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Articolo metodologico

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

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⸱

DOI:

10.3791/57423

⸱

24 giugno 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati da Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletto (UV) luce visualizzazione, formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione e microanalisi a raggi x dispersiva di energia (EDX).

Abstract

Questo video presenta l'uso di microscopia elettronica di trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia (TEM-EDX) di confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. Queste linee cellulari, dopo il trattamento con acido ascorbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), subiscono transdifferenziazione osteogenica completa dalla proliferazione di mineralizzazione e produrre vescicole di matrice (MVs) che attivano la nucleazione apatite nella matrice extracellulare (ECM).

Basato su Alizarin Red-S (AR-S) colorazione e analisi della composizione dei minerali in lisati cellulari utilizzando la luce ultravioletta (UV) o in vescicole usando la formazione immagine TEM seguita da EDX quantificazione e mappatura dello ione, possiamo dedurre che osteosarcoma Saos-2 e osteoblastica le cellule hFOB 1.19 rivelano profili distinti di mineralizzazione. Cellule Saos-2 mineralizzano in modo più efficiente rispetto alle cellule hFOB 1.19 e producono più grandi depositi di minerali che non sono visibili ai raggi UV, ma sono simili a idrossiapatite (HA) in quanto hanno le sostituzioni più Ca e F.

I risultati ottenuti con queste tecniche ci permettono di concludere che il processo di mineralizzazione è diverso a seconda del tipo di cella. Proponiamo che, a livello cellulare, l'origine e la proprietà delle vescicole predeterminare il tipo di minerali.

Introduzione

L'osso è un tipo di tessuto connettivo composto da due parti: organici (cellule e fibre collagene) e minerali (composti di calcio e fosfato). I componenti principali di minerali nelle ossa sono apatiti1. Diversi tipi di cellule competenti di mineralizzazione in osso (osteoblasti), nei denti (odontoblasti) e nella cartilagine (condrociti) regolano i passi iniziali di mineralizzazione di produrre proteine della matrice extracellulare (ECM) e rilasciare la matrice vescicole (MVs) (Figura 1). MVs sono 100-300 nm diametro vescicole che si accumulano di calcio e fosfato facilitando la nucleazione apatite e successivamente associare al collagene2,3. Quindi, MVs disintegrarsi per rilasciare apatiti al medium extracellulare. Le apatiti continuano a crescere a contatto con le fibre di collagene e formano la matrice dell'osso. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di Pio e Ca2 + nel mezzo extracellulare. Alcuni dati recentemente pubblicati supportano il nostro modello4,5. Tessuti molli non mineralizzare in condizioni fisiologiche. Tuttavia, la calcificazione ectopica può verificarsi in condizioni patologiche come calcificazione vascolare3. Le cellule vascolari che acquisiscono il fenotipo degli osteoblasti in grado di produrre MVs che inducono la nucleazione di apatiti e avviare mineralizzazione negli strati della parete mediale e intimale dei vasi sanguigni. Dal calcificazione ectopica assomigliano endochondral normale mineralizzazione3, comprendere i meccanismi molecolari della mineralizzazione delle cellule ossee e condrociti dovrebbero fornire alcuni indizi sulla calcificazione ectopica dei tessuti molli che sono formato.

Lo sviluppo di tessuti scheletrici è regolato da vari enzimi, fattori di crescita e promotori o inibitori della mineralizzazione. L'azione antagonistica di tessuto-non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) (Figura 1) ed ectonucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi ho (NPP1), insieme a ankyrin (ANK), controlla concentrazione pirofosfato inorganico (PPho) 6. PPho, un potente inibitore della formazione HA, è idrolizzato di TNAP; NPP1 idrolizza i trifosfati del nucleotide per formare PPho mentre ANK PPho Esporta dalla cella alla ECM. Il rapporto di Pi/PPi può disciplinare l'apatite formazione7,8 con possibili conseguenze patologiche9.

La membrana di MV è arricchita in proteine di trasporto dello ione che facilitano la precipitazione iniziale di calcio e fosfato all'interno la MVs durante il processo di nucleazione (Figura 1). Il trasportatore del fosfato 1 (PiT) consente di incorporare Pho generato nello spazio perivesicular nel MVs10,11. Annexins possono essere coinvolti nell'associazione e nel trasporto di Ca2 + e nel processo biofisico che avvia la mineralizzazione del MV lumen12,13. Favoriamo l'ipotesi, suggerito in precedenza, per mineralizzazione all'interno di vescicole intracitoplasmatiche di nucleazione interno di apatite dentro la MV prima della sua propagazione nell'ECM14,15. Modellazione in vitro hanno confermato l'induzione di Ca2 +/ pho complessi formazione nei proteoliposomi effettuata in PS e AnxA516. Ciò potrebbe indicare che accumulo di Ca2 +, Pho, complessi AnxA5 e PS in "lipid rafts" di membranesrepresent i microvilli-come il nucleo di nucleazione (NC) di apatite all'interno Mvs Annexins e TNAP possiedono anche collagene-associazione capacità che possono essere utili nel mettere MVs lungo le fibre di collagene e, nello stimolare la propagazione di mineralizzazione in ECM. Fetuina A e osteopontina (OPN)17, sono noti come inibitori della formazione di apatite che possono rallentare la propagazione della mineralizzazione sul patibolo collageno. Nucleazione e propagazione sono eventi distinti, il primo precede quest'ultimo, ed entrambi possono essere rilevanti per il processo di mineralizzazione patologico.

Per scoprire come la chimica dei complessi di fosfato di calcio può cambiare fisiologico mineralizzazione e calcificazione ectopica, è necessario identificare i minerali prodotti dalle cellule. Apatiti sono un gruppo di calcio e fosfato contenente minerali con cristallo generale unità cella formula Ca10(PO4) di6X2, dove X = Cl, F, OH. Essi sono classificati come segue18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 e idrossiapatite (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

La scelta di linee cellulari di osteoblasti per indurre la formazione di minerali è fondamentale, poiché ogni linea cellulare esibisce un profilo distinto di mineralizzazione. In questo rapporto, abbiamo confrontato la nucleazione dei minerali da due modelli di cella selezionata umana di mineralizzazione: cellule osteoblastic hFOB 1.19 e cellule di osteosarcoma Saos-2. Cellule derivate da osteosarcoma sono comunemente usate come modelli osteoblastiche e cellule Saos-2 hanno conservato il carattere osteoblastic più maturo19 mentre le cellule indifferenziate hFOB fetale umano sono ampiamente usate come un modello per il normale osteoblastic differenziazione20. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati con metodi diversi: Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletta visualizzazione luce (UV), formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione, quantificazione di energia dispersiva x-ray microanalisi (EDX) e dello ione mappatura. Il vantaggio di TEM-EDX su tecniche alternative utilizzate negli studi precedenti è che dà risultati quantitativi e qualitativi della sostituzione dello ione in cristalli di apatite4,5,21. L'obiettivo generale dell'utilizzo di TEM-EDX era di trovare un metodo semplice per l'imaging e quantificazione della distribuzione degli ioni Ca, F e Cl in vari minerali da diversi tipi di cellule durante fasi distinte del processo di mineralizzazione. Questo metodo è stato utilizzato con successo, ad esempio, per monitorare l'interazione delle nanoparticelle di zinco con i prodotti chimici coesistenti e loro effetti combinati su organismi acquatici22. In un altro studio, un photocatalyst rame su materiali di titanio in soluzione acquosa è stato ampiamente caratterizzato mediante spettrometria ad emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman spettroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical misure23. Il nostro obiettivo era di confrontare l'origine e la proprietà di vescicole e minerali in due linee cellulari per comprendere il meccanismo che controlla la mineralizzazione durante la differenziazione ossea.

figure-introduction-1
Figura 1 . Schema delle fasi iniziali di mineralizzazione in cellule ossee che coinvolge la sintesi di proteine della matrice extracellulare (ECM) ed il rilascio delle vescicole della matrice (MVs) dalla membrana. MVs accumulare calcio attraverso l'azione di proteine leganti il calcio, annexins e fosfato, attraverso l'azione di un trasportatore di fosfato inorganico (PiT) seguita dall'attività del tessuto non specifico della fosfatasi alcalina (TNAP), che defosforila PPio Pho, quindi facilitante la nucleazione apatite. Quindi, MVs si disintegrano e rilasciare apatiti al medium extracellulare. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di Pio e Ca2 + in extracellulare media4,5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

1. cultura e trattamento delle cellule

  1. Mettere tutti i materiali necessari sotto la cappa a flusso laminare e sterilizzarli sotto luce UV. Terreni di coltura sono: una miscela 1:1 di prosciutto di media F12 e DMEM con 2,5 mM L-Glutammina completati con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% siero bovino fetale (FBS) (v/v) per feto umano hFOB 1.19 grande T antigene SV40 transfettate osteoblasti e medio 5A di McCoy con 1,5 mM L-Glutammina completato con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina e 15% FBS (v/v) per le cellule di osteosarcoma umano Saos-2.
  2. Coltura di cellule hFOB 1.19 a 34 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 e cellule Saos-2 a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2. Trasferimento di colture cellulari, entrambi hFOB 1.19 o Saos-2 cellule, dall'incubatrice per la cappa a flusso laminare e cambiare il mezzo a 10 mL di terreno di coltura fresco con FBS.
  3. Incubare le cellule senza stimolatori (cellule quiescenti) o stimolarli con 50 µ g/mL di acido ascorbico (AA) seguita da 7,5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparato in precedenza in acqua ultrapura e filtrata attraverso filtri per siringa 0,22 µm. Aggiungere gli stimolatori da microcentrifuga plastica sulla superficie del terreno di coltura. Delicatamente mescolare il piatto di cultura e incubare per 7 giorni.

2. rilevazione di minerali di calcio

  1. Lavare le colture cellulari con tampone fosfato salino (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1mm KH2PO4, pH 7.0).
  2. Aggiungere 5 mL di 2% (g:100 mL) AR-S in PBS, pH 5.0 e incubare le piastre per 30 min a macchiare i minerali.
  3. Lavare 3 volte con PBS. Con attenzione aggiungere PBS al muro piatto, cercare di non distruggere i minerali.
  4. Osservare i minerali di calcio sotto un microscopio ottico invertito e prendere le immagini.

3. visualizzazione delle sonde ai raggi UV.

  1. Per lisati cellulari, colture cellulari, sia a riposo o stimolato per 7 giorni, un trattamento secondo il protocollo di digestione della collagenosi24.
  2. Raccogliere il mezzo dalle colture delle cellule e lavare le cellule con PBS.
  3. Digerire le cellule con 3 mL di collagenasi di U/mL 500 in una soluzione di 0,25 M saccarosio, 0,12 M di NaCl, KCl e buffer di 0,02 M Tris-HCl, pH 0,01 M 7,45, a 37 ° C per 3 h.
  4. Meccanicamente raschiare le cellule, trasferirli in plastica per microcentrifuga e farli passare 10 volte attraverso una siringa di U mL 40 1 con 0,5 × 16 ago.
  5. Centrifugare i campioni a 500 × g per 5 min.
  6. Scartare il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di linfa sintetica di cartilagine (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosio, saccarosio 63mm, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).
  7. Trasferire l'idrossiapatite (HA), fluorapatite (FA) e chlorapatite (CA) polveri dalle bottiglie sul transilluminatore UV con una spatola e utilizzare come controlli.
  8. Trasferire i lisati cellulari dai tubi in plastica con punte di plastica e inserire con attenzione il transilluminatore UV.
  9. Prendere immagini sotto visibile e UV luce.

4. preparazione delle sonde per TEM-EDX

  1. Preparazione di minerali per la macchiatura negativa
    1. Sospendere 2,5 mg di prodotto sinteticamente HA, CA e FA di minerali25 in 500 µ l di acqua deionizzata e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 per 1 h.
    2. Prendete griglie Formvar/carbonio 300 Mesh Ni dal box con una pinza antistatica, posto su un piatto di porcellana multi-pozzetto e rilasciare 10 µ l di sospensioni HA, CA e FA le griglie.
    3. Asciugare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.
  2. Preparazione di riposo e hanno stimolato le cellule per l'incorporamento di 26
    1. Raccogliere medio da colture cellulari e lavare le cellule con il mezzo di desensibilizzazione fisiologico (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10mm NaHCO3, 1mm KH2PO4, glucosio di 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7.4).
    2. Fissare le cellule con 5 mL di una miscela di glutaraldeide di 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,2 per 1 h a temperatura ambiente sotto la cappa.
    3. Lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato di sodio 100 mM e rimuovere delicatamente il buffer dopo il lavaggio.
    4. In camera oscura, postfix i campioni con 2 mL di 1% tetrossido di osmio (g:100 mL) in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,2, per 20 min a temperatura ambiente sotto la cappa.
    5. Rimuovere il tetrossido di osmio e utilizzarlo.
    6. Lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato di sodio 100 mM.
    7. Quindi, disidratare i campioni in aliquote di 5 mL di una serie di soluzione di etanolo graduato a temperatura ambiente: 25% (vol.) per 5 min, 50% (vol.) per 10 min, 75% (vol.) per 15 min, 90% (in volume) per 20 min. Infine utilizzare etanolo assoluto due volte e incubare per 30 minuti e 12 ore.
    8. Meccanicamente raschiare le cellule dai piatti di cultura Petri in plastica, raccogliere in plastica per microcentrifuga e centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.
    9. Togliere i surnatanti e sospendere le cellule in 1 mL di una miscela di resina bianca di LR ed etanolo assoluto a un rapporto di volume di 1:2.
    10. Mescolare bene il contenuto delle provette di vetro prima dell'uso ed incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    11. Centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.
    12. Rimuovere i surnatanti e ripetere il passaggio precedente con 1 mL di una miscela 1:1 di resina bianca di LR ed etanolo assoluto.
    13. Mescolare bene e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    14. Centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.
    15. Rimuovere i sovranatante.
    16. Infine, aggiungere 1 mL di resina pura LR White ai campioni due volte e incubare per 1 h a temperatura ambiente in tubi di plastica.
    17. Posto 500 µ l di ciascun campione in capsule di gelatina.
      Nota: I campioni sono etichettati utilizzando un piccolo foglio di carta e una matita in modo che la resina non distrugge le etichette.
    18. Chiudere le capsule di gelatina, metterle in plastica per microcentrifuga e centrifugare a 130 x g per 1 min in un rotore.
    19. Rimuovere le capsule dai tubi plastica utilizzando una pompa a vuoto.
    20. Spostare i campioni al forno e polimerizzare a 56 ° C per 48 h.
    21. Preparare i blocchi di montarli nel supporto e li taglio alla piramide.
    22. Inserire il titolare l'ultramicrotomo, allegare il coltello di diamante Ultra 45° e riempirlo con acqua deionizzata; Ricordarsi di pulire la lama da bolle d'aria accidentale.
    23. Quindi tagliare sezioni (700 Å) utilizzando il coltello di diamante sul bagno di acqua deionizzata.
    24. Impostare gli scarti utilizzando bovina ciglia e posto che loro sul lato lucido del Formvar/carbonio 300 mesh Ni griglia e farle asciugare.
    25. Preparare il 2,5% (vol.) acetato di uranile in etanolo assoluto al buio sotto una cappa aspirante. Mantenere l'acetato di uranile in un contenitore di piombo e ricordate di non raccogliere il sedimento.
    26. In camera oscura, colorante di contrasto le griglie di apatiti sintetici e campioni di cellule con acetato di uranile 2.5% (vol.) in etanolo per 20 min a temperatura ambiente sotto la cappa.
    27. Lavare le griglie in etanolo al 50% (da Vol.), poi in acqua deionizzata e asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Infine, mettere le griglie nella casella.

5. TEM-EDX Analysis

  1. Formazione immagine TEM di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) attrezzata con microanalisi a raggi x dispersiva di energia di gamma completa (EDX) sistema e 11 Megapixel fotocamera
    1. Preparare un titolare di berillio per l'osservazione dei minerali e delle cellule. Utilizzare strumenti di antistatici.
    2. Rimuovere la coppia di viti e sollevare il piatto di berillio e rondella di berillio lontano dal resto del fermo.
    3. Montare la griglia, il lato lucido, sul supporto.
    4. Posizionare la rondella di berillio e la piastra di berillio e riavvitare le viti di fissaggio.
    5. Mettere la porta nella camera del vuoto e accendere la pompa del vuoto.
    6. Una volta raggiunto il vuoto, delicatamente inserire il supporto della camera di imaging e girare sulla trave.
    7. Sul monitor fluorescente, impostare i parametri di apertura del microscopio. Eseguire la correzione di astigmatismo di immagine; impostare lo zoom, messa a fuoco e telaio; e prendere le immagini TEM ad un ingrandimento di 50, 000 X.
  2. Imaging e microanalisi a raggi x per analisi spettrale e compositiva del gambo
    1. Inserire il rilevatore di raggi x (EDX) dispersiva di energia nella trasmissione scansione microscopia elettronica (STEM) imaging camera.
    2. Regolare la nitidezza dell'immagine in modalità messa a fuoco.
    3. Prendere immagini di staminali a un ingrandimento di 15, 000 X.
    4. Selezionare un punto nell'esempio per microanalisi a raggi x e raccogliere gli spettri.
    5. Ottenere dati sommando tutti i pesi atomici per tutti gli elementi della tavola periodica nel campione (come 100%) e che significa il contenuto degli elementi selezionati: Ca, F, Cl e P (come % atomica). Quindi, calcolare i rapporti di Ca, F o Cl a P per ogni campione.
  3. Mappatura dello ione
    1. Selezionare elementi quali calcio, fluoro, cloro e fosforo per rendere agli ioni mapping ed eseguire mappe EDX degli elementi selezionati nei campioni.
    2. Per ottenere dati che indica la localizzazione di elementi analizzati: Ca, F, Cl e P (come % atomica) e calcolare la co-localizzazione (in %) di Ca, F o Cl con P per ogni campione.

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Risultati

TEM-EDX consente per l'imaging in vitro delle vescicole di matrice (MVs) rilasciate da mineralizzante di cellule e di minerali prodotti da Mvs i risultati ottenuti con questa tecnica dimostrano che il processo di mineralizzazione può procedere in modo diverso in vari tipi di cellule. Le linee due cellulari ricevuto lo stesso trattamento di transdifferenziazione osteoblastica, ancora stimolato le cellule Saos-2 in modo più efficiente rispetto hFOB mineralizzata 1,19 osteo...

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Discussione

Nella carta attuale, abbiamo descritto i protocolli per la macchiatura, identificazione di luce UV di fluoroapatite AR-S e TEM-EDX in vitro la formazione immagine di MVs rilasciato da mineralizzante di cellule e di minerali prodotto da MVs. È possibile indirizzare tutti i metodi sopra indicati di seguito alcuni passaggi di risoluzione dei problemi comuni. Per ottenere risultati ottimali, diversi passaggi critici devono essere eseguite con attenzione. In primo luogo, è meglio aggiungere AA (che è acido) ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

MK e ASK eseguite operazioni manuali e LB preparato disegni e ha realizzato il film. ASK ha scritto il manoscritto, LB ha scritto la sceneggiatura e MK preparato il tavolo. SM, RB e SP leggere criticamente la tabella, la sceneggiatura e il manoscritto. Gli autori vorrei ringraziare Hanna Chomontowska per la sua eccellente assistenza con ultramicrotomia nonché Szymon Suski e Henryk Bilski per la loro eccellente assistenza con analisi TEM-EDX. Gli autori vorrei ringraziare dr Patrick Boschetti per correzione di lingua inglese professionale e Barbara Sobiak per le istruzioni di registrazione.

Questo lavoro è stato supportato da grant N N401 140639 del ministero polacco della scienza e dell'istruzione superiore per ASK, da sovvenzioni dal National Science Centre, Polonia 2016/23/N/NZ4/03313 LB e 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 progetto BIOIMAGINE : BIO-IMAGing in ricerca innovazione e formazione, GA n. 264173 e dai fondi statutari dell'Istituto Nencki di biologia sperimentale, Accademia polacca delle scienze.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente
Ham" s Miscela di terreni DMEM/F12PAAE15-8131:1, per osteoblasti trasfettati con antigene T di grandi dimensioni hFOB 1.19 SV40 (ATCC CRL-11372)
McCoy' s 5A mediumPAAE82312-0025per osteosarcoma umano Saos-2 cellule (ATCC HTB-85)
Miscela di antibiotici (penicillina/streptomicina)SigmaP0781-100ML100 U/mL ciascuno
G-418Sigma681680,3 mg/mL
FBSGibco1027010% per hFOB 1,19 e 15% per Saos-2
AASigmaA-596050 &; g/mL
ß-GPSigmaG9422-100G7.5 mM
Bio-Gel HTP GelBio-Rad130-0420per HA
FAsintetizzato da noi
CAsintetizzato da noi Tampone
fosfato di sodio Na2HPO4/NaH2PO4 miscelaSigmaS7907/S82820,1 M, pH 7,2
PBSpH 7,0, preparato da noi
AR-S in PBSSigmaA5533-25G0,5 g/100 mL, pH 5,0
Collagenasi tipo IASigmaC2674500 U/mL
SCL tamponepreparato da noi
Acquaprodotta da noi
EtanoloPOChBA6480111assoluta 99,8% e soluzioni 25, 50, 75, 90%
acetato di uranile in etanolo al 50%Polysciences Inc.21447-250,25 g/10 mL
PD mediumpH 7,4, preparato da noi
Miscela di fissazione (paraformaldeide/glutaraldeide)Sigma158127/G-62573%:1%
Post-fissazione OsO4Sigma756331%
LR Resina bianca in etanoloPolysciences Inc.17411-MUNC 500g1:2, 1:1, 100%
AcetoneCHEMPUR111024800puro
Strumento
Fiale criogenicheCorning Inc.4304871,2 mL
Piastre per coltura Petriin plastica Falcon353003100 mm
Provette in plasticaFalcon352096 e 35207015 e 50 mL
Falcone VWR357521 e 612-37001 e 10 mL
Provette per microcentrifuga in plasticaSigmaZ688312 e Z6280341,5 mL nere e 2 mL trasparenti
Puntali in plasticaVWR613-0364, 613-0239 e 613-10500,1-10 µ L naturale, 1-200 µ L giallo e 200-1000 µ L blu
Rack in plastica LightLabsA-7055-Z, A-7053-Cverde per provette, arancione per microprovette e blu per sonde TEM
Laminar Hera SaveThermo Scientific Co.KS12(H14 secondo DIN EN 1822)
Incubatori Hera CellThermo Scientific Co.15034 gradi C per hFOB 1,19 e 37 gradi C per Saos-2
Cappa aspirantePOLONWCS-2per colorazioni TEM Bottiglie
di vetroSIMAX1632414501050 e 163241450110050 e 100 mL
Provette di vetro al quarzoSIMAX638422010100Ø 10 mm, L 100 mm
PompaIBS Integra BiosciencesVACUSAFE comfortper vuoto
FornoMemmertUNE 40056° C
Piastra multipozzetto in porcellanaRosenthal technik229/1212 pozzetti Becher
vetroSIMAX63241701002525 mL
Bottiglie di vetroPocordDIN2210 mL
Scatola di plasticaAgar Scientific Ltd.per l'oscurità
Capsule di gelatina Snap FitAgar Scientific Ltd.G3741misura 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni griglie in scatolaAgar Scientific Ltd.Pellicola S162N3sul lato lucido
Raschietto per celle di silicioSigmaSIAL0010-100EAmisura 1,8/25 cm
Siringa con ago SiringaBogMark0071 mL 40 U, ago 0,5 x 16
SiringaChiranaCH005L5 mL
CentrifugaMPW Medical InstrumentsMPW-350R130 x g e 500 x g
Transluminatore UVUVPM-20per luce visibile e UV
UltramicrotomoLKBNOVA700Å sezioni
PortabloccoLKBE6711forma rotonda
Coltello diamantatoDiATOMEUltra 45°Taglia 3
Portabovino, preparato da noi
PinzeROTH2855.1antistatico per griglie Set di
spatoleROTHE286.1antistatico per polveri
Imaging
Microscopio a luce invertitaZeiss con CanonAxioObserver Z1 dotato di PowerShot G9Contrasto di fase, luce trasmessa, obiettivo 20x, filtri RGB
Microscopio elettronico a trasmissioneTEM Jeol Co. con Oxford Instruments e SiS-OlympusJEM-1400 TEM dotato di sistema di microanalisi a raggi X a dispersione di energia INCA (EDX) a gamma completa e ingrandimento della fotocamera MORADA G2 da 11 Megapixel50.000X per TEM e 15.000X per STEM e EDX
Corpo macchina e obiettiviNikonNikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		per registrazioni di filmati
MicrofonoMXL MicsTempoper registrazioni vocali
deionizzata Pipette sierologiche da Filtro HEPA in ciglia

Riferimenti

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