Articolo metodologico

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

DOI:

10.3791/57444

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27 marzo 2018

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1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

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Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.

Abstract

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Nel sistema nervoso centrale, il recettore di sottotipo D1-alfa (Drd1α) è il più abbondante recettore della dopamina (DA), che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dello sviluppo e crescita neuronale. Tuttavia, i meccanismi alla base di Drd1α anomalie di recettori che mediano le risposte comportamentali e modulazione della funzione di memoria di lavoro sono ancora poco chiari. Usando un romanzo RNA in situ ibridazione analisi, lo studio corrente ha identificato dopamina Drd1α del recettore e la tirosina idrossilasi (TH) espressione del RNA da correlati DA circuiti nella zona di nucleo accumbens (NAc) e regione di substantia nigra (SNR), rispettivamente. Drd1α espressione nel NAc Mostra un "discreto punto" modello di macchiatura. Sono state osservate differenze di sesso chiaro nell'espressione di Drd1α. Al contrario, TH Mostra un pattern di colorazione "cluster". Per quanto riguarda l'espressione TH, ratti femminili visualizzata un' più alta espressione di segnale per cella rispetto gli animali maschii. I metodi presentati qui forniscano una tecnica di romanzo in situ di ibridazione per indagare i cambiamenti nella disfunzione del sistema della dopamina durante la progressione di malattie del sistema nervoso centrale.

Introduzione

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Disfunzione del sistema della dopamina striatale è coinvolto nella progressione dei sintomi clinici osservati nelle malattie neurocognitive multiple. I ricevitori della dopamina D1 sono presenti nella corteccia prefrontale (PFC) e regioni striatal del cervello e influenzano pesantemente i processi cognitivi1, compreso il funzionamento memoria, elaborazione temporale e comportamento locomotiva2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. precedenti studi chiarito che le modifiche dei ricevitori della dopamina D1 sono state associate con la progressione di attenzione iperattività di deficit disorder (ADHD)8, i sintomi neurocognitivi nella schizofrenia9, 10 e lo stress suscettibilità11. In particolare, nella schizofrenia, tomografia a emissione di positroni (PET) studi hanno indicato che la capacità di legame dei recettori D1 della dopamina nelle cortecce prefrontali era altamente relative al deficit cognitivi e la presenza di sintomi negativi11. La crescita dendritica dei neuroni eccitatori nella corteccia prefrontale regolato dal recettore della dopamina D1 allevia lo stress suscettibilità. Inoltre, l'atterramento del recettore D1 in neuroni corticali prefrontale mediale (mPFC) potrebbe migliorare la sconfitta sociale indotta da stress sociale evitare12.

Qui, presentiamo una nuova tecnica di RNA in situ ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in una cella con campioni di tessuto fresco congelato. La tecnica attuale ha molteplici vantaggi rispetto ai metodi che esistono all'interno della letteratura corrente. In primo luogo, l'attuale procedura per mantenere il contesto spaziale e morfologico del tessuto ed è stata effettuata su campioni di tessuto fresco congelato affinché altre procedure che richiedono fresco, non incorporati tessuti possono essere combinati con i metodi attuali. Procedure analoghe nei tessuti formalina-fisso e paraffina-incastonati hanno illustrato che risoluzione singola trascrizione può essere realizzato usando un RNA in situ ibridazione tecnica13. Rilevamento del RNA a livello di singola trascrizione fornisce una sensibilità superiore alla espressione di numero di copia basso così come l'opportunità di confrontare l'espressione genica a livello di singole cellule che non possono essere raggiunti da altri metodi di rilevazione dell'acido nucleico, quali tecniche di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Inoltre, il metodo corrente mantiene immagini con un elevato rapporto segnale-rumore attraverso le sonde del RNA altamente specifiche che sono ibridate di trascritti di RNA bersaglio singolo e associate in sequenza con una cascata di molecole di amplificazione del segnale nella rilevazione sistema. Infine, l'attuale tecnologia offre l'opportunità di valutare più sistemi biologici con sue sonde proprietarie di target-specifici, piuttosto che limitare la nostra ricerca ad una sola classe di indicatori relativi al sistema quali il rilevamento di proteine di metodi di esame immuno-istochimico.

Nel nostro studio, abbiamo usato questa romanzo ibridazione in situ per RNA per valutare l'espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l'espressione di tirosina idrossilasi (TH) nella substantia nigra (SNR) dei ratti F344/N sia maschili che femminili. L'innovativo ibridazione in situ per RNA permesso di studiare i meccanismi che influenzano sia DA assorbimento e rilascio di DA simultaneamente, migliorando la nostra comprensione della complessità del sistema striatal del DA. Qui, descriviamo la procedura per fette di cervello fresco-congelato e fornire i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: "discreto punto" o "cluster".

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Protocollo

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Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla cura degli animali e uso Committee (IACUC) presso la University of South Carolina (numero di assicurazione federale: A3049-01).

1. preparazione di sezioni di cervello congelato fresco

  1. Utilizzare il ceppo di ratti F344/N: tre ratti di ogni sesso, Guida in linea di 13 mesi di età, circa 320 g di peso corporeo.
  2. Regolare la concentrazione di sevoflurane al 5% (sovradosaggio del sevoflurano). Continuare l'esposizione sevoflurano dopo respiro si ferma per un minuto.
  3. Decapitare il ratto e rimuovere il cervello.
  4. Immergere il cervello di ratto in azoto liquido per 15 s entro 5 min di raccolta del tessuto.
  5. Equilibrare il cervello a-20 ° C in un criostato per 1 h.
  6. Tagliare 30 µm sezioni e trasferire sui vetrini (Vedi Tabella materiali).
  7. Scegliere le sezioni della regione di nucleo accumbens, circa 2,76 mm a 2,28 mm anteriore al Bregma14.
  8. Continuamente fetta cervello del ratto dal bulbo olfattivo attraverso la regione di nucleo accumbens secondo la struttura stereotassica cerebrale del ratto.
  9. Montare i campioni sulle diapositive. Mantenere le sezioni a-20 ° C per 10 minuti ad asciugare.
  10. Immediatamente immergere i vetrini nel paraformaldeide 4% pre-refrigerati per 1 h a 4 ° C.
  11. Porre i vetrini in un gradiente crescente di etanolo a temperatura ambiente (TA): 50% EtOH per 5 min; 70% EtOH per 5 min; e 100% EtOH per 5 min.
  12. Ripetere con il fresco 100% EtOH.
  13. Mettere i vetrini su carta assorbente e lasciare asciugare all'aria.
  14. Disegnare una barriera intorno ogni sezione con una penna di barriera (Vedi Tabella materiali). Lasciate la barriera asciugare completamente per 1 min.

2. pretrattamento delle sezioni del cervello

  1. Accendere il forno e impostare la temperatura a 40 ° C.
  2. Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di pretrattamento 4 reagente (Vedi Tabella materiali) su ogni sezione del cervello (una sezione per ogni diapositiva).
  3. Incubare le sezioni per 30 minuti a TA.
  4. Immergere i vetrini in 1X PBS per 1 min a RT. Repeat con PBS 1X fresco.
    Nota: Diapositive non dovrebbero stare in PBS 1X per più di 15 min.

3. determinazione del RNA In Situ ibridazione fluorescente Multiplex

  1. Riscaldare la sonda di destinazione per 10 min a 40 ° C a bagnomaria e poi raffreddare a RT.
  2. Posizionare il reagente di RNA (ad es., Amp FL 1-4) a TA.
  3. Rimuovere il liquido in eccesso da diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
  4. Aggiungere 3 gocce (90 µ l) della sonda Drd1α (C1) sulla fetta di campione. Incubare per 2 ore a 40 ° C.
  5. Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
  6. Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
  7. Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 1-FL sulla fetta di campione. Incubare per 30 min a 40 ° C.
  8. Immergere i vetrini in tampone di 1 lavaggio per 2 min a RT. Repeat con buffer di 1wash fresco.
  9. Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
  10. Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 2-FL sulla fetta di campione. Incubare per 15 min a 40 ° C.
  11. Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
  12. Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
  13. Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 3-FL sulla fetta di campione. Incubare per 30 min a 40 ° C.
  14. Immergere i vetrini in 1x tampone di lavaggio per 2 min a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
  15. Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
  16. Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 4-FL-Alt A sulla fetta di campione. Incubare per 15 min a 40 ° C.
  17. Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
  18. Rimuovere il liquido in eccesso da diapositive e collocare immediatamente 2 gocce di reagente di montaggio (Vedi Tabella materiali) su ogni sezione.
  19. Porre un coprivetrino 22 mm 22 mm (Vedi Tabella materiali) sopra ogni sezione del cervello.
  20. Archiviare le diapositive al buio a 2-8 ° C fino a secco.
  21. Accendere il microscopio confocale e passare a un obiettivo 60x.
  22. Ottenere immagini dello stack Z con un microscopio confocale. Vedere il video supplementare per una procedura di dettaglio dell'imaging confocale.
  23. Acquisire immagini della Drd1α etichettati cellule nella regione di accumbens del nucleo (eccitazione: 488 nm; Emissione: 515/30 nm).
    Nota: Non lasciare che cervello sezioni asciugare tra fasi di incubazione.

4. analisi dei dati

  1. Semi-quantitativamente analizzare il pattern di colorazione: "punti discreti".
    1. Per identificare la cella singola dall'immagine, eseguire DAPI colorazione come marcatore nucleare. Tuttavia, è ancora difficile da analizzare alcune parti del tessuto cerebrale, in quanto ha più tipi di cellule con forma irregolare di nuclei e/o cellule. Qui, due ricercatori esperti assegnare separatamente ogni cella da immagini per definire la regione di cella.
    2. Punteggio visivamente ogni cella all'interno delle immagini confocale rappresentative basato sul numero di punti per cella utilizzando i criteri specifici (Figura 1B).
    3. Determinare il numero totale delle cellule in ogni categoria e dividere per il numero totale delle cellule x100 per creare grafici di frequenza relativa che visualizzare la frequenza percentuale di cellule all'interno di ogni categoria per tutte le sezioni di tessuto (Figura 2A) e per maschi e femmine separatamente (Figura 2E).
    4. Dividere la somma delle celle all'interno di tutte le categorie precedenti per il numero totale delle cellule x100 per determinare la frequenza cumulativa delle cellule per tutte le sezioni di tessuto (Figura 2B) e per maschi e femmine separatamente (Figura 2F).
  2. Analizzare statisticamente i "puntini discreti" metodo di colorazione (facoltativo).
    1. Esaminare il numero di punti per cella per fornire una variabile categorica che è ordinale in natura (vale a dire, il numero di celle che rientrano in ciascuna categoria di rango da minima espressione delle cellule (1) alla più alta espressione delle cellule (9)) per ulteriori analisi statistiche.
    2. Dopo l'esame di statistica descrittiva, utilizzare tre approcci principali: una statistica di Mantel-Haenszel, un test di Mann-Whitney U e un test di Kruskal-Wallis. Sebbene l'approccio statistico preciso sarà dipende la domanda di design e ricerca sperimentale di interesse, un albero di decisione statistica (Figura 4) può essere di aiuto nel prendere le decisioni per quanto riguarda di uno approccio analitico.
  3. Quantificare l'intensità di segnale della regione di interesse (ROI) per il modello di macchiatura: "cluster".
    1. Calcolare l'intensità del segnale di ogni immagine utilizzando la seguente equazione:
      L'intensità del segnale = totale intensità dell'immagine ROI - (zona di immagine totale del × di intensità di fondo media)
    2. Contare il numero totale di celle all'interno di immagine ROI per calcolare l'espressione del segnale approssimativo per la cellula. Le differenze del gruppo in intensità segnale/immagine, nonché il numero di cellule/immagine possono essere di interesse a considerare i meccanismi che possono contribuire alle differenze di gruppo vista in segnale espressione/cella (Figura 3B-3D).
  4. Analizzare statisticamente i "cluster" metodo di colorazione (facoltativo).
    1. Esaminare l'espressione/cella di segnale per fornire una variabile continua per ulteriori analisi statistiche. Uso due approcci, tra cui un test t per campioni indipendenti e analisi della varianza (ANOVA), basato sul numero di fattori tra soggetti inclusi nella progettazione. Un albero di decisione statistica (Figura 4) può essere di aiuto nel prendere le decisioni per quanto riguarda l'approccio statistico più appropriato.

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Risultati

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Lo studio corrente ha osservato un "punti discreti" metodo di colorazione per l'espressione di RNA nei recettori della dopamina D1-alfa (Drd1α) del NAc in ratti F344/N (Figura 1A). Segnali di fluorescenza individuali sono stati identificati facilmente e possono essere visto come unica "puntini", ognuno dei quali rappresenta una singola trascrizione di RNA all'interno della cellula. Per le immagini da NAc che visualizzano i "puntini discreti" modello di macchi...

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Discussione

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In questo protocollo, descriviamo una tecnica novella di ibridazione in situ per fette di cervello fresco congelato per valutare l'espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l'espressione di tirosina idrossilasi (TH) in regione della substantia nigra (SNR). Forniamo anche i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: "discreto punto" o "cluster".

I passaggi critici per un'analisi di fluorescenza multisala successo RNA in situ di ibridazi...

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Dichiarazioni

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Non ci sono nessun conflitti di interesse di dichiarare.

Ringraziamenti

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Le opere presenti sono state sostenute dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624. Fondo parziale è stato fornito da una sovvenzione di formazione NIH T32 nella scienza biomedica-comportamentale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema di forni HybEZAdvanced Cell Diagnostics 310010
Sonda RNAscope - Rn-DRD1ADiagnostica cellulare avanzata 317031Sonda RNAscope verde canale 1
a colori - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Canale colore 2,
RNAscope arancione Kit di reagenti multiplex fluorescentiDiagnostica cellulare avanzata 320850
ImmEdge Penna Barriera IdrofobicaVettore LaboratorioH-4000
SuperFrost Plus VetriniFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldeideSigma-Aldrich158127-500G
SevofluranoMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek verticale 24 vetriniFisher ScientificNC9837976
Piatto colorante Tissue-TekFisher ScientificNC0731403
Precision General Purpose BathsThermoFisher ScientificTSGP28
Pretrattamento 4Diagnostica cellulare avanzata 320850parti di kit
Reagente anti-sbiadimento ProLong GoldLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parti di kit
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parti di kit
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parti di kit
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850parti di kit
pacchetto software EZ-C1Nikon Instrumentsversione 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,versione 9.4

Riferimenti

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  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
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  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

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Ibridazione in situ dell RNAMicroscopia confocaleDifferenze tra i sessiTirosina idrossilasiSistema nervoso centraleImaging a fluorescenzaAnalisi Z stackTest U di Mann Whitney

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