Articolo metodologico

Un modello murino di ostruzione intestinale parziale

DOI:

10.3791/57381

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5 marzo 2018

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1Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology, Wonkwang Digestive Disease Research Institute and Institute of Wonkwang Medical Science, School of Medicine, Wonkwang University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Ostruzioni intestinali sono un blocco parziale o totale dell'intestino che può causare dolore addominale, nausea, vomito e impedendo il passaggio delle feci. Questa procedura per la creazione di intestinale parziale ha pilastri in topi è affidabile a studiare i meccanismi alla base di crescita delle cellule patologiche e morte nell'intestino.

Abstract

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Ostruzioni intestinali, che ostacolare o bloccano il movimento peristaltico, possono essere causati da aderenze addominali e più gastrointestinale (GI) malattie tra cui escrescenze tumorali. Tuttavia, il cellulare che ritocca meccanismi coinvolti nella, e causato da, ostruzioni intestinali sono capiti male. Sono stati sviluppati diversi modelli animali di ostruzioni intestinali, ma il modello del mouse è più costo/tempo efficace. Il modello del mouse utilizza l'impianto chirurgico di un'ostruzione intestinale parziale (PO) che ha un alto tasso di mortalità se non viene eseguita correttamente. Inoltre, topi che riceve la chirurgia PO non riescono a sviluppare ipertrofia se un adeguato blocco non viene utilizzato o non correttamente inserito. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la chirurgia di PO che produce ostruzioni intestinali affidabili e riproducibili con un tasso di mortalità molto bassa. Questo protocollo utilizza un anello di silicone chirurgicamente posizionati che circonda l'ileo che blocca parzialmente movimento digestivo nell'intestino tenue. Il blocco parziale rende l'intestino diventa dilatato a causa l'arresto del movimento digestivo. La dilatazione dell'intestino induce l'ipertrofia del muscolo liscio sul lato orale dell'anello che progressivamente si sviluppa più di 2 settimane fino a quando non causa la morte. Il modello di mouse PO chirurgico offre un modello in vivo di ipertrofico tessuto intestinale utile per lo studio delle mutazioni patologiche delle cellule intestinali, compreso le cellule muscolari lisce (SMC), cellule interstiziali di Cajal (ICC), PDGFRα+e di un neurone cellule durante lo sviluppo dell'ostruzione intestinale.

Introduzione

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Ostruzioni intestinali sono un blocco parziale o totale nell'intestino piccolo o grande che impedisce il movimento attraverso l' intestino1di cibo digerito, fluidi e gas. Dovuto l'ostruzione, il blocco induce le pareti intestinali per diventare ispessito, restringimento del lume2. Ostruzione intestinale può verificarsi a seguito di interventi chirurgici addominali o pelvici che causano la formazione di tessuto di aderenze addominali o da disturbi GI quali diverticolite, volvolo, Ernie, malattie infiammatorie croniche intestinali (morbo di Crohn), stenosi, invaginazione intestinale, stipsi, fecaloma, pseudo-ostruzione, cancri e tumori3,4,5. Ostruzioni intestinali in questi casi spesso portano all'ipertrofia della tunica fibre del intestino6.

PO del lume induce distensione intestinale e aumenta di spessore dello strato di muscolo liscio intorno l'ostruzione in risposta alla necessità di continuare la peristalsi funzionale7,8,9,10, 11,12,13. Modelli animali di PO intestinale sono stati sviluppati per studiare l'ipertrofia del muscolo liscio in topi7, ratti10, cavie11, cani12e gatti13 che costantemente sviluppare ipertrofia simile entro il strati di muscolatura intestinale.

Un modello murino di PO intestinale è il modo più efficace per generare e studiare ostruzioni intestinali in vivo. Ostruzioni del piccolo intestino sono effettuati nei topi utilizzando un anello di silicone inserito chirurgicamente che circondano l'ileo. I topi di PO hanno mostrato un aumento iniziale del numero di cellule (iperplasia) e un aumento in spessore di strato del muscolo (ipertrofia) dopo PO chirurgia8,15. SMC sono le cellule primarie di plastica che stanno crescendo all'interno strati di muscolo liscio in risposta alle condizioni ipertrofica14, ma altre cellule come ICC e le cellule PDGFRα+ che sono strettamente associati con SMC, inoltre vengono ripopolati. Precedentemente abbiamo riferito che i topi PO sviluppano ipertrofia nel piccolo intestino, in cui SMC sono dedifferenziate nelle cellule PDGFRα+ che sono altamente proliferative7,15,16. Al contrario, ICC sono degenerati e perso all'interno degli strati di muscolo liscio ipertrofico durante lo sviluppo di obsruction intestinale7. Un altro vantaggio importante del modello PO è la sua capacità di indurre i cambiamenti nel sistema nervoso enterico e propagare neurogene schemi motori. La propagazione principali modello neurogeno motore nelle piccole viscere del mouse è il complesso motore migrazione (MMC), che è neurogena e non necessita di ICC o elettrico onde lente17. Il modello PO può fornire chiare intuizioni come MMCs e nervi enterici sono stato rimodernati da ostruzione parziale.

Qui, vi proponiamo un protocollo murino per chirurgia intestinale PO utilizzando un anello di silicone. Topi che riceve la chirurgia PO attendibilmente producono ipertrofia in tunica fibre di piccolo intestino. All'interno del muscolo ipertrofico, SMC, ICC, PDGFRα+e cellule neuronali sono notevolmente ristrutturate.

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Protocollo

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Il seguente protocollo è stato approvato dal istituzionale Animal Care e utilizzare Committee (IACUC) presso l'Università del Nevada-Reno (UNR) animale risorse ed è conforme a tutti gli orientamenti etici istituzionali per quanto riguarda l'uso di animali di ricerca.

1. gli animali.

  1. Ottenere topi C57BL/6 maturo (4-6 settimane) peso compreso tra 20-30 g. House la colonia di topi di laboratorio in una struttura centralizzata animale alle risorse animali UNR.

2. parziale ostruzione chirurgia

Nota: Interventi sono eseguiti in una sala dedicata alle procedure chirurgiche. Tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento. Guanti e camici chirurgici sterili devono essere indossati per tutto il personale nella sala chirurgica in ogni momento.

  1. Preparazione per il mouse chirurgico
    1. Controllare il sistema di consegna anestetico per garantire l'approvvigionamento di ossigeno e isoflurano è adeguata per la procedura. Attivare la fornitura di ossigeno. Accendere il misuratore di portata gas e regolare a 500-1000 mL/min posto l'animale nella camera di induzione e sigillare la parte superiore.
    2. Accendere il vaporizzatore di isoflurane al 5% e monitorare l'animale fino a quando diventa recumbent. Passare il sistema di consegna anestetico per il cono di naso.
    3. Lavare la camera di induzione di qualsiasi residuo di gas con l'ossigeno, quindi disattivare la linea di camera di induzione, mantenendo la linea del naso a cono aperto.
    4. Rimuovere l'animale dalla camera e con attenzione unguento oftalmico sugli occhi dell'animale.
    5. Inserire il cono di naso su un pad caldo preriscaldato quando gas continua a fluire.
    6. Modificare il flusso di ossigeno a 100-200 mL/min, con 2-3% isoflurane. Se l'animale comincia a muoversi, gentlyrestrain l'animale con il cono di naso su fino al completamente anestetizzato nuovamente.
    7. Monitorare la respirazione e la risposta alla stimolazione durante la procedura e regolare la percentuale di isoflurane (2-5%), se necessario. Livello animale amputate viene monitorato dalla mancanza di riflesso pizzico punta prima che l'ambulatorio è effettuato.
    8. Iniettare la medicina del dolore (buprenorfina, 1 µ g/g di peso corporeo) intraperitonealmente lontano dal sito di incisione.
    9. Applicare la lozione di rimozione dei capelli sull'addome con un batuffolo di cotone pulito. Lasciare il sit di lozione per 3-5 min sul mouse, quindi rimuovere i capelli utilizzando tamponi di garza e cotone. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti i capelli sono stato rimosso dall'addome del mouse.
    10. Pulire la pelle con etanolo al 70% utilizzando tamponi di garza e cotone. Applicare la soluzione swabsticks o povidone-iodio per pulire l'addome.
  2. Chirurgia di ostruzione parziale
    1. Drappo il sito chirurgico utilizzando carta sterile 25 x 50 cm con un 2,5 x 2,5 cm apertura centrale per l'area di chirurgia. Fissare il telo all'animale inserendo strisce sterile ai confini dell'apertura e della pelle.
    2. Fare un'incisione addominale di ~3.0 cm longitudinalmente usando un bisturi a lama n ° 15, garantendo che solo la pelle è incisa ed evitando il taglio nello strato musculoperitoneal in questo momento.
    3. Utilizzo di pinze e forbici chirurgiche, separare con cura la pelle dallo strato musculoperitoneal senza causare qualsiasi incisione al livello musculoperitoneal. Dopo gli strati sono stati sufficientemente separati (circa 1 cm x 4 cm), identificare la linea alba sul layer musculoperitoneal e taglio ~ 2 cm lungo la linea alba per esporre la cavità intraperitoneale utilizzando micro-pinze e le forbici.
    4. Accuratamente di individuare e identificare l'intestino cieco. Lentamente e delicatamente rimuovere l'intestino cieco dalla cavità intraperitoneale con micro-forcipe, portando colon prossimale e dell'ileo con il cieco all'esterno sul telo sterile. Immediatamente inumidire il tessuto intestinale con garza imbevuta salina sterile 0,9% e mantenere il tessuto esposto inumidito in ogni momento, mentre si trovano all'esterno della cavità addominale.
    5. Individuare e identificare il mesentere tra l'ileo e del colon prossimale. Fare un'incisione (~ 1 cm) parallela e appena sotto, l'ileo, nel mesentery ed evitare di tagliare qualsiasi sistema vascolare.
    6. Prendere un anello di silicone in autoclave (6 mm di lunghezza, 4 mm di diametro esterno, diametro interno 3,5 mm). Tagliare longitudinalmente per aprire il tubo e l'anello con micro-forcipe.
    7. Inserire un'estremità dell'anello aperto attraverso l'incisione nel tessuto del mesentery. Restituire l'anello a forma di anello completato portando un'estremità in contatto con un altro, con l'ileo circondato dall'anello.
    8. Assicurarsi che l'anello di silicone circonda completamente l'ileo, chiudere l'anello con sutura e posizionare con cura gli intestini indietro nella cavità intraperitoneale.
  3. Chiusura di chirurgia
    1. Eseguire un semplice sutura continua sul livello musculoperitoneal lungo la linea alba per chiudere il musculoperitoneal della ferita con una sutura assorbibile. Dopo la sutura è completa, togliere qualsiasi sanguinamento con 0,9% soluzione salina sterile imbevuto di garza.
    2. Per chiudere completamente la ferita, con una sutura in nylon separata, è necessario eseguire una semplice sutura continua sulla pelle.
    3. Al termine di entrambe le suture, pulire la ferita con nuovo swabstick o povidone-iodio.
    4. Intraperitonealmente iniettare antibiotici (gentamicina, 150 μL per topo basato sul peso corporeo di 20-30 g).
    5. Dopo il completamento della procedura, spegnere il vaporizzatore di isoflurano e permettere all'animale di respirare solo fluire ossigeno fino a quando iniziare a guadagnare la coscienza.
    6. Una volta che l'animale è sveglio, metti l'animale in una zona di recupero separato con supporto termico fino a completamente recuperato.

3. post-operazione osservazione.

  1. Dopo il completamento della chirurgia, spostare gli animali in un'incubatrice in una stanza di recupero dove temperatura e umidità è regolamentate. Monitorare gli animali postoperatorio ogni 15 min per la prima ora poi ogni 30 minuti per la seconda ora, mentre gli animali sono in incubatrice.
  2. Appena l'osservazione prescritto è completo, spostare gli animali alla propria gabbia individuale e monitorarli tutti i giorni per indicazioni cliniche di dolore18e per garantire che la ferita chirurgica è la guarigione correttamente senza segni di complicazioni ( deiscenza) presenti.

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Risultati

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L'ostruzione parziale (PO) è stata chirurgicamente indotta nei topi un mesi di vita inserendo un anello di silicone intorno l'ileo vicino allo sfintere ileocecale. Questo anello creato un blocco parziale nell'ileo. Le operazioni di intervento Sham (modo) inoltre sono stati effettuati senza un anello sul età/sesso abbinato topi e questi topi non hanno mostrato sintomi simili a quelli trovati nei topi del PO. Topi, rapidamente recupero da un intervento chirurgico PO entro poche ore. Essi no...

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Discussione

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Abbiamo dimostrato che i topi che ricevono la chirurgia intestinale PO costantemente e riproducibile sviluppano ipertrofia della muscolatura liscia intestinale, che imita l'ostruzione intestinale umano. Ambulatori di ostruzione intestinale sono stati sviluppati per i diversi animali, tra cui7di topi, ratti10, cavie11, cane12 e gatti13. Il modello del mouse dell'ostruzione intestinale ha tempo, costo, di...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrei ringraziare Benjamin J Weigler, D.V.M., pH.d. e Walt Mandeville, D.V.M (risorse animali & Campus frequentando veterinario, University of Nevada, Reno) per i loro servizi animale eccellente fornito per i topi, come pure la loro consiglio su procedure chirurgiche.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Telo chirurgicoForniture mediche e veterinarieSMS4040" X100 iarde
Underpad, econ, pro plusForniture mediche e veterinarieMSC28122417x24"
Forbici per irideBraintree scientific, IncSC-i-130
Forbici per irideVantageV95-304
Pinzette elettroniche e per gioiellieri Dumont98-180-3
Sutura riassorbibile intrecciataCovidien polisorbSL-5687G5-0, poliglactin
Nylon monofilamento non assorbibileAD chirurgicoS-N618R136-0, nylon
Lama chirurgicaDynarexNo.15
Porta aghiJacobson microvascolare36-1342TC8,5 pollici
Manico per bisturiFlinn scientificAB1049
Forbice microchirurgicaWPI503305
Unguento oftalmico PetrolatumPuralube VET3,5 g
Fluriso (isoflurano)VetoneV1 502017250 ml
Steri-strip chiusura pelle rinforzata3MR1547
Guanti chirurgiciMedlineMSG2270
Maschera facciale ad anello per le orecchieLa zona di sicurezzaRS700
Avant garza spugne non tessute CaringPRM25444
Tazza chirurgicaAdmiral  craft OYC-2725-A422,5 once
di SwabstickChloraPrep2601032% con clorexidina  Gluconato (CHG) e 70% v/v alcool isopropilico (IPA)Applicatore
punta in cotonePuritan806-WC
BuprenorfinaZoo pharmBZ80693171 mg/ml
Gentamicina solfatoVetoneG-6336-04100 mg/ml
Crema gel ad azione rapidaVeet8111002
SiringaAHSAH01T25161 ml con ago
Anello in siliconeVWR60985-720mm di lunghezza, diametro esterno 4 mm, diametro interno 3,5 mm
Topi C57BL/6The Jackson Laboratory4-6 settimane
con 6

Riferimenti

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