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Articolo metodologico

Valutazione della coagulazione del Plasma il tessuto del fegato in un modello animale di grandi dimensioni In Vivo

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DOI:

10.3791/57355

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4 agosto 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Bonn, 2Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 3Department of Anesthesiology, RWTH Aachen University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare sperimentalmente la coagulazione del plasma nel tessuto del fegato in vivo. In un modello porcino, microcircolazione viene esaminato dal laser Doppler, profondità di coagulazione è misurato istologicamente, temperatura al sito di coagulazione di effetto di tenuta del tubo e macchina fotografica termografica e termometro a infrarossi è documentata dalla pressione di scoppio esperimenti.

Abstract

Coagulazione del plasma come una forma di elettrocauterio è usata nella chirurgia epatica per decenni per sigillare la grande superficie di taglio del fegato dopo hepatectomy principale per prevenire le emorragie in una fase successiva. Gli effetti esatti di coagulazione del plasma il tessuto del fegato solo male sono esaminati. Nel nostro modello porcino, gli effetti di coagulazione possono essere esaminati vicino all'applicazione clinica. Una microcircolazione combinato laser Doppler flussimetro e spettrofotometro documenti cambia durante la coagulazione a 8 mm di profondità del tessuto non invadente, che fornisce informazioni quantificabili di emostasi oltre l'impressione clinica soggettiva. La temperatura nel sito di coagulazione è valutata con una coagulazione di Priore e post del termometro a infrarossi e con una macchina fotografica termografica durante la coagulazione, una misura della temperatura del fascio di gas non è possibile dovuto la soglia superiore dei dispositivi. La profondità della coagulazione è misurata microscopicamente il ematossilina/eosina sezioni macchiata dopo la calibrazione con un micrometro oggetto e dà un informazioni esatte sulla potenza impostazione-coagulazione profondità-relazione. L'effetto di tenuta viene esaminato il dotti biliari, come non è possibile per un Coagulatore del plasma sigillare i vasi sanguigni più grandi. Esperimenti di pressione scoppio fuori relativi effetti sugli organi espiantati per eliminare la pressione sanguigna.

Introduzione

La coagulazione del plasma dell'argon (APC) è uno strumento ampiamente usato nella chirurgia addominale per più di tre decenni1,2. È una tecnica standard per il raggiungimento del hemostasis secondario dopo hepatectomy principale sigillando il fegato tagliato superficie per impedire successive emorragie3. La coagulazione del plasma è una forma specializzata di radiofrequenza elettrocauterio, che trasporta l'energia elettrica attraverso un arco di gas ionizzato. Emostasi elettrotermico monopolare, questa tecnica senza contatto ha il vantaggio di evitare l'elettrodo ad attaccarsi al tessuto4. Il fascio di gas ionizzato viene automaticamente indirizzato alla zona della più bassa resistenza elettrica e si è allontanato quando aumenti di resistenza dovuto essiccamento ad altre aree non ancora essiccate. Questo produce una limitata profondità uniforme di coagulazione5,6. Fattori che influenzano l'effetto di coagulazione sono l'attivazione del tempo, l'impostazione di potenza del dispositivo della coagulazione e la distanza tra la sonda e il tessuto. L'elio è un altro gas di trasporto, che può essere utilizzato per plasma coagulazione7. Studi clinici di recente concentrati solo sugli esiti clinici piuttosto che8,3,risultati istologici e funzionali9, mentre studi sperimentali incentrato sulle indagini in vitro 10 o esperimenti su organi irrorato isolato11.

Il protocollo sottostante permette lo studio degli effetti di coagulazione del plasma in un modello animale grande vicino all'applicazione clinica utilizzando attrezzatura standard umano sui suini: microcircolazione viene valutata non invadente di un flussometro Doppler laser e spettrofotometro, che è uno strumento clinico standard per questa indicazione12,13. Cambiamenti di temperatura durante la coagulazione sono controllati con un termometro a infrarossi e una macchina fotografica termografica. La profondità di coagulazione è misurata su istologico ematossilina/eosina sezioni macchiata dopo la raccolta dei campioni di tessuto. Per il confronto con altri mezzi per il hemostasis secondario, vengono eseguiti esperimenti di pressione di scoppio. In contrasto con tecniche precedentemente descritte14, questi sono condotti sugli organi espiantati per escludere la pressione sanguigna effetti correlati. Oltre alle indagini descritte sugli effetti locali di coagulazione del plasma, le analisi del sangue standard può essere intrapreso anche nel modello porcino.

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Protocollo

Sono state seguite regole disciplinate dalla legislazione tedesca per gli studi sugli animali, nonché i principi di laboratorio Animal Care (National Institutes of Health pubblicazione ed. 8, 2011). Ufficiale è permesso dall'ufficio governativo cura degli animali (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germania).

1. gli animali

  1. Utilizzare suini landrace tedesco femminile (25-30 kg di peso) alloggiati in gabbie aperte.
  2. Utilizzare 5 animali per gruppo (argon ed elio).
  3. Consentire agli animali di acclimatarsi all'ambiente circostante per almeno una settimana prima degli esperimenti. Animali veloci per 24 h prima dell'intervento chirurgico con libero accesso all'acqua.

2. anestesia

  1. Wow gli animali con un'iniezione intramuscolare di ketamina (15 mg/kg di peso corporeo [BW]), xilazina (10 mg/kg BW) e atropina (0,1 mg/kg BW) 10 min prima dell'induzione dell'anestesia.
  2. Accesso venoso periferico è stabilito dal posizionamento di una cannula di calibro 22 in una vena di orecchio.
  3. Indurre l'anestesia generale da i.v. iniezione di propofol 2 mg/kg di peso corporeo.
  4. Posizionare l'animale in posizione supina ed effettuare un'incisione longitudinale della pelle nella scanalatura giugulare sopra una lunghezza di 2 cm. Locate vena attraverso la preparazione smussata del tessuto sottocutaneo. Inserire la cannula, poi filo di Seldinger.
  5. Ritrarre la cannula e inserire 14 p. catetere sul filo guida. Ritirare il filo guida. Collegare il catetere per l'estensione e fissare il catetere di una cinghia o una sutura.
  6. Tirare fuori la linguetta e inserire laringoscopio diritta. Usare la punta del laringoscopio per tirare giù l'epiglottide. Inserire il tubo attraverso le corde vocali. Posizionare il bracciale sotto la glottide e gonfiare.
  7. Ventilare con 40% di ossigeno a 20-26 respiri/min e un volume corrente di 10 ml/kg per mantenere la tensione di biossido di carbonio parziale fine-di marea tra 36 e 42 mm Hg.
  8. Mantenere l'anestesia con isoflurano ad una concentrazione di 1-1,5% e fentanil ad una concentrazione di 3-4 µ g/kg/h.
  9. Fornire la soluzione di Ringer lattato a una velocità iniziale di 4 mL/kg/h e aumentare dopo la laparotomia per una velocità di infusione costante di 8 mL/kg/h.

3. chirurgia e coagulazione del Plasma

  1. Metti l'animale in posizione supina su un tavolo chirurgico standard.
  2. Disinfettare la pelle applicando un disinfettante chirurgico standard (2-propanolo 45 g/100 g, 1-Propanol 10 g / 100g, bifenil-2-olo 0,2 g/100 g) con un tampone chirurgico per ben 3 volte.
  3. Eseguire una laparotomia mediana ampia dal processo xifoideo al pube con un bisturi e installare Divaricatori chirurgici.
  4. Accendere il dispositivo di coagulazione del plasma, aprire la bottiglia di gas argon o elio, a seconda del gas usato motrice. Regolare il flusso del gas a 3 L/min potenza di uscita dispositivo selezionare coagulazione come desiderato.
    Nota: Entrambi i gas nobili, Argon o elio, può essere utilizzati per la coagulazione del plasma. Effetti di coagulazione sono paragonabili. Vedere riferimento7 per i dettagli.
  5. Eseguire la coagulazione del plasma sul lobo sinistro del fegato come descritto in precedenza7. Utilizzare uno stampo di titanio (apertura quadrata 1 x 1 cm2) per standardizzare la zona di coagulazione. Coagulare per 5 s con una distanza della sonda di 1 cm. La pinza di coagulo con impostazioni di risparmio energia diverso può essere eseguita fianco a fianco con una distanza breve tra la pinza di coagulo di 5 mm (Figura 1).
  6. Per la raccolta del fegato, dividere tutti i collegamenti ligamentous al fegato. Isolare e dividere il pedicle epatico sopra la flessura duodenale superiore lasciando porzioni lunghe della vena portale e del dotto biliare comune. Dividere la vena cava sopra e sotto il fegato e recuperare l'organo.
  7. Dopo la raccolta il fegato, i maiali sono stati eutanasizzati dalla somministrazione i.v. di 0,16 g/kg BW pentobarbital.
  8. Per gli esperimenti di pressione di scoppio, resecare metà del lobo sinistro del fegato mediale con forbici affilate. Il taglio al plasma-coagulare (potenza di uscita 100W) di superficie o sigillare la superficie di taglio con fibrina (Figura 2).

4. microcircolazione misura

Nota: Spettroscopia Doppler Laser può determinare il flusso di sangue nel tessuto attraverso misurando lo spostamento Doppler causato dal movimento degli eritrociti. Il segnale Laser correla con il numero di eritrociti commoventi. Spettroscopia Doppler laser è in uso clinico (ad es. medicina dei trapianti) ed è stato convalidato più volte15.

  1. Accendere il laser Doppler flussimetro e spettrofotometro. Utilizzare una sonda piatta.
  2. Prendere le misure della linea di base per il flusso e velocità. Salvare o prendere nota dei valori.
  3. Eseguire la coagulazione come descritta al punto 3.5.
  4. Posizionare la sonda piatta su siti di coagulazione e misura di flusso e velocità. Ancora una volta, salvare o Nota valori.
  5. Ripetere per tutte le impostazioni di alimentazione del dispositivo coagulatore.

5. misurazione della temperatura

  1. Il passaggio del sistema (macchina fotografica termografica, notebook e termometro a infrarossi) e lasciar correre per almeno 1 h prima di eseguire le misurazioni.
  2. Regolare messa a fuoco e visualizzare frame su macchina fotografica termografica sul sito della coagulazione. Sequenze a infrarossi possono essere rilevati con la risoluzione spaziale di 1024 x 768 pixel con una risoluzione di temperatura più grande di 20 mK. Prendere in considerazione, che la regione di coagulazione e il tessuto circostante — interessate dal trasferimento di calore — si trova nel centro della vista.
    Nota: Dovrebbe includere come numero di pixel del fotogramma possibile per un'ottimale risoluzione spaziale.
  3. Registrare il processo di coagulazione con il coagulatore del plasma sulla superficie del fegato con la macchina fotografica termografica su un periodo di 2 min.
  4. Analizzare le sequenze di immagini con il software di analisi di termografia: definire le aree di interesse.
    Nota: Il Software calcola il corso della corrispondente temperatura media nel corso del tempo.

6. misurazione della profondità coagulazione

  1. Raccogliere il lobo di sinistra del fegato mediale con forbici affilate.
  2. Asportare i siti di coagulazione con 1 cm di spessore. Tagliato in segmenti longitudinali spesse 3 mm per l'ulteriore elaborazione.
  3. Campioni di tessuto di correzione a 4 ° C durante la notte con neutro 10% tamponata formalina. Calore 2 ° C sopra il punto di fusione della paraffina e incorporare fette. Processo durante la notte.
  4. Eseguire ematossilina/eosina.
    1. Deparaffinizzare e idratare il tessuto immergendo successivamente in 2 x xilene, 100% di etanolo (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, deionizzata di H2O per 2 minuti ciascuno.
    2. Macchia il campione di tessuto con soluzione di ematossilina di Meyer per 3 min.
    3. Ora sciacquare in acqua corrente per 5 min.
    4. Macchiare il tessuto con soluzione di eosina per 3 min.
    5. Sciacquare in 2 x EtOH 95% e quindi in xilene per 3 minuti ciascuno. Montare con il mezzo di montaggio standard.
  5. Accendere il sistema (microscopio fotocamera collegata, software di imaging). Mostra tutte le sezioni con ingrandimento 40x.
  6. Acquisire l'immagine di un micrometro oggetto ad un ingrandimento di 40x. Ricalibrare il tasto nella finestra di obiettivi. Selezionare Calibrazione manuale. Tracciare una linea sull'immagine micrometro di 100 µm. invio 0,1 mm di nella finestra di dialogo e premere OK.
  7. Seleziona lunghezza nella visualizzazione > analisi controlli > finestra annotazioni e misure. Misurare dalla superficie del fegato per il margine di coagulazione con il mouse. Esportare o annotarsi il risultato. Ripetere la misurazione su un'altra posizione nella stessa diapositiva.
    Nota: La profondità di coagulazione possono essere differenziati facilmente dal tessuto normale del fegato dal margine tagliente tra le corde dell'epatocita normale e la zona di necrosi con rattrappito citoplasma, nuclei picnotici e zone di emorragia.
  8. Calcolare la media di due misurazioni.

7. misurazione della pressione burst

  1. Accendere il sistema (pompe automatiche, misuratore di pressione). Preparare i campioni del fegato secondo il punto 3.7.
    Nota: Utilizzare due pompe funzionanti in parallelo collegati tramite un rubinetto a 3 vie. La pressione massima di 1.500 mm Hg non può essere ottenuta con una sola pompa.
  2. Isolare la vena, arteria epatica comune e del dotto biliare con le forbici nel pedicle aptica. Morsetto della vena portale con un forcipe overholt e legare con una sutura monofilo 4-0. Bloccare l'arteria epatica comune un forcipe overholt e legare con una sutura monofilo 4-0.
  3. Inserire il catetere Ch-16 nel dotto biliare comune e legare con una sutura seta 2-0. Collegare il catetere alla pompe automatiche, installare il rubinetto a 3 vie con misuratore di pressione (Figura 3).
  4. Riempire la siringa di perfusione con soluzione fisiologica.
  5. Avviare pompe automatiche con un tasso di consegna di 99 mL/h.
  6. Monitoraggio del fegato taglio superficie e pressione tester per perdite e record di pressione di scoppio.
    Nota: Per un più facile riconoscimento delle perdite, brevetto blu possono essere aggiunti alla soluzione fisiologica (2 mL brevetto blu + 18 mL di soluzione fisiologica). È più facile osservare la pressione di scoppio da notare il periodo di perdita di pressione sul manometro.

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Risultati

Microcircolazione: Utilizzando il dispositivo diagnostico per l'emostasi dopo coagulazione del plasma può essere dimostrata dai cambiamenti di microcircolazione. Sangue capillare flusso (visualizzato come unità arbitrarie (AU)) diminuisce da un valore basale di 142,7 ± 76,08 AU a ± 57.78 49.57 AU 25 W dispositivo potenza di uscita a 48,5 ± 7,26 AU a 50 W e a 5,04 ± 1.31 AU a 100 W (Figura 4).

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Discussione

Modelli del roditore per chirurgia epatica sono stabiliti per un lungo periodo di tempo16. Tuttavia, modelli animali di grandi dimensioni offrono alcuni vantaggi: nessuna apparecchiatura microsurgical è necessaria come equipaggiamento standard operativo per gli esseri umani possa essere applicato, tecniche chirurgiche sono paragonabili per uso clinico e metodi di valutazione clinica standard possono essere trasferito agli esperimenti. Ad esempio, test clinici standard del sangue può avvenire senza...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Xilazina 20 mg/mLVetoquinol GmbHXylapan
Ketamina 100 mg/mLCeva GmbHCeva Ketamina Iniezione
Atropina 100 mg / 10 mLDr. Franz Kö hler Chemie GmbHAtropinsulfat Kö hler 100mg Amp.
PropofolFresenius Kabi GmbHPropofol 1% MCT Fresenius
FentanylKG Rotexmedica GmbHFentanyl 0,5mg Rotexmedica
IsofluraneAbbot GmbHForene 100% (V/V) 250 mL
Soluzione di lattato di RingerBaxter Deutschland GmbHSodio 131mmol/l, potassio 5 mmol/l, calcio 2 mmol/l, cloruro 111 mmol/l, lattato 29 mmol/l
Fattorizzante chirurgicoSchü lke & Mayr GmbHKodan Tinktur forte gefä rbt 1l 104804
Microscopio motorizzatoNikon Instruments EuropeEclipse TE2000-E
Fotocamera per microscopioNikon Instruments EuropeDigitalsight DS-Qi1Mc
Software di imagingNikon Instruments EuropeNIS elements Vers. 4.40
Coagulatore al plasmaSö ring GmbHCPC-1000
Gas argonLinde AGArgon 4.8 
Gas elioLinde AGHelium 4.8
O2CLEA Medizintechnik GmbHO2C Versione 1212con sonda LF-2 o LF-3
Termometro a infrarossiVoltcraftVOLTCRAFT IR 260-8S
Telecamera termograficaInfraTec GmbHTesta VarioCAM HD 820
Software di analisi termograficaInfraTec GmbHIRBIS 3
Soluzione di ematossilinaMerck 1.09249
Soluzione di eosinaVWR International GmbHMerck 1.09844
Pompa a rulli Masterflex L/S easy LoadCole-Parmer Instrument Companymodello 7518-10
Pompa di perfusificazioneB. Braun Melsungen AGPerfusor secura FT
Misuratore di pressione digitaleGreisinger elettronicoGMH 3161
Perfusorsyringe, 50 mLB. Braun Melsungen AGREF 8728810 F
Linea Perfusor, Tipo IV Standard, PVC Luer lockB. Braun Melsungen AGREF 8722960
Rubinetto a 3 vie, Dicofix C35CB. Braun Melsungen AGREF 16494 C
Silk 2-0. 3 metricoResorbaREF H5F
Vicryl 4-0 SutupakEthiconV1224H
NaCl 0,9 %B. Braun Melsungen AG
di Mayer

Riferimenti

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