Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

Sommario

Questo metodo di discesa di RNA permette di identificare i bersagli di RNA di un RNA lunghi non codificanti (lncRNA). Basato sull'ibridazione di fatto in casa, progettato anti-senso del DNA del oligonucleotide sonde specifiche per questo lncRNA in un tessuto opportunamente fisso o linea cellulare, in modo efficiente permette la cattura di tutti i target di RNA della lncRNA.

Abstract

Lungo non codificanti RNA (lncRNA), che sono sequenze di più di 200 nucleotidi senza una cornice di lettura definiti, appartengono alla famiglia di RNA non codificante regolamentari. Sebbene le funzioni biologiche rimangono in gran parte sconosciute, il numero di questi lncRNAs è costantemente aumentato e ora si stima che gli esseri umani possono avere più di 10.000 tali trascrizioni. Alcuni di questi sono noti per essere coinvolti in importanti vie regolarici di espressione genica che si svolgono a livello trascrizionale, ma anche alle diverse fasi di RNA co - e maturazione post-trascrizionale. In questi ultimi casi, RNA che puntano alla lncRNA deve essere identificati. Questo è il motivo per cui è utile sviluppare un metodo che consenta l'identificazione del RNA associati direttamente o indirettamente con un lncRNA di interesse.

Questo protocollo, che è stato ispirato da protocolli precedentemente pubblicati che permette l'isolamento di un lncRNA insieme a sue sequenze di cromatina associata, è stato adattato per consentire l'isolamento di RNA associati. Abbiamo determinato che due passi sono fondamentali per l'efficienza del presente protocollo. Il primo è la progettazione di specifiche sonde del oligonucleotide DNA anti-senso in grado di ibridare ad lncRNA di interesse. A tal fine, la struttura secondaria di lncRNA è stata preveduta dalla bioinformatica e sonde del oligonucleotide antisenso sono stati progettati con una forte affinità per le regioni che visualizzano una bassa probabilità di appaiamento interno. Il secondo passaggio cruciale della procedura si basa sulle condizioni fissativa dei tessuti o cellule in coltura che è necessario mantenere la rete tra tutti i partner molecolari. Accoppiato con sequenziamento di RNA di alte prestazioni, questo protocollo di discesa del RNA è in grado di fornire l'intero Interactoma di RNA di un lncRNA di interesse.

Introduzione

L'obiettivo generale del metodo descritto qui è quello di identificare partners molecolari di RNA di un RNA lunghi non codificante (lncRNA). LncRNA corrispondono a sequenze di più di 200 nucleotidi senza una cornice di lettura definiti. Alcuni di loro sono stati indicati per essere coinvolti nella regolazione dell'espressione genica, non solo a livello trascrizionale, ma anche alle diverse fasi di RNA co - e maturazione post-trascrizionale. In questi ultimi casi, partners molecolari della lncRNA sono RNAs che dovranno essere identificati. Un metodo che consenta l'identificazione del RNA associati direttamente o indirettamente con un lncRNA di interesse sarebbe quindi necessario sviluppare.

Precedentemente pubblicato metodi, come isolamento della cromatina di purificazione RNA (ChIRP)^1,2 e catturare l'ibridazione analisi di RNA target (grafico)^3,4, consentire l'individuazione di alto-rendimento dei RNA-proteine e siti di legame genomico di un lncRNA specifico. In questi due metodi, il lncRNA di interesse in primo luogo è stato ibridato di oligonucleotidi complementari biotinilato e il complesso fu poi isolato usando le perle di streptavidina. La differenza principale tra queste due tecniche è relativo alla progettazione di sonde destinate a lncRNAs. ChIRP, la strategia ispirato da RNA pesce, consisteva di progettazione di un pool di breve sonde del oligonucleotide DNA complementare per affiancare l'intera lunghezza della lncRNA. Al contrario, nel grafico, gli autori hanno adattarono un test di mappatura di RNasi H su lncRNAs di siti disponibili per l'ibridazione della sonda.

La procedura proposta qui al design oligonucleotide antisenso DNA biotinilato sonde usi bioinformatica modellazione di lncRNA struttura secondaria⁵ per selezionare sonde con una forte affinità per le regioni che visualizzano una bassa probabilità di interno base di accoppiamento. Questa procedura ha il vantaggio di essere meno costosi di quelli basati su pozze di affiancamento del oligonucleotide sonde² e richiede meno tempo rispetto a quelli basati sulla sensibilità di RNasi-H⁴.

Come c'è un corpo crescente di prova per regolazione genica post-trascrizionale di lncRNAs⁶, è molto utile sviluppare un approccio che permette la cattura di RNA che sono bersaglio di un lncRNA. Inoltre, per essere utilizzabile per la maggior parte delle applicazioni, l'approccio è stato ottimizzato sia in cellule in coltura ed estratti di tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite nell'accordo rigoroso con la Comunità economica europea per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (86/609/CEE e 2010/63/UE) e licenza concessa a Becquet D. (Préfecture des Bouches-du-Rhône, autorizzazione n. 13-002).

1. Design della sonda

1. Utilizzando la sequenza primaria di lncRNA d'interesse, generare la struttura secondaria del "RNAstructure Webserver"⁵.
   Nota: Su questo sito, diversi algoritmi possono essere utilizzati. Gli strumenti di tre previsione che danno i migliori risultati per i disegni di sonda sono: "Fold" (struttura più bassa energia libera), "MaxExpect" (coppie di basi altamente probabile) e "Probnot" (probabile paia di basi tra cui pseudoknots). Queste tre analisi possono essere eseguite e rispetto. Altri server web, ad esempio il RNA di Vienna websuite⁷, può anche essere utilizzato.
   1. Selezionare le regioni che visualizzano una bassa probabilità di appaiamento interno e progettare oligonucleotidi anti-senso di 25 basi con una forte affinità per queste regioni.
      Nota: Il contenuto di GC di queste sonde deve essere compresa tra 40 e 60%. Utilizzando uno strumento di ricerca di allineamento (Blast), assicurarsi che le sonde del oligonucleotide antisenso selezionato non riconoscono sequenze nucleotidiche in altri RNA espresse nel sistema di cellule selezionate.
2. Design anche una non-specifici del oligonucleotide sonda di DNA di 25 basi Visualizza né affinità per il lncRNA di interesse né per altre sequenze di RNA nel genoma di interesse.
3. Ordinare le sonde con biotina all'estremità 3'.
   Nota: Al fine di ridurre l'ostacolo sterico, la distanza tra oligonucleotide e biotina dev'essere aumentata con un distanziatore di triethyleneglycerol. Per un risultato ottimale e di essere in grado di valutare la specificità dei risultati del pull-down, si consiglia di progettazione 3 diverse sonde del oligonucleotide anti-senso e quindi di confrontare sperimentalmente la loro efficienza.

2. Cross-linking

1. Cross-linking di cellule in coltura
   1. Cellule ipofisarie sommatolactotroph di cultura il GH4C1 in medium di F10 di Ham completate con siero equino 15% e 2% di siero fetale di vitello. Crescere le cellule fino alla confluenza in piastre di coltura di 78,5 cm² . Ciò corrisponde approssimativamente a 1 x 10⁷ cellule.
   2. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule da una piastra di coltura di GH4C1 78,5 cm² confluente, poi risciacquo con il volume medio di fosfato: 1x tampone salino (PBS)
   3. Fissare le cellule con una soluzione di paraformaldeide 1% in PBS (10 mL per un piatti di 78,5 cm² ); Questa soluzione deve essere preparata da una soluzione madre di paraformaldeide 4%. Cross-link sotto agitazione per 10 min a temperatura ambiente (TA).
      Attenzione: Paraformaldeide (PFA) è tossico e deve essere maneggiato con cautela.
   4. Placare l'azione di paraformaldeide aggiungendo 1/10 di volume di glicina 1,25 M (1 mL / 10 mL di soluzione di paraformaldeide); Agitare 5 minuti a TA.
   5. Scartare i media mediante aspirazione e lavare due volte (5 min) con 1 X il volume medio di PBS.
   6. Aggiungere un volume di PBS corrispondente a 1/10 del volume di media, raccogliere le cellule con un raschietto di cella e poi il trasferimento a una provetta da centrifuga.
   7. Rotazione a 510 g a 4 ° C per 5 min.
   8. Rimuovere tanto surnatante possibili.
   9. Conservare il pellet a tempo indeterminato come necessario a-80 ° C.
2. Cross-linking del tessuto
   1. Mettere 5 mg di tessuto ghiandola pituitaria del mouse appena ottenuti in una soluzione di paraformaldeide 1% diluito in PBS (circa 10 volte il volume del tessuto), agitare per 10 minuti a TA.
   2. Placare l'azione di paraformaldeide aggiungendo una soluzione di glicina di 1,25 M (1 mL / 10 mL di soluzione di paraformaldeide) e agitare 5 minuti a TA.
   3. Scartare i media dall'aspirazione e lavare due volte con PBS (circa 10 volte il volume del tessuto). Rimuovere tanto surnatante possibili.
   4. Conservare il tessuto reticolato a tempo indeterminato a-80 ° C.

3. cellula o tessuto Lisi

1. Preparare il tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 10 mM EDTA, 1% SDS completati con 200 U/mL di una soluzione di inibitore di RNAsi e un cocktail di proteasi inibitore 5 µ l/mL).
2. Per ottenere i campioni lisati senza previo scongelamento, risospendere il pellet di cellule o tessuti reticolati con questo buffer (circa 1 mL per 100 mg di pellet cellulare o tessuto). Un pellet cellulare ottenuta da 1 x 10⁷ cellule danno luogo ad un campione lisato contenente circa 20 mg di proteina.
   Nota: A seconda del tessuto utilizzato, deve essere aggiunto un passo di rottura meccanica. In questo caso, è importante evitare il riscaldamento dei campioni durante questo ulteriore passaggio.

4. sonicazione

1. Ottimizzazione delle condizioni sonicazione
   1. Programmare il sonicatore con 2-5 serie di 30 s ON e 30 s OFF.
   2. Eseguire prove per ottimizzare le condizioni di sonicazione su campioni lisati diluiti (fattore di diluizione ½ o ¼ pari a circa 5 o 10 mg di proteina). Posto diluito campioni lisati nel bagno d'acqua 4 ° C e inizia la serie di sonicazione.
   3. Purificare il RNA con un kit di purificazione di RNA o con un reagente di isolamento del RNA (ad es., Trizol).
   4. Caricare la totalità di RNA purificato su un'elettroforesi su gel di agarosio all'1% in tampone TBE, verificare la lunghezza dei frammenti di RNA. Questa lunghezza deve essere compreso tra 200 e 800 bp.
      Nota: A seconda della dimensione del frammento di RNA, l'efficienza delle sonde del oligonucleotide antisenso può variare. Si consiglia quindi di verificare l'efficienza delle sonde in condizioni diverse di sonicazione.
2. Sonicazione dei campioni lisati
   1. Campioni di luogo lisata corrispondenti a 20 mg di proteine (ottenuta dopo passo 3.2) a 4 ° C bagno d'acqua e iniziare la serie di sonicazione come ottimizzato al punto 4.1.
   2. Subito dopo sonicazione, centrifugare per 5 min a 12.000 g a 4 ° C. Trasferire i surnatanti in nuove provette da centrifuga.
      Nota: Per garantire omogeneità, surnatanti replicati possono essere riuniti e ridistribuiti in questa fase.

5. RNA Pull-down

1. Giorno 1 – passo di ibridazione
   1. Aggiungere 2 volumi di tampone di ibridazione (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 15% formammide aggiunto estemporaneamente) a surnatanti raccolti dopo il passaggio di sonicazione. Vortice.
   2. Trasferimento di 20 µ l di ciascun campione in una provetta da centrifuga (ingresso campioni) e conservare a-20 ° C.
   3. Aggiungere 100 pmol di oligonucleotidi biotinilati (specifico o non specifico; cfr. tabella 1) per ogni campione. Incubare per 4-6 h sotto agitazione moderata in un rotatore tubo a TA.
   4. Aggiungere 50 µ l di branelli magnetici streptavidina completati con 200 U/mL di una soluzione di inibitore di RNAsi e un cocktail di proteasi inibitore 5 µ l/mL.
   5. Incubare per una notte sotto agitazione moderata sul rotatore tubo a TA.
2. Giorno 2 – passo di isolamento del RNA
   1. Utilizzare il supporto magnetico per separare perline da lysate delle cellule, scartare il surnatante e lavare le perle con 900 µ l di tampone di lavaggio (SDS 0.5%, SSC 2 x). Ripetere 5 volte intervallati da 5 min agitazione sul rotatore a TA.
   2. Dopo l'ultimo lavaggio, decantare un'ultima volta e 95 µ l di tampone a Proteinease K (10 mM Tris-HCl pH 7.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) e 5 µ l di proteinasi-K (20 mg/mL) per i campioni.
   3. Su ghiaccio, scongelare i campioni di ingresso (20 μL) e aggiungere 75 µ l di tampone di Proteinease K e 5 µ l di proteinasi-K (20 mg/mL).
   4. Incubare tutti i campioni con proteinasi K per 45 min a 50 ° C quindi 10 min a 95 ° C.
   5. Raffreddi il campione in ghiaccio per 3 minuti prima che separa le perline da RNA con il supporto magnetico. Mantenere il surnatante e ignorare le perline.
   6. Purificare il RNA con un kit di purificazione di RNA, che dovrebbe includere una fase di digestione del DNA. Archivio RNAs a-80 ° C.
   7. Eseguire qPCR trascrizione inversa (RT-qPCR) utilizzando un kit di RT seguito da qPCR utilizzando primers specifici (tabella 1).
   8. Costruire due librerie di DNA corrispondente alle due piscine RNA ottenute con ciascuna delle specifiche sonde Neat1 (tabella 1). Eseguire l'ordinamento in un sistema di sequenziamento di nuova generazione.

Risultati

Parecchi studi recenti hanno dimostrato che lncRNAs svolgono un ruolo essenziale in quasi ogni processo biologico importante e che questo ruolo si ottiene attraverso il controllo dell'espressione genica che si verificano sia presso il trascrizionale e i livelli post-trascrizionali Risultati in quest'ultimo caso che RNA può essere la destinazione di lncRNAs⁶.

La lncRNA nucleare arricchito abbondanti trascrizione 1 (Neat1) è implicata in diverse neuropatologie come demenza frontotemporal, sclerosi laterale amiotrofica o epilessia^8,9,10ed è anche misregulated in diversi tipi di cancro^11,12.

Questo lncRNA è noto anche per essere la componente strutturale di specifici organismi nucleare, il paraspeckles e di essere coinvolti nella regolazione post-trascrizionale circadiana di gene espressione¹³. Paraspeckles che si trovano in ogni nucleo cellulare e sono formate intorno non solo Neat1, che è necessario per la loro formazione, ma anche nei dintorni di legame al RNA diverse proteine (RBP)¹⁴, sono infatti noti per essere in grado di mantenere gli obiettivi di RNA all'interno del nucleo¹⁵ . La formazione di paraspeckles è raggiunto attraverso l'associazione dei vari componenti. Questa formazione è stata indicata per visualizzare un modello ritmico circadiano guidando una ritmica ritenzione nucleare di RNA target¹³. La ritenzione nucleare di bersagli di RNA da paraspeckles può verificarsi tramite l'associazione di RBP o direttamente tramite associazione di RNA/RNA, ma nella misura di RNA presi di mira da paraspeckles ha dovuto essere determinato. Per identificare il RNA mirati direttamente o indirettamente da Neat1, un protocollo di discesa di RNA è stato progettato che permette l'isolamento e l'identificazione di tutte le destinazioni Neat1 RNA in cellule coltivate anche come in campioni di tessuto (vedere la Figura 1 per un grafico presentazione della tecnica).

Il protocollo è stato applicato con successo anche l'identificazione di target di RNA di un lncRNA un'altra metastasi associate polmone Adenocarcinoma trascrizione 1 (Malat1). Malat1 è un lncRNA altamente conservata ed espresso trovato in macchioline nucleare insieme a RNA diversi fattori di splicing. Malat1 è conosciuto per essere coinvolti nella regolazione dello splicing di diversi pre-mRNA nascente^16,17.

Specifiche (SO) e non-specifici oligonucleotidi (NSO) sono stati generati utilizzando la strategia di progettazione sonda descritta qui. Questa strategia si basa sulla selezione delle regioni che visualizzano una bassa probabilità di base interna abbinamento come predetto dalla struttura secondaria del lncRNA e sulla progettazione di sonde specifiche con una forte affinità per queste regioni. Come un risultato rappresentativo di queste previsioni di bioinformatica, un quadro della struttura secondaria prevista di una sequenza di Neat1 (nucleotidi 1.480 a 2.000) insieme con la posizione di due progettato in modo da sonde sono riportati nella Figura 2.

Le sonde progettate erano diretti a rat Neat1 o Malat1 per le cellule coltivate GH4C1 e mouse Neat1 per estratti di tessuto pituitario (tabella 1). Il relativo arricchimento in Neat1 o Malat1 è stato calcolato per sonde specifiche e aspecifiche rispetto gli esempi di input. La figura 3 Mostra l'efficienza delle sonde specifiche per Neat1 menu a discesa nel ratto GH4C1 pituitario di cellula (Figura 3A) e nel topo tessuto pituitario estratti (Figura 3B). Quando si utilizza il protocollo di progettazione sonda per generare oligonucleotide specifico (così) sonde indirizzati a Malat1, uno efficace sonda è stata ottenuta mentre un'altra non era abbastanza efficiente ed è stato scartato (Figura 4A).

Dopo un RNA discesa procedura seguita dagli esperimenti di RT-qPCR, alcuni RNA valutati con primers specifici (tabella 1) sono stati indicati per essere associati con Neat1 o Malat1 in GH4C1 estratti. Il RNAs associato Neat1 in estratti delle cellule GH4C1 inoltre sono stato indicato per essere associato con Neat1 in estratti di tessuto pituitario. Infatti, dopo Neat1 RNA pull-down, Malat1 è stato trovato per essere bersaglio di Neat1 sia nella linea cellulare GH4C1 e in estratti di tessuto pituitario del mouse (Figura 5A). Reciprocamente, Neat1 è stato arricchito in modo significativo dopo Malat1 RNA discesa eseguita con una sonda specifica in GH4C1 cellule (Figura 4B). Mettendo in evidenza la stretta relazione tra i due lncRNAs, questi risultati sono coerenti con il ruolo di coregolamentazione potenziale di Neat1 e Malat1 suggerito da topi knockout Malat1 che visualizza le variazioni nell'espressione di RNA Neat1^{18, 19}. le trascrizioni delle due principali ormoni ipofisari, ormone della crescita (Gh) (figura 5B) e prolattina (Prl) (Figura 5) significativamente sono state arricchite in seguito RNA Neat1 menu a discesa con sonde specifiche in entrambe le cellule GH4C1 e ipofisi estratti, suggerendo una possibile regolazione dei due ormoni da Neat1. Quando si confrontano le due sonde specifiche utilizzate, sembrava che la loro efficienza potrebbe variare a seconda del target di RNA considerato (figura 5B e Figura 5). Questi risultati evidenziano la necessità di progettare diverse sonde specifiche al fine di selezionare quelli visualizzati non solo la migliore efficienza nell'arricchimento di lncRNA la discesa, ma anche la migliore efficienza nell'arricchimento dei suoi target di RNA.

Il metodo di pull-down di RNA può anche essere seguito da sequenziamento di alto-rendimento di RNA per ottenere l'elenco completo delle destinazioni di RNA di un lncRNA di interesse¹³. Un'analisi di RNA-seq su cellule ipofisarie GH4C1 dopo Neat1 RNA discesa utilizzando le due sonde specifiche sopra descritte è stato effettuato. Si deve osservare che un controllo negativo utilizzando un NSO anche poteva essere sottoposti ad analisi di RNA-seq, se il livello di RNA recuperati dopo il pull-down di RNA con NSO è sufficiente per consentire la costruzione di librerie. Questo non era il caso nella precedente esperienza¹³. Librerie che sono state generate dopo l'uso di sonde specifiche sono stati analizzati usando Tophat/gemelli pipeline solo trascrizioni con valori di frammento per kilobase a e²⁰ milioni di letture mappate (FPKM) superiori a 1 sono stati presi in considerazione. Gli elenchi ottengono con le due sonde specifiche indirizzate a Neat1 (tabella 1) sono stati attraversati per valutare la specificità dei risultati. 4.268 geni sono stati trovati collegati con paraspeckles, che ha rappresentato il 28% delle trascrizioni espresse in cellule di GH4C1¹³. Coerente con i risultati ottenuti usando l'analisi qPCR (Figura 5A-C), le trascrizioni di Gh, Prl e Malat1 sono state trovate per essere associati con Neat1. Il metodo di pull-down di RNA ha pertanto dimostrato di essere uno strumento efficace per esplorare l'interazione tra lncRNAs e ai loro obiettivi di RNA.

Figura 1: rappresentazione grafica del RNA tirare giù procedura. Il primo giorno, cellule o tessuti erano reticolati con paraformaldeide, lisati e sonicati prima del passaggio di ibridazione che è stato eseguito aggiungendo biotinilati sonde specifiche. Branelli magnetici streptavidina si aggiunsero poi per separare materiale specifico dal resto del lysate delle cellule. Il secondo giorno, perline sono sono isolati da un magnete e lavati più volte. Un passo di de-reticolazione ha permesso il recupero di RNA che sono stati purificati e utilizzati per RT-qPCR o analisi di RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: struttura secondaria di una sequenza di Neat1 (nucleotide 1.480 a 2.000) come predetto da risorsa bioinformatica (webserver RNAstructure; minima energia libera struttura). La struttura è colorata secondo il grado di probabilità di appaiamento. Le due sonde di oligonucleotidi (SO1 e SO2) in rosso sono posizionate lungo la struttura di RNA Neat1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: convalida qPCR di arricchimento Neat1 versus input. convalida di qPCR di arricchimento Neat1 contro ingresso dopo Neat1 RNA tirare giù da due diverse sonde specifiche (SO1-rn e SO2-rn per le cellule GH4C1 e SO1-mm e SO2-mm per tessuto pituitario) rispetto ad un non-specifico uno (NSO-rn per le cellule GH4C1 e NSO-mm per tessuto pituitario) nelle cellule di ratto GH4C1 (A) e nell'ipofisi del mouse tessuto estratti (B). I risultati sono la media ± SEM ottenuti in esperimenti da 3 a 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: convalida di qPCR di arricchimento Malat1 e Neat1 contro ingresso dopo Malat1 RNA tirare giù. convalida di qPCR di Malat1 (A) e Neat1 (B) arricchimento contro ingresso dopo Malat1 RNA tirare giù da due diverse sonde specifiche (SO3-rn e SO4-rn) rispetto ad un non-specifico uno (NSO-rn) nelle cellule di ratto GH4C1. I risultati sono la media ± SEM ottenuti in 3 esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: qPCR convalida del Malat1, Gh, Prl arricchimento contro ingresso dopo abbattere il RNA Neat1. convalida di qPCR di Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) arricchimento contro ingresso dopo Neat1 RNA tirare verso il basso usando le sonde specifiche diverse rispetto a uno non-specifici in cellule del ratto GH4C1 ed estratti di tessuto pituitario del mouse. I risultati sono la media ± SEM ottenuti in esperimenti di 3 a 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOMI DI SONDA	Sequenze
NSO-Rn	TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-Rn	CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-Rn	GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-Rn	AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-Rn	AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mm	GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mm	GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mm	CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
qPCR primer:
Rattus norvegicus
Neat1	AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
	TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1	GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
	TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
Gh1	CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
	GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1	TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
	CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
Gh1	CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
	TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

Tabella 1: Sequenze di DNA sonde del oligonucleotide e qPCR primer

Discussione

RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) dal loro numero e la diversità rappresenta un grande campo di ricerca e la maggior parte dei loro ruoli sono ancora da scoprire. Molti di questi lncRNAs hanno una localizzazione nucleare e fra loro, alcuni sono implicati nelle vie di regolazione dell'espressione genica attraverso meccanismi che trascrizionali e post-trascrizionale. Una delle sfide attuali in questo campo è quello di capire la rilevanza di tali lncRNAs in elaborazione post-trascrizionale di RNA. Per questo scopo, RNAs presi di mira da lncRNAs devono essere identificati. Ispirato da precedenti studi focalizzati sull'associazione di lncRNAs con cromatina, abbiamo sviluppato una procedura che permette l'identificazione di RNAs connesso con un lncRNA. Il successo del presente protocollo, denominato RNA menu a tendina, è dipendono principalmente da due punti cruciali, vale a dire la progettazione di anti-senso sonde del oligonucleotide del DNA che hanno per specificamente ed esclusivamente ibridare con il lncRNA di interesse e le condizioni del tessuto o fissazione delle cellule che devono preservare l'integrità della rete tra tutti i partner molecolari.

Precedentemente pubblicato protocolli forniti procedure per isolare un lncRNA insieme a sue sequenze di cromatina associata (ChIRP^1,2, grafico^3,4). In tali protocolli, diverse strategie sono state impiegate per disegno che sonde del oligonucleotide di biotinylated del DNA anti-senso. Nella procedura ChIRP, gli autori hanno utilizzato un pool di DNA biotinilato sonde del oligonucleotide che comprende l'intera lunghezza del lncRNA di interesse dopo l'esclusione di tutte le sonde ridondanti e non specifico^1,2. Nel protocollo grafico, gli autori hanno identificato le regioni della lncRNA che sono più accessibili per l'ibridazione e progettati oligonucleotidi cattura destinati a queste regioni. Queste regioni sono state selezionate in base alla loro sensibilità di RNasi H. Infatti, utilizzando la proprietà di RNasi-H per idrolizzare RNAs in siti di legame al DNA-RNA, gli oligonucleotidi che si ibridano per siti accessibili nella lncRNA producono ibridi RNA-DNA e portano alla scissione enzimatica della lncRNA. Gli autori hanno selezionato tre di questi oligonucleotidi di cattura del candidato e li ha usati in un cocktail^3,4.

La procedura che abbiamo utilizzato per design le sonde del oligonucleotide anti-senso biotinylated del DNA era vicino a che utilizzate nel protocollo grafico, ma le regioni ibridazione-disponibile il lncRNA desiderato non sono state selezionate in base alla loro sensibilità di RNasi H, ma secondo loro bassa probabilità di appaiamento interno come determinato dalla Bioinformatica modellazione della struttura secondaria lncRNA. Deve essere notato che diverse strutture secondarie saranno previsto utilizzando algoritmi diversi e sonde per essere selezionati dovrebbero essere quelli che si ibridano a sequenze disponibili di lncRNA nel maggior numero di strutture secondarie preveduto. Gli stessi risultati sono stati ottenuti utilizzando un cocktail di tre progettato, sonde specifiche o una singola sonda individualmente. Questo viene richiesto l'utilizzo di due sonde separate, specifiche e la considerazione dei risultati positivi come quelli che sono comuni a queste due sonde. Infine, si raccomanda pertanto all'inizio dello sviluppo del metodo, per un risultato ottimale e per essere in grado di valutare la specificità dei risultati del pull-down, per progettare 3 differenti del oligonucleotide antisenso sonde e quindi di confrontare sperimentalmente l'efficienza, tanto più che l'efficienza della sonda può essere alterato da preparazione del lysate delle cellule. Tuttavia, la procedura di sonda design basato sulla modellazione di bioinformatica di lncRNA secondaria struttura che abbiamo usato è rimasto meno costoso rispetto a quello basato su pozze di affiancamento del oligonucleotide sonde², e questo è stato molto meno tempo rispetto al metodo basato il RNasi H sensibilità⁴.

Un controllo negativo deve essere eseguito anche utilizzando come sonde del oligonucleotide negativo cattura il oligonucleotide di biotinylated di DNA di senso o strapazzate sonde del oligonucleotide, o oligonucleotidi diretti contro un RNA non correlato. A causa dell'esistenza di trascritti antisenso naturali lncRNAs, uso di sonde del oligonucleotide di senso a volte può essere insufficiente. Indipendentemente dalla sonda oligonucleotide selezionato per il controllo negativo, è necessario controllare di scoppio che esso non ibridato con un RNA noto e da tenere a mente che questo oligonucleotide possa ibridare ad un lncRNA ancora annullare l'annotazione.

I lisati cellulari utilizzati in questi esperimenti di pull-down di RNA sono stati ottenuti da 10⁶ a 10⁷ celle quando si lavora con le cellule coltivate e da 1 a 10 mg quando si lavora con il tessuto. La preparazione dei lisati cellulari deve essere adattato in base al tipo di tessuti o cellule utilizzato con due passaggi principali che devono essere ottimizzati: vale a dire, il passo di cross-linking che permette la formazione di legami covalenti tra le lncRNA e i suoi partner molecolari e la passo di sonicazione che riduce la viscosità di triturazione della cromatina.

Lo scopo del passo del cross-linking è quello di garantire che tutti gli obiettivi di RNA rimangono chiusi per la lncRNA inducendo la formazione di una rete tra tutti i partner molecolari. Un passo di trattamento di paraformaldeide che formerà legami covalenti tra le lncRNA e i suoi partner permette alla rete di essere reticolata. Nel protocollo grafico, è stato suggerito se lavorando con lncRNA nucleare, per eseguire un primo trattamento con paraformaldeide nel complesso cella lysate e un secondo trattamento sulla frazione di acido nucleico isolato^3,4. Abbiamo osservato che questo passaggio supplementare ridotta l'efficienza delle sonde, probabilmente riducendo l'accessibilità di lncRNA nelle cellule. Di conseguenza, il grado di reticolazione di paraformaldeide dev'essere adattato tenendo conto della cella o tipo di tessuto utilizzato, la localizzazione di lncRNA di interesse e l'efficienza delle sonde progettate.

Durante la lisi delle cellule, la cromatina è rilasciata nel lisato e aumenta la viscosità; è quindi necessario per triturare la cromatina di sonicazione per aumentare la fluidità dei campioni e quindi facilitare l'accessibilità dell'oligonucleotide sonde per il lncRNA di interesse. Tuttavia, sonicazione sarà anche distruggere il RNAs Estratto con il lncRNA di interesse. È quindi importante ridurre al minimo il tempo di sonicazione in modo tale che mentre in modo efficiente riduce la viscosità del lisato, inoltre permette che l'ottenimento di RNA frammenti con una lunghezza compresa tra 200-800 BP. nota che il tempo di sonicazione sarà altamente dipendono sia la quantità e il tipo di tessuto o cellule coltivate utilizzate.

In conclusione, la procedura qui descritta consente in 2-3 giorni di acquisire i bersagli di RNA di un lncRNA desiderato. Accoppiato con RT-qPCR, questi metodi verranno permetterà alla ricerca di un'associazione specifica e il regolamento di un mRNA del lncRNA desiderato come un approccio del candidato. Per un approccio di genoma, esperimenti di discesa del RNA possono essere analizzati dall'alto-rendimento del RNA-16s consentendo il recupero di tutti gli RNA associati con il lncRNA desiderato. Qualunque sia la strategia analitica scelta, la procedura di discesa del RNA dovrebbe fornire nuove conoscenze significative sul regolamento di RNA da lncRNAs.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicatore
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Perle di streptavidina magnetica
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026
Apparecchio per elettroforesi su gel	Advance	Mupid-One	Apparecchio per elettroforesi su gel
Proteinasi K	Sigma	P2308
Kit di purificazione dell'RNA XS	Macherey-Nagel	Kit	purificazione dell'RNA
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	Inibitore dell'RNAsi
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	Tubo di purificazione
Rotatore	Stuart	SB2	Rotatore del tubo Eppendorf
RNA a DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse kit di trascrizione
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad		1725124 reagente qPCR
Applicato 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	qPCR
Kit di preparazione del campione mRNA a filamenti Illumina TruSeq	costruzione della libreria di DNA	Illumina	20020594
Sistema NGS	Illumina NextSeq 500	Illumina	SY-415-1002