Qui presentiamo un metodo sperimentale per testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico.
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Articolo metodologico
Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Plasmidi multicopia sono estremamente abbondanti nei procarioti, ma il loro ruolo nell'evoluzione batterica rimane capita male. Recentemente abbiamo dimostrato che l'aumento nel numero di copia del gene per cellula fornito dai plasmidi multicopia potrebbe accelerare l'evoluzione dei geni del plasmide-codificati. In questo lavoro, vi presentiamo un sistema sperimentale per testare la capacità di plasmidi multicopia di promuovere l'evoluzione. Utilizzando metodi di biologia molecolare semplice, abbiamo costruito un sistema di modello dove un gene di resistenza agli antibiotici può essere inserito in Escherichia coli MG1655, il cromosoma o su un plasmide multicopia. Usiamo un approccio sperimentale evoluzione di propagare i diversi ceppi sotto aumento delle concentrazioni di antibiotici e misuriamo la sopravvivenza delle popolazioni batteriche nel corso del tempo. La scelta della molecola antibiotica e il gene di resistenza è quindi che il gene solo può conferire resistenza attraverso l'acquisizione di mutazioni. Questo approccio "evolutivo salvataggio" fornisce un metodo semplice per verificare il potenziale dei plasmidi multicopia per promuovere l'acquisizione della resistenza agli antibiotico. Nel passaggio successivo del sistema sperimentale, le basi molecolari della resistenza agli antibiotico sono caratterizzate. Per identificare le mutazioni responsabili dell'acquisizione della resistenza agli antibiotico usiamo profonda sequenziamento del DNA dei campioni ottenuti da cloni e intere popolazioni. Infine, per confermare il ruolo delle mutazioni del gene sotto studio, ricostruirli in background parentale e testare il fenotipo di resistenza dei ceppi risultante.
Introduzione
Resistenza agli antibiotici nei batteri è un problema di salute importante1. A un livello fondamentale, la diffusione della resistenza agli antibiotico nei batteri patogeni è un semplice esempio dell'evoluzione attraverso la selezione naturale2,3. In parole povere, l'uso di antibiotici genera la selezione di ceppi resistenti. Un problema chiave nella biologia evolutiva, pertanto, è di comprendere i fattori che influenzano la capacità delle popolazioni batteriche di evolvere la resistenza agli antibiotici. Esperimenti di selezione sono emerse come uno strumento molto potente per studiare....
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Protocollo
1. costruzione dell'apparato sperimentale, codifica il Gene di resistenza agli antibiotici
Nota: Qui MG1655 di e. coli è stato usato come il ceppo destinatario del gene di resistenza antibiotica plasmide o cromosoma-codificati. Il gene di resistenza agli antibiotici è codificato in cromosoma o un plasmide multicopia in un ceppo altrimenti isogeniche (Figura 1).
-
Inserimento del gene di resistenza agli antibiotici a λ dei fagi integrazione sito (attB)20 del cromosoma di MG1655.
- Amplificare 500 bp-lungo regioni su entrambi i lati del s....
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Risultati
Nel nostro lavoro precedente, è stata studiata l'evoluzione del β-lactamase gene blaTEM-1 verso che conferiscono resistenza alla terza generazione cefalosporina ceftazidime12 . Questo gene è stato scelto perché, anche se TEM-1 non conferisce resistenza a ceftazidime, mutazioni nel blaTEM-1 possono ampliare la gamma di attività di TEM-1 per idrolizzare cefalosporine come ceftazidime29. Le mutazioni in e.......
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Discussione
Vi presentiamo un nuovo protocollo che unisce la biologia molecolare, evoluzione sperimentale e sequenziamento del DNA profondo destinato per studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico nei batteri. Sebbene questo protocollo combina tecniche provenienti da diversi campi, tutti i metodi necessari per svilupparlo sono semplici e possono essere eseguiti in un laboratorio di microbiologia regolari. I passaggi più critici nel protocollo sono probabilmente la costruzione di ceppi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I + D + io 2013-2016): concede CP15-00012, PI16-00860 e CIBER (CB06/02/0053), co-finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale ' un modo per raggiungere l'Europa ' (FESR). JAE è supportato dal programma Atracción de talento del governo della regione di Madrid (2016-T1/BIO-1105) e I + D Excelencia di spagnolo Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM è supportato da un Miguel Servet Fellowship da Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finanziato dal Fondo sociale europeo The "Investiamo nel vostro futuro" (FSE) e del FESR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Termociclatore | BioRad | C1000 | |
| Elettroporatore | BiorRad | 1652660 | |
| Cuvette per elettroporazione | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determinare la qualità del DNA misurando i rapporti di assorbanza 260nm/280nm e 260nm/230nm Incubatore |
| Memmert | UF1060 | ||
| Incubatore (agitatore) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Alimentatore per elettroforesi | BioRad | 1645070 | Elettroforesi su gel di agarosio |
| Camera per elettroforesi | BioRad | 1704405 | Elettroforesi su gel di agarosio |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Pippetes | multicanaleBiohit | 728220, 728230, 728240 | |
| Lettore di piastre Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Anelli di inoculazione | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| Piastre a 96 pozzetti | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polimerasi | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Enzimi di rescissione | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotici | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Kit di estrazione plasmidico |
| Wizard Kit di purificazione del DNA genomico | Promega | A1120 | kit di estrazione del gDNA |
| DNeasy Blood & Kit per tessuti | Qiagen | 69506 | Kit per l'estrazione del gDNA |
| Cuvette per elettroporazione | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| piastre Petri | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotube | ClearLine | 390701 | |
| piastre a 96 pozzetti (-80º | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantificazione della concentrazione di DNA |
| Agarosio | BioRad | 1613100 | Elettroforesi su gel di agarosio |
| 50x tampone TAE | BioRad | 1610743 | Elettroforesi su gel di agarosio |
| T4 Polinucleotide chinasi | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligasi | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
Riferimenti
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- M....
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Ristampe e permessi
