Articolo metodologico

Un ratto di modello di affaticamento centrale utilizzando una versione modificata più piattaforma metodo

DOI:

10.3791/57362

⸱

14 agosto 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, West China Hospital, Sichuan University, 3Institute of Tibetan Medicine, Tibetan Traditional Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per introdurre un modello del ratto di affaticamento centrale utilizzando la modifica metodo di piattaforma multiplo (MMPM).

Abstract

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In questo articolo, abbiamo introdotto un modello del ratto di affaticamento centrale utilizzando la modifica metodo di piattaforma multiplo (MMPM). La casella più piattaforma è stata progettata come un serbatoio di acqua con piattaforme strette sul fondo. I ratti di modello sono state inserire nel serbatoio e levato in piedi sulle piattaforme per 14 h (18:00-08:00) al giorno per 21 giorni consecutivi, con un gruppo di controllo vuoto impostato per contrasto. Alla fine della modellazione, ratti nel gruppo modello hanno mostrato un'evidente aspetto affaticato. Per valutare il modello, abbiamo effettuato numerosi test comportamentali, tra cui il campo aperto test (OFT), l'elevato plus prova del labirinto (EPM) e la prova di nuoto esaustivo (ES). I risultati hanno mostrato quell'ansia, compromissione della cognizione spaziale, performance muscolare povero e rifiutato attività volontaria presentata nei ratti di modello confermano la diagnosi di affaticamento centrale. Modifiche dei neurotrasmettitori centrali inoltre verificato il risultato. In conclusione, il modello simulato con successo centrale fatica, e lo studio futuro con il modello può aiutare a rivelare il meccanismo patologico della malattia.

Introduzione

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La fatica è uno dei fattori principali che minacciano la salute umana1. Negli ultimi decenni, varie ricerche hanno dimostrato che la stanchezza è marginalmente-triggered ma centrale-driven e sempre accompagnato con disturbi emotivi e cognitivi. Fisiologo italiano r. Mosso inizialmente proposto la parola fatica centrale2. È generalmente definito come attività volontaria limitata e cognizione danno dovuto disfunzione della trasmissione degli impulsi nel sistema nervoso centrale (SNC)3. Confrontato con affaticamento muscolare periferico, affaticamento centrale sottolinea cambiamenti nel SNC, nonché il conseguenti disturbi emozionali/comportamentistici, tra cui depressione, ansia, cognizione danno e perdita di memoria. Uno studio mostra che molti fattori possono indurre fatica centrale, tra cui un'eccessiva attività fisica e lo stress mentale sono abbastanza indispensabile4. Per quanto riguarda la patogenesi, le teorie come il triptofano-kynurenine pathway ipotesi5 spiegano i cambiamenti in determinate vie; Tuttavia, studi più approfonditi sono comunque tenuti a rivelare le correlazioni di centrale-periferico di affaticamento centrale.

Poiché il meccanismo di fondo di affaticamento centrale è ancora chiaro, un modello animale efficace è molto importante per ulteriori ricerche. I modelli esistenti di affaticamento sono per lo più indotta da esercizio fisico eccessivo, come tapis roulant6 e nuoto peso caricato7, con poca preoccupazione su fattori mentali. Per meglio simulare lo sviluppo di affaticamento centrale, il nostro gruppo ha sviluppato un modello del ratto con la MMPM. Durante il processo di modellazione, ratti rimangono in piedi sulle piattaforme strette nella casella piattaforma Multiple per lunghe ore, tra cui parte del tempo di sonno. Diverso dai modelli di esercizio fisico eccessivo, il modello MMPM utilizza privazione parziale di sonno come un fattore mentale in considerazione la patogenesi complessa di affaticamento centrale.

Per la valutazione del modello, usiamo i test OFT ed EPM per determinare ansia umore e attività di volontariato. Il test di ES viene eseguito per misurare le prestazioni dei muscoli periferici. Inoltre, prendiamo del cervello del ratto e rilevare la dopamina (DA) / contenuto di serotonina (5-HT) in entrambi hypothalamuses per osservare le differenze di neurotrasmettitore centrale.

Il protocollo presentato di seguito è progettato per affaticamento centrale modello indotto da ripetute attività fisica e la mancanza di sonno, che imita una condizione comune nella vita umana. Tuttavia, regolando la durata del modello, può essere utilizzato in molti altri campi, come negli studi di osservazione e lo stress di sonno. In futuro ricerca, speriamo che questo modello vi aiuterà a scoprire altre CNS cambiamenti e la loro connessione con il sistema periferico, per rivelare il meccanismo di patogenesi di affaticamento centrale.

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Protocollo

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Tutti gli animali sono stati mantenuti in conformità con le linee guida dalla legislazione cinese sull'uso etico e cura degli animali di laboratorio.

1. pre-modellazione preparazione

  1. Preparazione in laboratorio
    1. Eseguire la lampada UV per almeno 30 min prima dell'esperimento.
    2. Controllo della temperatura di laboratorio a 25 ± 3 ° C e umidità relativa 30% circa.
    3. Accendere il luce alle 06:00 laboratorio e spegnerlo alle 18:00 per stabilire un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.
  2. Costruzione di box piattaforma multiple
    1. Costruire un serbatoio di plastica opaco senza una copertura di 110 × 60 × 40 cm3.
    2. Difficoltà quindici piattaforme circolari (h = 8 cm, d = 6,5 cm) sul fondo del serbatoio, quale inserviente distribuire in tre righe e cinque colonne. Lasciare spazio sufficiente tra ogni piattaforma, circa 10 cm tra colonne e 13 cm tra le righe.
    3. Impostare una presa di acqua sulla parte laterale del serbatoio e installare un rubinetto.
    4. Fare un coperchio di ferro-rete metallica per il carro armato con una scatola di cibo appesi su di esso.
  3. Raggruppamento e ratti di alloggiamento
    Nota: I ratti maschii di Wistar di 8 settimane di vita, peso di circa 200-210 g, sono utilizzati nell'esperimento. I ratti vivono in gruppi durante il processo di modellazione.
    1. Numero di radici di coda dei ratti con un pennarello.
    2. Pesare i ratti, escludere l'estremamente leggeri o pesanti e dividere il resto in modo casuale nei gruppi modello e controllo.
    3. Mettere delicatamente i ratti in gabbie pulite e consentire loro di ambientarsi al laboratorio per almeno 3 giorni. Fornire acqua sufficiente e approvvigionamento di generi alimentari.

2. modellazione con MMPM

Nota: Il processo inizia alle 18:00 e finisce alle 08:00 del giorno successivo, per un totale di 14 h al giorno, per 21 giorni. Per evitare i fattori di interferenza, la stessa persona è tenuta ad effettuare l'intero esperimento, mentre indossa il cappotto del laboratorio stesso. 10 ratti Wistar sono usati nell'esperimento.

  1. Appoggiate il serbatoio su una superficie piana, ad esempio, il piano. Quindi riempire il serbatoio con circa 7 cm di acqua tiepida (25 ± 3 ° C), circa 1 cm sotto la piattaforma piana.
  2. Preparare abbastanza cibo e bevande per tutti i ratti nel serbatoio per 1 giorni. Messo di foraggio e acqua nel contenitore di cibo e appenderlo sulla copertina.
    Nota: Alcuni ratti intelligenti imparano a riposare sulla casella di cibo. Se è così, li guida nel serbatoio.
  3. Prendere i ratti del gruppo modello fuori dalla gabbia, li afferra per la coda e metterli delicatamente nel serbatoio. Avviare tutti i ratti nell'acqua invece le piattaforme per motivare la loro paura dell'acqua. Assicurarsi che ogni ratto ottiene una piattaforma per stare su, mentre ratti del gruppo di controllo rimangono nelle loro gabbie originale con cibo e acqua sufficienti.
  4. Coprire il serbatoio. Monitorare i ratti per evitare lesioni accidentali. Se un ratto rimane in acqua per più di 1 ora senza salire sulla piattaforma, prenderlo dal serbatoio e rimuoverlo dal test.
  5. Dopo 14h, prendere i ratti di modello dal serbatoio e asciugare i capelli con un phon. Re-mark code dei ratti se si affievolisce. Restituire i ratti a loro gabbie originale e fornire loro cibo e acqua sufficienti.
  6. Lavare ogni angolo della vasca. Elevare un lato del carro armato e aprire il rubinetto per il liquame di deflusso.
  7. Disinfettare il serbatoio con uno spray di etanolo 75% ed esporlo alla luce UV.

3. modello di valutazione: Test comportamentali

Nota: Tutte le prove sono eseguite in laboratorio comportamentale. Rumore e luce supplementare non consentiti durante la prova per evitare disturbi. Se possibile, utilizzare la stessa persona (e) per condurre ogni test. Un cappotto scuro e guanti sono necessari per il riconoscimento di scala di grigi nell'elaborazione dell'immagine. Eseguire l'OFT prima come ha il minimo effetto sul comportamento del ratto.

  1. OFT
    1. Controllare il registratore sulla casella campo aperto per assicurarsi che esso sia collegato correttamente alla workstation e copre ogni angolo della scatola. Regolare l'illuminazione per eliminare le ombre nella casella.
    2. Spostare i ratti in laboratorio comportamentale nelle loro gabbie originale. Consentire loro di acclimatare per almeno 1 h prima del test.
    3. Pulire e disinfettare la casella con etanolo al 75% per garantire che non c'è nessun escremento o odore lasciato da esperimento precedente.
    4. Rimuovere un ratto dalla gabbia con il suo schienale e inserirlo delicatamente l'area centrale della finestra. Ritirarsi rapidamente le braccia dalla casella per non bloccare il tiro.
    5. Inserire il numero del ratto e avviare la registrazione. Contare e registrare la frequenza di attività verticali del ratto, tra cui l'allevamento e l'arrampicata.
    6. Dopo 5 min, interrompere la registrazione, prendere il topo fuori dalla scatola e restituirlo alla gabbia.
    7. Ripetere i passaggi da 3.1.3 - 3.1.6 finché tutti i ratti hanno terminato il test.
  2. EPM
    1. Eseguire la procedura di verifica preliminare e acclimatazione per quanto riguarda l'OFT (passaggi 3.1.1 - 3.1.2).
    2. Rimuovere un ratto dalla gabbia con il suo schienale e metterla delicatamente sulla parte di giunzione dei due bracci. Atterrare il topo verso il braccio sinistro aperto e lasciare in fretta per non bloccare il tiro.
    3. Inserire il numero del ratto e avviare la registrazione. Contare e registrare la frequenza delle entrate differenti del braccio. Se il ratto scende il labirinto nel test, pick up e rispedirlo a labirinto. Registrare informazioni dettagliate per l'analisi dei dati.
    4. Dopo 5 min, interrompere la registrazione, prendere il topo fuori e restituirlo alla gabbia.
    5. Rimuovere gli escrementi e pulire il labirinto con etanolo di 75% per eliminare l'odore del ratto ex.
    6. Ripetere i passaggi 3.2.2 - 3.2.5 finché tutti i ratti hanno terminato il test.
  3. Test di ES
    1. Riempire il serbatoio di nuoto (70 × 30 × 110 cm3) con 80 centimetri di acqua calda (25 ± 3 ° C).
      Nota: Se c'è un termostato nel serbatoio, la temperatura dell'acqua dovrebbe essere impostata circa 37 ° C, che è simile alla temperatura corporea del ratto. In caso contrario, impostarlo a temperatura ambiente per mantenere costante.
    2. Fanno un carico per ogni ratto con perno grappoli e legarlo delicatamente sulla sua radice della coda. Il carico pesa 10% del peso del ratto.
    3. Afferrare un topo dalla coda e gettarlo nel carro armato di swimming. Se i ratti huddle o aggrappano alla parete, li contraddistingue e spingerli indietro nell'acqua.
    4. Avviare il cronometraggio al momento quando il ratto viene messo in acqua e i tempi di arresto quando è esaurita, che è dimostrato come il fallimento a lottare fuori dall'acqua con la bocca e il naso sotto l'acqua per più di 10 s.
      Nota: A volte, esaurimento e annegamento si verificano all'improvviso. Essere sicuri di avere abbastanza sperimentatori per registrare e salvare l'animale allo stesso tempo.
    5. Rimuovere i ratti esausti fuori dall'acqua senza interrompere gli altri. Asciugare i capelli, ri-contrassegnare i loro numeri e rimandarli a gabbia.
    6. Al termine di un gruppo, cambiare l'acqua nel serbatoio. Al termine di tutti i ratti, svuotare il serbatoio di nuoto e pulire e sterilizzarlo con etanolo e luce UV.

4. modello di valutazione: Neurotrasmettitore centrale rilevazione

  1. Anestetizzare il topo con l'iniezione intra-peritoneale di idrato di cloralio 10% (3 mL/kg) fino a quando è incosciente.
  2. Decapita il ratto.
  3. Fare un'incisione longitudinale lungo la linea post-mediale, aprire il cranio ad entrambi i lati ed esporre il cervello. Capovolgere il cranio, il cervello di rimuovere e mettere il cervello su un sacchetto di ghiaccio.
  4. Separare e rimuovere l'ipotalamo, che è la zona a forma di diamante nella parte centrale della base del cervello che ha un chiaro confine con tessuti circostanti. Posto in una provetta sterile e congelarlo con azoto liquido. Conservare tutti i campioni in frigorifero-80 ° C.
  5. Rilevare il contenuto di DA e 5-HT nell'ipotalamo mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)8.

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Risultati

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Descriviamo un modello del ratto di affaticamento centrale utilizzando MMPM. 24 ratti Wistar sono divisi a caso nel gruppo di controllo e il gruppo di modelli, con 12 ratti in ogni gruppo. L'apparato di modello è stato progettato come un serbatoio di acqua con piattaforme strette sul fondo (Figura 1). Ratti di modello stanno sulle piattaforme per 14 h al giorno, compreso il tempo parziale di sonno, per 21 giorni (Figura 2).

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Discussione

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Il MMPM è originariamente progettato per privazione di sonno9. Ratti sono lanciati in un serbatoio d'acqua con piattaforme fissate sul fondo. Spinti dalla paura istintiva di acqua, ratti rimangono in piedi sulle piattaforme e si verifica senza dormire. Lo studio dimostra che diverse ore di privazione di sonno conducono ai vari cambiamenti nel comportamento del ratto e dell'umore, tra cui riconoscimento danno10, emozioni negative11e fatica centrale. A...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da Natural Science Foundation di Pechino (No.7162124) e Xin-ao Foundation per Pechino all'Università di medicina cinese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Serbatoio dell'acqua per la privazione del sonno a piattaforma multiplaPersonalizzazione, è fornito dal laboratorio neuroimmunologico dell'Università di Medicina110 cm x 60 cm x 40 cm. Ci sono 15 piccole piattaforme di plastica nella parte inferiore. La piccola piattaforma ha un diametro di 6,5 cm e un'altezza di 8 cm
Ratti WistarBeijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Companynumero di licenza SYXK (Pechino) 2016-0011Utilizzare 32 ratti maschi sani Wistar, di 8 settimane (200-210 g)
Cromatografo liquido ad alte prestazioni Agilent 1100LCAgilent  G1379A, G1311A, G1313A , G1316A   G1379A, pompa cromatografica tipo G1311A, campionatore automatico G1313A, scatola di temperatura della colonna G1316A
Rivelatore elettrochimico DECADE II SDC elettrododell'azienda, elettrodo di riferimento Ag/AgCl, stazioni di lavoro (Clarity CHS)
Centrifuga di refrigerazione ad alta velocità Biofuge StratosHERAEUS
VCX130 Strumento di fratturazione ad ultrasuoniSONICS
Bilancia elettronica ACS-ZEASSviluppo della tecnologia Phos, Pechino.Il peso dei ratti pesati può essere preciso fino a 0,1 g.
Personalizzazione della scatola a campo aperto, è fornita dal laboratorio neuroimmunologico dell'Università di Medicina Cinese di Pechino scatoladi legno di campo aperto  100 cm per 100 cm x 40 cm, parete interna e fondo come il grigio. Il fondo è diviso in 25 quadrati di uguale area, ognuno dei quali misura 20 cm x 20 cm, e le 16 griglie lungo la parete esterna sono quelle esterne, mentre le altre 9 griglie sono centrali. La telecamera è montata sopra la mediana.
Elevato Plus-labirintoPechino zhongshi dechuang sviluppo tecnologico co. LTD.Le braccia aperte e le braccia chiuse della croce sono composte da 30 cm x 5 cm x 15 cm, e l'area centrale è di 5 cm x 5 cm, con una telecamera montata sopra il centro e alta 45 cm.
secchio da nuoto per topi.Zhenhua strumento biologico equipment co., LTD. Anhui, Cina.Il volume del tamburo di plastica è di 70 cm x 30 cm x 110 cm, che viene utilizzato per nuotare nei ratti.
TermometroShiya strumento co., LTD., changzhou, Cina.Controllare la temperatura dell'acqua
Piccola pompa dell'acquaXincheng technology co., LTD., chengdu, Cina.Utilizzato per il serbatoio dell'acqua e il comportamento di nuoto.
Software comportamentale Ethovition3.0.Nuldus, Paesi BassiAnalisi della misurazione dei video sul comportamento dei ratti.
Cinese di Pechino di carbonio vetroso olandese ANTEC

Riferimenti

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