Articolo metodologico

Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura

DOI:

10.3791/57358

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27 marzo 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Tessutale renale costrutti forniscono una soluzione per la carenza di organi e deleteri effetti della dialisi. Qui, descriviamo un protocollo a micro sezionare murini reni per isolamento di segmenti cortico-midollare. Questi segmenti sono impiantati nei costrutti senza impalcatura cellulare, formando organoids renale.

Abstract

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Trapianto di rene è ora una terapia tradizionale per la malattia renale di stadio finale. Tuttavia, con circa 96.000 persone sulla lista d'attesa e solo un quarto di questi pazienti che hanno raggiunto il trapianto, c'è un disperato bisogno di alternative per quelli con mancanza di organi. Al fine di ridurre le conseguenze dannose di dialisi nonché i costi nel complesso sanitari che sostiene, indagine attiva è in corso in cerca di soluzioni alternative al trapianto d'organo. Impiantabili tessutale renale costrutti cellulari sono un tale approccio fattibile per sostituire la perdita di funzionalità renale. Qui, descritto per la prima volta, è il microdissection dei reni murini per l'isolamento di vivere corticomedullary renale segmenti. Questi segmenti sono capaci di rapida incorporazione all'interno senza impalcatura endoteliale-fibroblasto costrutti che consentono rapidi collegamenti con vasculature host una volta impiantato. Reni di topo adulto sono stati prelevati da donatori viventi, seguiti da stereoscopio microdissection ottenere segmenti renale 200-300 µm di diametro. Più costrutti renale furono fabbricati usando segmenti renale primarie raccolte da un solo rene. Questo metodo viene illustrata una procedura che potrebbe salvare il tessuto funzionale renale da organi che altrimenti sarebbe da scartare.

Introduzione

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Malattia renale cronica (CKD) è una delle attuali sfide importante di sanità pubblica in tutto il mondo1. La prevalenza di CKD negli Stati Uniti è oltre il 14% della popolazione totale, con oltre 600.000 americani soffrono la forma più grave, stadio finale malattia renale (ESRD)2. Le attuali opzioni di trattamento disponibili per quelli con ESRD includono dialisi e trapianto renale. Anche se circa 25.000 pazienti sottopongono a trapianto renale ogni anno, un numero significativo di pazienti vengono aggiunti ogni anno portando a una grande disparità tra quelli in attesa di un organo salva-vita e quelli riceventi trapianto3. Oltre ai suoi effetti negativi gravi sulla longevità e qualità della vita, la dialisi sono associato con un onere finanziario sorprendente. Nel 2014, Medicare pagato crediti ammontano a oltre $ 30 miliardi per ESRD pazienti2. Con un rifornimento limitato dell'organo e nessuna tendenza al ribasso apparente in pazienti che necessitano di dialisi, gli sforzi di ricerca finalizzati ad individuare soluzioni alternative alla dialisi e trapianto sono sempre importanti. Anche un relativamente breve ritardo nella necessità di dialisi aumenta sostanzialmente numero di un paziente di anni di vita di qualità-regolato e produttività mentre rinviando alla dialisi costi4,5,6.

Soluzioni per la perdita di tessuto funzionale, come quella in ESRD, sono attualmente allo studio in ingegneria tissutale e medicina rigenerativa laboratori, con approcci vari ampiamente da basati su impalcatura organoid fabbricazione a organo intero ingegneria utilizzando decellularized strutture dell'organo per l'impianto cellulare7,8,9,10,11. Ricapitolare complesse strutture renali dai reni marginali o scartati solo parzialmente è stato studiato. Infatti, quasi il 20% dei reni procurati per trapianto vengono scartati per vari motivi12,13. Il tessuto renale funzionale da questi presunti innesti potrebbe essere utilizzato e incorporato in uno o molti costrutti tessutale. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di lavorare con questi organi scartati, che utilizzano i reni per la matrice extra-cellulare per tessuto ingegneria fini14,15. Tuttavia, pochi hanno utilizzato il tessuto primario nephronal da reni sani per l'ingegneria dei tessuti fini16,17,18.

Un metodo precedentemente descritto da Kim et al. prevede isolamento di renale "segmenti" da reni sani del ratto, che poi sono stati seminati su impalcature di (PGA) acide poliglicolico per costrutto fabbricazione16. Tuttavia, poche informazioni sono dato per quanto riguarda la metodologia esatta dissezione e segmenti sono stati ottenuti da una combinazione di filtrazione e tritare bene. Descriviamo una modifica del presente protocollo, che analogamente produce segmenti discreti renale con architettura nephronal intatto, ma si basa invece sulle tecniche di microdissezione. Nefrectomie vengono eseguiti su topi adulti viventi, dopo di che i reni sono trasferiti il microscopio di dissezione dove la capsula renale è rimosso, e il tessuto è ulteriormente sezionato. Piccolo calibro 30½ G aghi sono usati come strumenti da taglio e anche come guide aiutando nella dissezione, come l'ago diametro è uguale al diametro del bersaglio dei segmenti renali. I segmenti isolati, in questo caso murini, renali mantengono vitalità nella cultura e incorporano con costrutti cellulari senza impalcatura endoteliale-fibroblasto19. Questi costrutti sono stati utilizzati precedentemente per altri organi, tra cui un pancreas artificiale bio20l'ingegnere.

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Protocollo

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Tutte le procedure chirurgiche degli animali descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e utilizzare Committee (IACUC) presso Medical University of South Carolina, prima di qualsiasi animali ambulatori o uso di qualsiasi tessuti animali.

1. murino nefrectomia

  1. Indossi una maschera chirurgica e protezione bouffant per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Mantenere la sterilità durante il set-up dell'area chirurgica.
    1. Posto non fenestrate telini chirurgici sul tavolo operatorio.
    2. Aprire il pacchetto di strumenti sterilizzati nell'autoclave su teli sterili. Gli strumenti necessari per il nephrectomy sono 3 piccoli emostatiche, belle forcipe con i denti, una pinzetta senza denti e forbici iris dritto.
    3. Posizionare un altro telo chirurgico non fenestrate al centro del tavolo operatorio.
    4. Preparare 5 mL di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) con calcio e magnesio, completati con 1% di penicillina/streptomicina in una provetta conica sterile 15 mL. Posto questa soluzione sul ghiaccio accanto al tavolo operatorio.
  2. Ottenere un mouse C57BL/6 di 8-12 settimane vecchio (maschio o femmina) dal complesso di stabulazione degli animali.
  3. Posizionare il mouse all'interno di una camera di induzione di anestesia e indurre con 3,5% inalato isoflurano. Posizionare un cono di naso del mouse, utilizzando 2% isoflurane per anestesia di manutenzione.
    1. Monitor per un'adeguata profondità di anestesia periodicamente durante la procedura chirurgica valutando per pedale reflex (pizzico di punta costante).
  4. Rimuovere tutti i capelli dal torso ventrale utilizzando la crema depilatoria. Sciacquare la zona con acqua distillata per garantire che tutti i capelli sono stato rimosso dall'addome.
  5. Trasferire il mouse al tavolo operatorio sterile in posizione supina sotto il telo non fenestrate superiore. Tagliare una finestratura2 2 x 2 cm nel drappo solo che ricopre l'addome del mouse.
  6. Applicare povidone-iodio seguito da etanolo al 70% all'addome usando le sfere di cotone o garza sterile.
  7. Utilizzando una pinzetta con denti e iris forbici, fare un'incisione della pelle addominale verticale di 3-4 cm parallela alla linea mediana, 0,5 cm a sinistra della linea mediana
    Nota: Se il tentativo di rimuovere il rene di destra, questo sarà un'incisione 0,5 cm a destra della linea mediana.
    1. Afferrare il peritoneo con una pinzetta senza denti e incise con forbici iris di entrare nella cavità addominale. Applicare emostatiche ai bordi laterali superiori ed inferiori della pelle e del peritoneo per posizionare lateralmente tensione e migliorare l'esposizione.
    2. Spostare delicatamente il contenuto intestinale verso il lato destro dell'addome per esporre il rene di sinistra. Posizionare delicatamente la trazione sul rene per elevarlo fuori l'addome.
    3. Posizionare una pinza emostatica attraverso l'ILO del rene di sinistra. Utilizzare forbici iris al transetto l'uretere e i vasi renali.
    4. Posizionare il rene di sinistra nel 1% soluzione DPBS penicillina/streptomicina sul ghiaccio.
    5. Trasferimento nella provetta contenente il rene per la cappa di sterili per coltura. Trasferire il rene dalla provetta conica 15 mL per una capsula di Petri 60mm (Figura 1). Sciacquare due volte con 5 mL DPBS con calcio e magnesio. Mantenere il rene sospeso in 5 mL di DPBS nel piatto 60 mm.
      1. Preparare un piatto di petri di ulteriori 60 mm con 5 mL DPBS da usarsi durante il protocollo di microdissection.
    6. Eutanasia il mouse dal thoracotomy e dissanguamento dopo l'acquisizione del rene, secondo un protocollo approvato di animali IACUC.

2. murino rene Microdissection per l'isolamento del segmento renale

  1. Continuare ad usare una tecnica sterile per questa parte del protocollo, inclusi i guanti sterili, mascherina chirurgica e bouffant per minimizzare il rischio di contaminazione.
    1. Luogo sterile tende sulla piattaforma microscopio stereo anche per quanto riguarda le aree appena a sinistra e destra del microscopio per avere un campo sterile per strumenti. Inserire fogli di plastica adesive sulle manopole di messa a fuoco del microscopio e spruzzare con etanolo al 70%. Accendere l'Illuminatore doppio collo d'oca per illuminare il palco.
    2. Apri strumenti sterilizzati (forcipe fine senza denti, manico per bisturi, lama per bisturi #15, due emostatiche dritti, due 30½ hollow-foro aghi di calibro) su teli sterili. Posto la #15 lama sul bisturi ora di gestire e collegare una pinza emostatica per ogni adattatore/mozzo dell'ago per creare strumenti per la dissezione dell'ago per un uso successivo, come mostrato nella Figura 1.
  2. Spostare i piatti petri-60mm, uno contenente il rene in DPBS e l'altri DPBS unica, dalla coltura del tessuto cappa alla zona di microscopio.
    1. Porre la capsula di petri 60 mm sotto l'obiettivo e rimuovere il coperchio per esporre il rene. Lasciare il piatto contenenti DPBS al lato sul campo sterile per un uso successivo.
    2. Spostare il piatto in modo che solo la superficie anteriore o posteriore del rene è in vista (vale a dire, la faccia piatta grande del rene, con l'altra faccia toccare il fondo del piatto). Zoom a 3.2-4x per questa parte della procedura. Usando la mano non dominante, utilizzare una pinzetta senza denti per perforare e pin il rene contro il piatto vicino ai poli inferiori e superiori del rene.
    3. Mantenere la mano non dominante sul posto per appuntare il rene. Con la mano dominante, è necessario utilizzare la lama #15 per rimuovere lo strato capsulare fibroso traslucido da superficie esposta. Radere la più superficiale 0.5 mm dalla superficie esposta del rene per rimuovere il resto della capsula.
    4. Usare la lama #15 di sezionare una piramide rovesciata del tessuto dall'area decapsulato, circa 2 mm3 dimensioni. Recuperare la capsula 60 mm solo DPBS e porre la piramide del tessuto nel piatto pulito. Scartare il resto del rene.
    5. Diminuire l'ingrandimento di 1.5-2.0 X per il resto della dissezione. Utilizzando due strumenti emostato-ago come strumenti da taglio, affettare il frammento di tessuto in pezzi progressivamente più piccoli fino a quando i segmenti di tessuto sono minore o uguale al diametro delle punte dell'ago. Una di 2 mm di tessuto renale3 dimensioni produrrà più di 50 segmenti una volta completamente sezionati.
    6. Spostare il piatto di 60 mm con segmenti renale alla cappa di coltura del tessuto. Rimuovere DPBS con 1000 µ l pipette. Aggiungere 5 mL DMEM, completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.
    7. Cultura per 3 giorni a 37 ° C in un incubatore o impianto in costrutti cellulari immediatamente.

3. renale segmento cellulare costrutto Fabrication

  1. Fibroblasti cutanei umani normali cultura (NHDF) e cellule endoteliali microvascolari adipose umane (HAMEC) per diverse settimane ottenere 7,2 x 105 fibroblasti e 1,8 x 105 cellule endoteliali per costrutto desiderato. Nella cappa di coltura tissutale, seme il rapporto appropriato dei fibroblasti alle cellule endoteliali (4:1) in pozzetti, asta-a forma di in stampi di agarosio per formare senza impalcatura pre-vascolare endoteliale-fibroblasto costrutti (SPEC) come precedentemente descritti da Czajka et al. 19.
  2. Ottenere un emostato sterilizzato, ago 30½ G e una spatola sterile con estremità piatta.
    1. Rimuovere la maggior parte dei media dalla piastra 60 mm contenenti segmenti renale, facendo attenzione a non aspirare e rimuovere i segmenti renali.
    2. Dotare le lenti di ingrandimento chirurgiche per visualizzare l'impianto dei segmenti.
    3. Raschiare la fine della spatola delicatamente lungo la parte inferiore del piatto 60 mm per ottenere 10-15 segmenti, stendere in modo uniforme lungo la punta della spatola. Posizionare la punta della spatola più vicino possibile al labbro del pozzo dove è stato seminato la SPEC.
    4. Usare uno strumento di ago di pinza emostatica-30½ G in altra mano per spostare ogni singolo segmento dalla punta spatola sul bordo del pozzo. Abbassare delicatamente ogni segmento nel bene usando la punta dell'ago fino a quando leggermente sommerso la sospensione cellulare precedentemente seminato.
    5. Cultura renale segmento-SPEC in 2:1:1 rapporto di mezzo MGF-2/EGM-2/DMEM (2,5 mL di volume totale). Cambiare ogni 24 ore di coltura per 3 giorni. Rimuovere i costrutti dagli stampi a 72 h e difficoltà o flash-blocco per l'elaborazione.

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Risultati

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Il protocollo descritto produce circa 50 segmenti renale per ogni sezione3 mm 2 piramidale del tessuto renale. I segmenti renali che sono stati elaborati e stampati hanno componenti tubolari e glomerulare in diverse proporzioni (Vedi Figura 2). I segmenti intatti sono stati sottoposti ad un test per determinare la redditività dei diversi segmenti una volta ogni 24 ore per tre giorni. Verde fluorescente calceina-AM è presente con attività dell'ester...

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Discussione

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Metodi utilizzati per tessuto renale vivente costrutti variano notevolmente per quanto riguarda sia il tipo delle cellule e biomateriali utilizzati e in molti casi, l'ingegnere sono obsoleti o non ben caratterizzati in letteratura7. Mentre molti stanno usando cellule staminali approcci o ricapitolare i singoli componenti dell'architettura renale in isolamento, è la prospettiva di ricreare artificialmente un intero organo con oltre 26 tipi differenti delle cellule differenziate da sospensioni cellu...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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NIH istituzionale Postdoctoral Training Grant, NIH-HL-007260

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Monouso ospedalierosterile non fenestrato696
Monouso ospedalierosterile fenestrato697
Pinze antizanzare Halsted 5 MiltexMil-7-4"Emostatico" curvo nel manoscritto
Forcipe Graefe extra fine, curvo con dentiFine Science Tools11155-10Pinze fini con denti
Pinze Graefe extra fini, seghettate (senza denti)Fine Science Tools11152-10Pinze fini senza denti
Forbici fini - Carburo di tungstenoFine Science Tools14568-09Forbici per iride
Scrub chirurgico Betadine con pompa, iodio povidone 7,5%Purdue Products L.P.67618-151-17
Garza di cotone sterile (4" x 4")FisherHealthcare22-415-469
Soluzione tamponata con fosfato di DulbeccoCorning21-030-CV
Soluzione di penicillina/streptomicina, 100XCorning30-002-Cl
isoflurano, USPProduttore: Piramal, Distributore: McKesson2254845
Nair Hair RemoverNair22600-23307Crema depilatoria nel testo
200 Proof EthanolDecon Laboratories2705Diluito al 70% Soluzione di etanolo
BioLite 60mm Piatto per coltura tissutaleThemo-Scientific130181
Press'n SealGlad12587-70441Applicato allo stereoscopio
SZX16 Stereo MicroscopeOlympusIlluminatore a fibre ottiche SZX16
Cole Parmer41720-20
Tubo autoportante a doppia luce, 23" L GooseneckCole ParmerEW-41720-60
Manico per bisturi #3MiltexMil-4-7
Lama sterile in acciaio al carbonio a coste, dimensione della lama 15Bard-Parker371115
31 1/2 gaugeNeedle ThermoFisher Scientifico14-826FBecton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Fetal Select 100% siero bovinoAtlas BiologicalsFS-0500-AD
Fibroblasti dermici umani normaliLonzaCC-2511
Cellule endoteliali microvascolari adipose umaneSciencell Research Laboratories7200
Lenti chirurgiche (2,5x)Orascoptic(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium con FGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endoteliale Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit per cellule di mammiferoThermoFisher ScientificL3224
Anticorpo anti-citocheratina-18Abcamab668
IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 633ThermoFisher ScientificA-21052
IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA-11010
Anti-Von Willebrand Factor AntibodyAbcamab6994
Albumina, isotiocianato di fluoresceina ConiugatoSigma AldrichA9771-50MG
Hoescht 33342BD Pharmingen561908
Background BusterInnovex BiosciencesNB306

Riferimenti

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