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Articolo metodologico

Uso pratico di interferenza del RNA: consegna orale del RNA Double-stranded in elementi portanti di liposomi per scarafaggi

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DOI:

10.3791/57385

⸱

1 maggio 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto viene illustrato lo svuotamento dell'espressione genica in midgut il tedesco scarafaggio attraverso ingestione orale di RNA double-stranded incapsulato in liposomi.

Abstract

Interferenza del RNA (RNAi) è stato ampiamente applicato per scoprire le funzioni biologiche di numerosi geni ed è stata prevista come un parassita controllo strumento operativo tramite rottura di espressione genica essenziale. Sebbene diversi metodi, come l'iniezione, alimentazione e ammollo, sono stati segnalati per il recapito corretto del RNA double-stranded (dsRNA), l'efficienza di RNAi attraverso la consegna orale di dsRNA è altamente variabile tra i diversi gruppi degli insetti. Il tedesco scarafaggio, Blattella germanica, è altamente sensibile all'iniezione del dsRNA, come dimostrato da numerosi studi pubblicati in precedenza. Il presente studio descrive un metodo per dimostrare che il dsRNA incapsulato con vettori liposoma è sufficiente per ritardare la degradazione di dsRNA dal succo del midgut. In particolare, l'alimentazione in continuo di dsRNA incapsulato da liposomi significativamente riduce l'espressione di tubulina in midgut e ha portato alla morte di scarafaggi. In conclusione, la formulazione e l'utilizzo di dsRNA lipoplessi, che proteggono il dsRNA contro nucleasi, potrebbe essere in futuro un uso pratico di RNAi per controllo dei parassiti dell'insetto.

Introduzione

RNAi è stato dimostrato come un metodo efficace per l'espressione genica atterramento attraverso un meccanismo di silenziamento post-trascrizionale via innescato da molecole di dsRNA in molti eucarioti1. Nell'ultimo decennio di studi, RNAi è diventata uno strumento utile per studiare le funzioni dei geni dallo sviluppo di comportamento che riducono l'espressione di specifici geni tramite iniezione e/o alimentazione di dsRNA in vari taxa di insetti2,3. A causa della specificità e robustezza dell'effetto di svuotamento, l'applicazione di RNAi è attualmente considerato come una strategia potenziale per pest control gestione4,5. Tuttavia, l'efficienza di RNAi varia ampiamente tra specie di insetti, a seconda di diversi geni presi di mira e i metodi di consegna. Un corpo crescente di prova suggerisce che l'instabilità del dsRNA, che è stato degradato dalla ribonucleasi, è un fattore critico per la limitata efficacia della RNAi5,6. Per esempio, la bassa sensibilità di RNAi in Manduca sexta è stata spiegata dal fatto che il dsRNA mescolato con l'emolinfa è stato rapidamente degradato entro 1 ora7. Allo stesso modo, la presenza di nucleasi alcaline in midgut, che degradano in modo efficiente dsRNA ingerito, è fortemente correlata con bassa efficienza di RNAi in diversi ordini di insetti8,9,10.

La somministrazione orale di dsRNA è particolarmente interessante per l'applicazione del RNAi in una strategia di controllo dei parassiti, ma un metodo per ritardare la degradazione di dsRNA di nucleasi a midgut non è ancora stato sviluppato, che avrebbe il potenziale per garantire un efficace RNAi attraverso l'alimentazione. Tuttavia, il problema del blocco di RNAi per consegna orale di dsRNA è stato segnalato dalla grande quantità di dsRNA, ad es. 50 µ g in Bombyx mori, o alimentazione alimentazione continuamente per 8 giorni (8 µ g dsRNA in totale) nelle specie di locusta. Il tedesco scarafaggio, germinica di Blattella, è altamente sensibile alla RNAi tramite l'iniezione del dsRNA11,12,13,14, ma non è rispondente a dsRNA attraverso l'alimentazione. Recentemente, Lin et al. (2017) hanno dimostrato che il dsRNA incapsulato con risultati di vettori liposomi in successo RNAi per atterramento l'espressione genica α-tubulina nella mortalità significativa del midgut e trigger del tedesco scarafaggio15. Come la degradazione di dsRNA in midgut è il fattore limitante per RNAi orale, i vettori di liposomi servono come veicolo di proteggere dsRNA dalla degradazione, che è facilmente applicabile in altri insetti con le attività della nucleasi forte nell'intestino. Della nota, la ragione per la scelta del reagente di transfezione particolare (Vedi Tabella materiali) abbiamo usato come vettore di liposomi nel protocollo attuale è che è stato testato per la transfezione di cellule di insetto linea con meno tossicità, secondo la istruzioni del produttore. Secondo il confronto dei sistemi di transfezione diversi liposoma Gharavi et al. (2013) 16, l'efficienza di trasfezione Short interfering RNA (siRNA) è circa la stessa tra questo e altri sistemi disponibili in commercio che sono stati utilizzati per sistemi di dsRNA in altri insetti17,18 . Inoltre, il nostro metodo di alimentazione sia abbastanza attento a garantire la corretta quantità di dsRNA è ingerita da ogni scarafaggio, e che i risultati siano robusti e confermato. In sintesi, il presente protocollo e i risultati dimostrano che utilizzando dsRNA lipoplessi migliora la stabilità di dsRNA e apre la porta alla progettazione della consegna orale strategia di RNAi, che è un approccio promettente per controllo dei parassiti in futuro.

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Protocollo

1. sintesi e preparazione di dsRNA

  1. Identificare i siti di destinazione di dsRNA nella regione 3' non tradotta dei geni bersaglio. La dsTub è utilizzato per il targeting il gene α-tubulina (tub) (numero di accessione GenBank: KX228233), e dsEGFP come un controllo negativo dsRNA è progettato dalla sequenza di intensificare la proteina fluorescenza verde (EGFP; Numero di accessione GenBank: LC311024).
  2. Eseguire l'amplificazione di PCR standard per sintetizzare i modelli di dsRNA con gli iniettori di gene-specific contenente la sequenza del promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Le condizioni di amplificazione di PCR e informazioni sul primer utilizzati sono quelli segnalati da Lin et al. (2017) 12 (Vedi Tabella materiali).
  3. Procedere con la preparazione di dsRNA utilizzando una trascrizione di T7 Kit (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
    Nota: Resa elevata quantità dsRNA, mescolare due reazioni in un tubo (in totale 40 µ l) e incubare a 37 ° C durante la notte.
  4. Aggiungere 2 µ l di dnasi (Vedi Tabella materiali) in campioni di dsRNA per 15 min a 37 ° C per modelli del DNA del digest.
  5. Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione (Vedi Tabella materiali) e cloroformio 40 µ l, poi vortice.
  6. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi raccogliere il surnatante (150 µ l) in un nuovo tubo del microcentrifuge.
  7. Precipitare dsRNA aggiungendo 150 µ l isopropanolo e incubare per 15 minuti in ghiaccio.
  8. Centrifugare per 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% per lavare dsRNA pellet. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
  10. Rimuovere l'etanolo e ripetere le fasi di lavaggio di etanolo.
  11. Rimuovere l'etanolo e asciutto dsRNA pellet da concentratori centrifughi vuoto per 3 min, quindi risospendere dsRNA con acqua RNAsi-libera.
  12. Determinare la quantità del dsRNA purificato utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore e regolare fino alla concentrazione desiderata (ad es., 0,25 µ g / µ l per la preparazione di dsRNA lipoplessi).
  13. Conservare i campioni di dsRNA a-20 ° C fino a 3 mesi.

2. preparazione del dsRNA lipoplessi

  1. Diluire 4 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) aggiungendo 4 µ l di soluzione glucosata al 5%. Diluire 4 µ l di dsRNA (1 µ g) aggiungendo 4 µ l di soluzione glucosata al 5%.
  2. Aggiungere la soluzione di reagente liposoma diluito immediatamente nella soluzione diluita dsRNA tutti in una volta. Vortice brevemente per mescolarli, quindi incubare per 15 minuti a 25 ° C.
    Nota: Non mescolare le soluzioni nell'ordine inverso.
  3. I dsRNA lipoplessi sono pronti all'uso. Usare entro 1 ora di preparazione e scartare dopo 1 ora.
    Nota: Secondo le istruzioni del produttore, il lipoplessi dovrebbero essere usato appena possibile.

3. raccolta di enzimi extracellulari dall'emolinfa e succo del Midgut

  1. Insetto buffer saline (stock x 10)
    1. Mescolare 900 mL acqua distillata doppia con 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2e 8,3 g MgCl2·6H2O.
    2. Aggiustare il pH a 6,8 e riempire fino a 1.000 mL.
  2. Collezione di emolinfa
    1. Anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio fino a quando non si muovono per 3 min.
    2. Tenere lo scarafaggio con due dita (pollice e indice) e alzare il lato ventrale del scarafaggio.
    3. Utilizzare le forbici per dissezione per tagliare fuori la punta di una coxa di una gamba posteriore.
      Nota: Tagliare l'intersezione collegato tra la coxa e il trocantere. L'asportazione della parte del coxa era meno efficiente per raccogliere l'emolinfa.
    4. Spremere l'addome delicatamente con il dito medio e raccogliere l'emolinfa sanguinamento dall'incisione con una micropipetta 10 µ l.
    5. Piscina l'emolinfa da scarafaggi (5 persone) in un tubo del microcentrifuge.
      Nota: Mantenere le provette microcentrifuga sul ghiaccio per prevenire melanizzazione. Il volume medio di emolinfa ottenuto da uno scarafaggio maschio è 2-3 µ l.
    6. Rotazione verso il basso l'emolinfa brevemente con una centrifuga da banco per 10 s.
    7. Trasferire il volume desiderato di emolinfa (vale a dire, 10 µ l) e mescolare con 50 µ l di tampone salino insetto 1x.
    8. Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a 4 ° C a girare giù emociti. Trasferire il surnatante in una provetta pulita microcentrifuga.
    9. Quantificare la concentrazione di proteine totali utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume misurando A28015.
    10. Regolare ogni campione per avere la stessa concentrazione di proteina (6 mg / µ l di proteina totale).
  3. Raccolta di succo del midgut
    1. Anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio. Sistemare gli scarafaggi lato ventrale sulla piastra di dissezione con freddo 1x insetto Salina buffer mediante spilli entomologici.
    2. Sezionare l'addome con una pinzetta bene. Rimuovere l'intestino intero (compreso l'intestino anteriore, media e posteriore) per un piatto fresco con 1 x insetto tampone salino.
    3. Rimuovere l'intestino anteriore e posteriore e di trasferire velocemente midgut ad un tubo del microcentrifuge che contiene 100 µ l di tampone salino dell'insetto.
    4. Piscina l'intestino da sei scarafaggi nel tubo stesso e vortexare per 10 s.
    5. Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a 4 ° C per rallentare gli emociti e tessuti di intestino. Trasferire il surnatante in una provetta pulita microcentrifuga.
    6. Quantificare la concentrazione di proteine totali utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume misurando A28015.
    7. Regolare ogni campione per avere la stessa concentrazione di proteina (6 mg / µ l di proteina totale).

4. dsRNA degradazione Assay

  1. Appena preparare 4 µ l del dsRNA nudo o lipoplessi dsRNA (1 µ g).
  2. Mescolare il succo di dsRNA enzimi di soluzioni con 10 µ l di tampone salino dell'insetto (controllo), estratti dall'emolinfa, o del midgut.
  3. Aggiungere 2 µ l di EGTA (20 mM) o acqua RNAsi-libera per separare campioni come controlli per inibizione delle attività enzimatiche.
  4. Incubare per 1 ora o più a lungo (6, 12 o 24 ore) a 25 ° C.
  5. Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione e cloroformio 40 µ l, poi vortice.
  6. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi raccogliere il surnatante (150 µ l) in un nuovo tubo del microcentrifuge.
  7. Precipitare dsRNA aggiungendo 150 µ l isopropanolo e incubare per 15 minuti in ghiaccio.
  8. Centrifugare per 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% per lavare dsRNA pellet. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
  10. Rimuovere l'etanolo e ripetere le fasi di lavaggio di etanolo.
  11. Rimuovere l'etanolo e asciutto dsRNA pellet da concentratori centrifughi vuoto per 3 min. Risospendere dsRNA con acqua RNAsi-libera di 10 µ l.
  12. Verificare l'integrità del dsRNA Trattato tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%.

5. la somministrazione orale di dsRNA

  1. Mantenere gli scarafaggi su una dieta ad libitum di cibo secco (chow cane). Privare l'approvvigionamento idrico dagli scarafaggi un giorno prima gli esperimenti di ingestione di dsRNA.
  2. Tenere uno scarafaggio afferrando le ali con le pinze flessibili (Figura 1, punto 5).
    Nota: Non afferrare le parti del corpo di scarafaggi.
  3. Preparare il dsRNA lipoplessi, come pure di dsRNA nuda, per l'alimentazione, come descritto nella sezione 2.
    Nota: Il dsRNA lipoplessi devono essere preparata fresca prima della poppata.
  4. Alimentazione 4 µ l di dsRNA lipoplessi o nudo dsRNA (250 ng) con una micropipetta.
  5. Lentamente dispensare la goccia della soluzione dsRNA vicino all'apparato boccale di scarafaggi e lasciare che gli scarafaggi ingerire la goccia completamente.
  6. Eseguire gli esperimenti di ingestione due volte al giorno (1 h dopo luci su e 1 h prima luci spente) per 8 giorni o 16 giorni di continuo.
    Nota: Tutte le blatte acquisito acqua solo tramite alimentazione manuale con reagenti soluzione o controllo di dsRNA (ad es., acqua gratuita nucleasi, soluzione di glucosio e reagente liposoma) durante gli esperimenti di ingestione.
  7. Fornire bottiglie d'acqua per gli scarafaggi dopo 16 giorni di ingestione di dsRNA esperimenti.

6. valutare atterramento

  1. Al momento scelto punti (2, 9 e 17 giorni dopo il test di ingestione di dsRNA), raccogliere gli insetti dsEGFP - e dsTub-trattati e sezionare i tessuti selezionati (per esempio, del midgut).
  2. Eseguire PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Le condizioni di amplificazione qRT-PCR e informazioni sul primer come riportato da Lin et al. (2017) 12.
  3. Valutare il controllo e il dsRNA-Trattato insetti ogni giorno per controllare la mortalità e rimuovere gli scarafaggi che sono più in movimento.

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Risultati

Uno schema semplificato del protocollo per la somministrazione orale di dsRNA è presentato nella Figura 1, dove sono mostrati i passaggi chiave per la preparazione di dsRNA lipoplessi.

Al fine di indagare la protezione fornita dai vettori liposomi al degrado di dsRNA nel succo del midgut di b. germanica, un'analisi ex vivo in cui si svolse la dsTub lipoplessi sono state incubate co...

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Discussione

Questo protocollo presenta un metodo per RNAi efficace attraverso la consegna orale di dsRNA lipoplessi, che comprende la protezione contro la digestione di ribonucleasi nel succo del midgut il tedesco scarafaggio. Come dimostrato in altri studi in varie specie di insetti, l'effetto di RNAi povero attraverso la consegna orale di dsRNA è rappresentato principalmente dalla degradazione di dsRNA8,9,10. Questo protocollo produce lip...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Taiwan (Ministero della scienza e della tecnologia, più 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 a H.J.L.), Repubblica Ceca (concedere Università Agenzia della Boemia meridionale, GAJU concedere 065/2017/P a Y.H.L) e Spagna ( Ministero spagnolo dell'economia e della competitività, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e il governo catalano, concedere 2014 SGR 619 a X.B.); ha inoltre ricevuto il sostegno finanziario del Fondo europeo economica e lo sviluppo regionale (fondi FEDER a X.B.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
GenJe Plus DNA in vitro Reagente di trasfezioneSignaGenSL100499per la preparazione di lipoplessi
Blend Taq plusTOYOBO BTQ-201per PCR
Fast SYBR Green Master MixABI4385612per qPCR
FirstChoice RLM-RACE KitInvitrogenAM1700per identificazione UTR 3' 
Kit di trascrizione MEGAscript T7InvitrogenAMB13345per la sintesi di dsRNA
TURBO DNaseInvitrogenAM2239rimuove il modello di DNA dal dsRNA
TRIzolInvitrogen15596018 per l'estrazionedi dsRNA o RNA
totale RQ1 Dnase Promega M6101 senza RNasirimuove il modello di DNA dall'RNA totale 
cloroformio Sigma-AldrichC2432per l'estrazione di dsRNA o RNA totale
2-propanoloSigma-AldrichI9516per l'estrazione di dsRNA o RNA totale
etanoloSigma-Aldrich24102per l'estrazione di dsRNA o RNA totale
Dietil pirocarbonato, DEPCSigma-AldrichD5758per la preparazione di acqua senza RNasi
soluzione di glucosioSigma-AldrichG3285per la preparazione di lipoplex
Cloruro di sodio, NaClSigma-AldrichS7653formula del tampone salino per insetti
Cloruro di potassio, KClSigma-AldrichP9333formula del tampone salino per insetti
Cloruro di calcio, CaCl2Sigma-AldrichC1016formula
del tampone salino per insettiCloruro di magnesio esaidrato, MgCl2.6H2OSigma-AldrichM2670soluzione salina per insetti formula
EGTA Inibitore dell'enzimaSigma-AldrichE3889
forbice da dissezioneF.S.T.per dissezione di scarafaggi
F.S.T.per dissezione di scarafaggi
F.S.T.possesso di scarafaggi 
pipetmanRAININP10
provetta per microcentrifugaAxygenMCT175C, PCR02Cper preparazione dei campioni
 Axygenpreparazione campioni
vortexterDigisystemvm1000preparazione campioni
Minispin centrifugaThe Gruffin GroupGMC 206per spin down di liquidi 
CentrifugaALCPK121RpHmetro per preparazione campioni
 JENCO6071per la regolazione del pH
QuawellQ3000PCR quantitativa dell'acido nucleico
TermociclatoreABI 2720per PCR stampo o  incubazione della sintesi di dsRNA 
PCR quantitativa in tempo realeABI StepOne pluscentrifughi sottovuoto quantitativi di espressione
genicaeppendorf5301per estrazione di dsRNA o RNA totale
Multipette eppendorfxstreamper il caricamento di campioni PCR in tempo reale 
Agarosio Iamresco0710per elettroforesi dell'acido nucleico
tub gene specfifc forward preimertri-I biotechGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimertri-I biotechTCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTub modello primer inversotri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP modello preimer forwardtri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template reverse preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primertri-I biotechGGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR reverse preimertri-I biotechCCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR primer direttotri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimertri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G
pinzetta pinzetta flessibile per preparazione dei campioni punta per pipetta per spettrofotometro a micro-volume concentratori

Riferimenti

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