamplificatore headstage al connettore cronicamente impiantato. Collegare il cavo a fibre ottiche di patch alla fibra hippocampal cronicamente impiantata per esperimenti di stimolazione optogenetica. In esperimenti di stimolazione luminosa di controllo, collegare la fibra ottica a un manichino puntale collegato all'auricolare.
6. Posizionare il mouse nella camera di registrazione.
7. Aprire il software per controllare il generatore di stimolo per generare il protocollo di stimolazione.
8. Selezionare il canale che controlla il laser DPSS 473 nm. Nella prima riga Inserisci 3.000 mV (1 ° colonna), tempo di 30 ms (2 ° colonna), valore 0 mV (3 ° colonna), tempo di 112 ms (colonna 4), riga 840 ripetere e ripetere 1, per generare un protocollo per 2 min di 7 Hz stimolazione con impulsi lunghi 30 ms di gruppo. Se è necessaria la stimolazione ad un'altra frequenza o una durata diversa, regolare la durata di tempo nella 4 ° colonna e numero di ripetizioni di fila. Nella seconda riga selezionare 0 mW (1 ° colonna), tempo h 500 (2 ° colonna), ripetizione di riga 1 e gruppo ripetizione 1, per garantire che il laser sia essere spento dopo il protocollo di stimolazione è terminato.
9. Fare clic su "File > Salva con nome" e salvare il file con un nome desiderato.
10. Assicurare che l'elettrostimolatore TTL output intervento laser è collegato alla scheda input analogica digitale Lynx per sincronizzare l'acquisizione di elettrofisiologici e optogenetica dati.
11. In alternativa, per parametricamente regolano la variabilità della frequenza di oscillazione di teta, applicare i treni di impulsi di luce a diversi intervalli Inter-impulso, con periodi seguendo una distribuzione gaussiana. Modificare la dispersione degli intervalli Inter-impulso per protocolli diversi, ad esempio, dal punto 3.2 a 15,1 ms². Applicare questi protocolli per generare epoche theta con diversa variabilità della frequenza theta (Figura 6).
12. Aprire il software di sistema di registrazione. Fare clic su "ACQ" per acquisire e "REC" per registrare. Attendere prima di iniziare la stimolazione luminosa per registrare il comportamento della linea di base (ad es., 2 min per recuperare velocità basale o 30 min per estrarre i campi del posto della linea di base).
13. Aprire il software per controllare il generatore di stimolo. Fare clic su "File > Open" e selezionare il file di protocollo di scelta. Fare clic su "Scarica e Start" per avviare la stimolazione luminosa.
    Nota: L'esperimento può essere oggetto di indagine, e la stimolazione avviato tramite telecomando; Questo esclude l'influenza della presenza dello sperimentatore sul comportamento dell'animale. A seconda l'obiettivo dello studio, stimolazione può essere iniziata e terminata durante comportamenti specifici.

6. un approccio combinato per trascinamento optogenetica e inibizione di proiezione specifica dell'Output Hippocampal

1. Rapidi, ChR2 in MS GABAergici cellule di PV-Cre topi, come descritto nella sezione 1.
2. Inoltre, iniettare un totale di 2,4 µ l di CamKIIα dipendente halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) in entrambi gli emisferi hippocampal dorsali (AP -1,7; L ± 1.05; V-2.05 e - 1.4 mm; AP -1,7; L ± 1.7; V-2.05 e - 1,55 mm; AP -2,3; L ± 1,5; V -2.2 e - 1.3 mm; AP -2,3; L ± 2.2; V-1.65 e - 2.45 mm).
3. Consentire 6 settimane di tempo di espressione.
4. Impiantare una matrice di filo di tungsteno con fibra ottica nella regione CA1 hippocampal, come descritto nella sezione 4. Inoltre, impianto a fibre ottiche bilateralmente nel setto laterale (LS, AP 0.1, 0.25 L, V-2,250 mm e AP 0.5, L -0,3, V-2,70 mm).
5. Esperimenti di optogenetica Teta trascinamento come descritto nei passaggi 5.4-5.5.
   1. Per simultanea inibizione dell'uscita hippocampal di LS, generare una generazione di stimolo di protocollo: per esempio, trigger l'insorgenza d'uscita del canale collegato al 593 nm DPSS laser 15 s con un impulso continuo che dura in totale 45 s, prima di far scattare l'uscita di impulsi per il laser DPSS 473 nm.
   2. Collegare entrambe le fibre in LS tramite patch cord mediante un accoppiatore ottico di fibra multimodale ad un laser DPSS 593 nm.
   3. Avviare la registrazione e scaricare e attivare il protocollo per controllare la generazione di stimolo.

7. trattamento dei dati

1. Convertire i segnali elettrofisiologici e posizionare i dati di rilevamento con dati neurofisiologici (ND) Manager formati. dat e .pos, rispettivamente⁶⁴.
2. Ottenere la LFP di filtro passa-basso e down-sampling del segnale a larga banda a 1.250 Hz usando ND Manager⁶⁶.
3. In ogni registrazione, selezionare il canale con la massima ampiezza di teta oscillazioni (utilizzando Neuroscope)¹⁹.
4. Rilevare i timestamp degli impulsi laser e delle epoche stimolazione con una soglia di rilevazione algoritmo (utilizzando MATLAB funzione findpeaks.m o simili)¹¹.
5. Per importare il file. dat in un software di analisi di dati multi-canale, fare clic su "File > Importa" e selezionare "file binari" come tipo di dati selezionare il file dat. Nella finestra di dialogo configurazione, immettere il numero corretto di canali e una frequenza di campionamento di 1.250 Hz, fare clic su "ok" e salvare come file .smr. Tracciare gli spettri di potenza selezionando "Analisi > nuovo risultato vista > PowerSpectrum". In impostazioni, selezionare il canale con l'ampiezza più alta di teta e 16.384 dimensione FFT, fare clic su "Nuovo", definire come "Ora inizio" all'inizio dell'epoca stimolazione e come "End time" alla fine dell'epoca di stimolazione e fare clic su "Processo".
6. Calcolare la fedeltà di trascinamento come il rapporto tra la densità spettrale di potenza cumulativa (PSD) all'interno della gamma di frequenza di stimolazione optogenetica (stimolazione frequenza ± 0,5 Hz), per il PSD cumulativo nella banda theta (5-12 Hz) con il metodo multitaper (NW = 3, dimensione della finestra 8.192) per 10 epoche di s (ad es., toolkit < http://chronux.org/>).
7. Escludere le epoche di registrazione dove il picco PSD dominante è ≤ 5 Hz da analisi (non-theta epoche, utilizzando MATLAB funzione find.m).
8. Tracciare il raster degli spettri di potenza LFP per tutte le epoche registrate secondo la fedeltà di trascinamento computata (utilizzando pcolor.m e sortrows.m funzioni MATLAB). Caricare gli spettri di potenza e trascinamenti fedeltà facendo clic su "File > Open", memorizzati potenza variabile di tipo pollici = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Targeting di ChR2 alle cellule di GABAergic in MS come descritto nella sezione 1 è illustrato nella Figura 2A. Optogenetica stimolazione degli assoni delle cellule MS GABAergici nell'ippocampo dorsale tramite una fibra ottica che viene impiantata sopra l'area CA1 entrains oscillazioni di teta alla frequenza dello stimolo a ipsilateral (Figura 2B) così come controlaterale emisfero (Figura 2). Oscillazioni di teta potrebbero essere più o meno efficiente trascinate tramite la stimolazione di optogenetica (Figura 3A), la cui efficacia è stata calcolata ad ogni epoca di registrazione come una theta relativa potere LFP intorno alla frequenza di stimolazione, cioè, fedeltà di trascinamento (Figura 3B). Fedeltà di trascinamento sopra 0.3, cioè, superiore nelle registrazioni di luce-off spontanee, è stata osservata in circa l'80% delle epoche registrazione. Optostimulation alle frequenze theta non era meno efficace (Figura 3).

Esplicito cioè, manipolazione parametrica delle oscillazioni di theta frequenza è accompagnato dai cambiamenti emergenti di regolarità di teta: la regolarità temporale di ampiezza e frequenza delle oscillazioni theta è stati aumentati durante le epoche con alta fedeltà di trascinamento. La stabilità delle oscillazioni può essere regolata anche in modo parametrico applicando i treni di impulsi di luce, periodi di cui seguono distribuzioni gaussiane con diverse dispersioni (Figura 4).

Optogenetica controllo sopra la frequenza di oscillazioni eliminato la correlazione tra la frequenza di teta e velocità di esecuzione, in accordo con il controllo della frequenza tramite la MS da ascendente afferenze durante il movimento (Figura 5A). Optostimulation inoltre ha indotto le oscillazioni Teta durante immobilità (figura 5B). Le fasi di cottura preferenziale registrato nella zona nel presunte cellule piramidali CA1 e interneuroni erano invariate rispetto l'oscillazione di teta optogenetically trascinato rispetto a theta spontanea (Figura 6).

Per studiare il contributo dell'ippocampo alla via setto laterale a regolazione theta-mediata di locomozione, abbiamo optogenetically ha inibito questa via. Halorhodopsin (eNpHR3.0) bilateralmente è stato espresso in cellule piramidali hippocampal (figura 7A), mentre ChR2 è stato espresso in cellule di GABAergic MS come sopra e oscillazioni di teta erano optogenetically trascinato (figura 7B). Il trascinamento di teta ridotta variabilità di velocità ma non quando è stata inibita l'ippocampo alla via LS (Figura 7).

Figura 1: illustrazione di cavi a fibre ottiche, elettrodi e chirurgia. (A) illustrazione di una fibra ottica. (B) illustrazione di una matrice di filo incollata a una fibra ottica per la registrazione di hippocampal LFP durante il trascinamento delle oscillazioni di teta hippocampal. (C) per la registrazione dell'attività cellulare hippocampal, una sonda in silicone è montata su un microdrive. (D) viti in miniatura sono posizionate sul cranio. Fili di rame sono presoldered alla vite di terra e di riferimento prima di posizionarle sopra il cervelletto. Cemento (E) viene applicato per coprire e collegare le viti. Il cerchio blu superiore indica dove il craniotomy è stato effettuato per l'impianto della sonda in silicone. Cerchio blu inferiore indica dove il craniotomy è stato effettuato per l'impianto della fibra ottica nell'ippocampo. Fibra ottica (F), One viene impiantata in un angolo caudale rostrale per indirizzare la regione CA1 hippocampal. Una seconda fibra può essere impiantato nel setto mediale se stimolazione dei somata cella è desiderata (opzionale). Sonda (G), il silicone viene abbassato a appena sopra la zona CA1 hippocampal. (H) i bordi del microdrive e connettore sono cementati per l'impianto e la terra, e i fili di riferimento sono saldati. (io) rame rete è realizzata per circondare l'impianto e servono come una gabbia di Faraday. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: preparazione per trascinamento Teta hippocampal optogenetica. (A) ChR2 è stato espresso in cellule settale mediale di PV+ in PV-Cre topi (schema superiore). Fluorescenza brillante in MS (1, 2) conferma il successo costrutto espressione nel somata. Fibre di MS proiettano via fornice (f) e fimbria (fi) dell'ippocampo (3-6); ACA: Commissura anteriore; parte anteriore. HDB: nucleo dell'arto orizzontale della banda diagonale; O: strato oriens. La fibra ottica per optogenetica stimolazione con luce blu è impiantata sopra lo strato piramidale della zona hippocampal CA1 (regime inferiore). Scala bar: 500 µm (immagini 1, 3, 4) e 50 µm (immagini 2, 5, 6). (B) Hippocampal LFP durante le oscillazioni spontanee TETA (a sinistra) e 7 Hz (medio) o 10 Hz (a destra) optogenetica trascinamenti. Strisce blu indicano le finestre temporali di applicazione della luce. Nota la fase per reimpostare l'impulso di luce indicata da una freccia. Nota gamma buste durante spontanea e trascinata theta, un indicatore di ritmo theta fisiologico. Fase di inversione tra strato oriens (Str. o.) e strato radiato (Str. Rad.) viene mantenuto anche durante il trascinamento. (C) trascinamento è affidabile durante ipsilateral (trame superiore), come pure controlaterale (appezzamenti inferiori) optogenetica stimolazione. Schemi illustrano posizioni di fibre rispetto a posizioni di elettrodi. Tracce LFP esempio durante theta e l'applicazione di impulsi di luce sono mostrate nel mezzo. Sulla destra, spettri di potenza di hippocampal LFP durante ipsi - e controlaterale stimolazione codificati per colore in base alla frequenza di stimolazione. Questa figura è stata modificata da Ref. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: fedeltà di trascinamento Teta hippocampal optogenetica. (A) esempio hippocampal LFP tracce durante la fedeltà di trascinamento di bassa e alta. (B) densità spettrale delle epoche di s 10 di potenza durante Teta spontanea, con righe ordinate secondo frequenza theta (a sinistra) e 7 Hz (al centro) e 10 Hz (a destra) optogenetica stimolazione, con righe ordinate secondo la fedeltà di trascinamento. Spettri di potenza rispettivi esempio (indicati da una freccia) vengono tracciati sopra. Nota fedeltà di trascinamento affidabile attraverso epoche. Sulla destra, è indicata la probabilità cumulativa di fedeltà di trascinamento per le frequenze theta. (C) Entrainment richiede stimolazione ritmica Teta. Attività di rete hippocampal può essere trascinato con successo utilizzando frequenze tra 6-12 Hz. Alle frequenze più basse (ad es., 2 o 4 Hz) o più frequenze (ad esempio, 20 Hz) trascinamento non è affidabile. Questa figura è stata modificata da Ref. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: manipolazione parametrica di regolarità oscillazioni Teta. (A) la stimolazione è stata applicata alle frequenze variabili all'interno della gamma di teta con una frequenza media di 7.8 Hz seguendo una distribuzione gaussiana. La deviazione standard degli intervalli Inter-impulso è stata aumentata attraverso protocolli da σ = 3.19 a σ = 15.09. In totale, 11 protocolli sono stati generati e applicati, ciascuno con una durata complessiva di epoca di stimolazione di 1 min. Di quelli, la distribuzione di probabilità di 5 protocolli vengono visualizzati sulla sinistra della figura. Le densità spettrale di potenza entro un intervallo di 1-14 Hz la LFP hippocampal durante l'applicazione dei rispettivi protocolli vengono tracciate al centro della figura. Sulla destra sono illustrate le probabilità dei periodi Teta durante l'applicazione dei rispettivi protocolli. (B), la varianza delle arti interpulso intervalli determinati la varianza del periodo simultanee TETA (r di Pearson = 0,94, p = 0,0002). (C) il rapporto tra la variabilità di ampiezza theta e Inter-l'impulso di intervallo (r di Pearson = 0,61, p = 0,08). Questa figura è stata modificata da Ref. 70. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: trascinamento ritmico di teta optogenetica determina LFP hippocampal durante comportamento. (A) frequenza di stimolazione optogenetica determinata la frequenza theta durante la locomozione. Quindi, velocità relative afferenze non impatto frequenza di teta hippocampal, e di conseguenza, velocità non è correlata con frequenza theta (blu) come è durante spontanea TETA (nero). I dati sono presentati come media ± s.e.m. (B) durante lo stato di veglia tranquilla, il teta hippocampal può essere suscitata in assenza di movimento. Tracce LFP hippocampal prima e durante il trascinamento di successo sono riportate sopra, e tracce di velocità esempio registrate durante il trascinamento sono riportate di seguito (la traccia rossa corrisponde alla traccia LFP hippocampal raffigurato sopra). Strisce blu contrassegno le finestre temporali di impulsi di stimolazione luminosa. Questa figura è stata modificata da Ref. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Hippocampal attività cellulare durante il trascinamento di teta. (A) l'attività cellulare è stata registrata utilizzando sonde in silicone (schema). Singole interneuroni e cellule piramidali sono sono isolate e identificate secondo le loro rispettiva forme d'onda. Qui è illustrata la forma d'onda media (al centro) e auto-Correlogramma di una cellula piramidale isolato di esempio. (B) fase di scarico Preferred delle cellule piramidali (Pyr) non era differente durante spontanea (in nero, n = 29 neuroni) e optogenetically trascinato (in blu, n = 30) theta (p = 0,79). (C) mostrato qui è l'auto-Correlogramma (a sinistra) e la fase di cottura preferenziale di un interneurone di veloce-infornamento durante spontanea e optogenetically trascinato Teta. Sotto il ritmo LFP hippocampal corrispondente durante spontanea (sinistra) e trascinata theta (a destra). (D) non era differente durante fase di scarico Preferred di veloce-infornamento interneuroni spontanea (in nero) e optogenetically trascinato (in blu, n = 28 neuroni) theta (p = 0,97). Auto-Correlogramma medio è mostrato a sinistra. (E) medio auto-Correlogramma Str. oriens celle. (F) fase di scarico Preferred di interneuroni oriens Str. non era differente durante spontanea (nero) e optogenetically trascinato (blu, n = 10 neuroni) theta (p = 0,56). Gli istogrammi di comodo scarico fasi vengono visualizzati sulla destra. Tassi di infornamento medio (G) non sono stati colpiti da trascinamenti di teta in cellule piramidali (p = 0.98), interneuroni di veloce-infornamento (p = 0,96) o interneuroni oriens Str. (p = 0.85). Questa figura è stata modificata da Ref. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: combinazione di teta hippocampal trascinamenti e optogenetica inibizione della hippocampal subcortical uscita attraverso il LS. (A) eNpHR3.0 (halorhodopsin) è stato espresso in cellule piramidali hippocampal (schema superiore). Espressione di successo del costrutto è stata confermata da fluorescenza brillante nel somata nell'ippocampo (immagini superiore) e assoni in LS (immagini inferiore). Cavi a fibre ottiche sono stati impiantati bilateralmente sopra il LS (regime inferiore). Scala bar: 500 µm (immagini a sinistra), 50 µm (immagini a destra). (B) TETA Hippocampal è trascinato con successo durante l'inibizione dell'ippocampo alla via di LS. Vengono qui riportate le densità spettrale di potenza per 9 Hz blu stimolazione luminosa durante l'inibizione di uscita. (C) l'inibizione del pathway principali hippocampal subcortical uscita impedisce gli effetti di trascinamento di teta hippocampal sulla velocità. Qui mostrato è diminuzione della variabilità di velocità su optogenetica entrainment (barra bianca con bordi blu), con è assente all'inibizione simultanea dell'ippocampo alla via LS (barra gialla con bordi blu). Velocità basale medio rispettivo è mostrato sulla sinistra. Questa figura è stata modificata da Ref. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.