Micromanipolazione dei cromosomi in insetto spermatociti

Sommario

In questo protocollo, descriviamo la selezione e la preparazione delle celle appropriate per micromanipolazione e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico per riposizionare i cromosomi all'interno di quelle cellule.

Abstract

La micromanipolazione dei cromosomi è stato un metodo essenziale per illuminare il meccanismo per cromosoma congression, il punto di arresto mandrino e anafase cromosoma movimenti ed è stata la chiave per comprendere ciò che controlla i movimenti del cromosoma durante la divisione cellulare. Un biologo esperto può utilizzare un micromanipolatore per scollegare i cromosomi dal mandrino, per riposizionare i cromosomi all'interno della cellula e di applicare forze ai cromosomi utilizzando un ago di vetro piccolo con una punta molto fine. Mentre perturbazioni possono avvenire ai cromosomi utilizzando altri metodi quali l'intrappolamento ottico e altri usi di un laser, fin qui, nessun altro metodo consente il riposizionamento delle componenti cellulari sulla scala di decine o centinaia di micron con poco o nessun danno alla cella .

La selezione e la preparazione delle celle appropriate per la micromanipolazione dei cromosomi, in particolare descrivendo la preparazione di colture primarie di spermatocita cavalletta e Grillo per l'uso in cellule vive imaging e micromanipolazione, sono descritto qui. Inoltre, ci mostra la costruzione di un ago per essere utilizzato per spostare i cromosomi all'interno della cella e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick con un ago di vetro collegato ad esso per riposizionare i cromosomi all'interno della divisione delle cellule. Un risultato di esempio viene illustrato l'utilizzo di un micromanipolatore per staccare un cromosoma da un mandrino in un spermatocita primario e per riposizionare quel cromosoma all'interno della cellula.

Introduzione

Micromanipolazione ha rivelato parti del meccanismo per un congression di cromosoma, il mandrino checkpoint e movimenti cromosoma anafase. La prima pubblicazione che descrive i risultati degli esperimenti di micromanipolazione era di Robert Chambers¹. Chambers utilizzato un micromanipolatore meccanico con un ago di vetro allegata per sondare il citoplasma di un certo numero di diversi tipi di cellule. Purtroppo, i metodi di contrasto che ha permesso la visualizzazione dei cromosomi e molti altri componenti cellulari in cellule viventi non erano disponibili al momento, quindi esperimenti Chambers' non potevano mostrare gli effetti di tali compon....

Protocollo

1. preparazione di colture cellulari primarie spermatocita insetto per micromanipolazione

1. Preparazione del vetrino
   1. Ottenere una lastra di vetro di 75 x 25 mm con un foro circolare di diametro 20 mm tagliato al centro della diapositiva.
      Nota: Questi sono stati tagliati da un unico foglio di vetro della finestra per essere la dimensione di un vetrino con un foro al centro.
   2. Eseguire un vetrino coprioggetti 25 mm x 25 mm #1.5 attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen per 2 s.
   3. Applicare grasso per vuoto intorno al bordo del foro nel vetrino
   4. Posto il coprioggetto sul foro come in Figura 1

Risultati

Figura 6 Mostra una micromanipolazione campione di 2 spermatociti primari adiacenti cavalletta in diversi esempi dei possibili utilizzi di micromanipolazione. Questo esperimento è stato fatto utilizzando un microscopio invertito, contrasto di fase. 0:00 (i tempi indicati sono in min:s) immagine mostra entrambe le celle prima della manipolazione. Un cromosoma nella cella inferiore viene mostrato sotto tensione applicata dall'ago micromanipolazione (0:05; nero .......

Discussione

Con la pratica, muoversi cromosomi nella cellula può diventare una seconda natura. Gli aghi che sono sufficientemente rigida e sufficientemente sottile punta sono difficili da "ottenere l'abilità di" fabbricando, ma questa abilità inoltre viene con la pratica. Gli aghi che sono così belle che deformano quando spostato nell'olio halocarbone non sarà utili per spingere i cromosomi nella cella. Gli aghi che sono così ottuso che loro suggerimenti sono visibili e come grande come 1/3 della larghezza di un cromosoma (o superio.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
VWR micro vetro di copertura	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning Grasso per alto vuoto	VWR	AA44224-KT KEL-F
Olio #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Forbici per microdissezione, acciaio inossidabile	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 foreceps fini	Strumenti per la scienza fine	11254-20
Diametro esterno 0,85 mm, diametro interno 0,65 mm Tubo di vetro Pyrex	Drummond Scientific	Ordine personalizzato--chiama per richiedere
Microscopio a contrasto di fase invertito con obiettivo a basso ingrandimento 10X o 16X e obiettivo ad alto ingrandimento 60X o 100X	Qualsiasi microforgia di marca
	su misura o Micromanipolatore Narashige	MF-900
	su misura o Burleigh PCS-6000 con joystick di controllo piezoelettrico personalizzato	PCS-6300