Metodi semplici sono descritti per la dimostrazione della produzione di citotossici amiloidi che segue infezione dell'endotelio polmonare da Pseudomonas aeruginosa.
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Articolo metodologico
Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevati tassi di mortalità nei mesi successivi alla dimissione dall'ospedale. È stato ipotizzato che l'infezione del tessuto polmonare durante la polmonite provoca la produzione di citotossine longeve che può condurre a guasto dell'organo fine successive. Abbiamo sviluppato le analisi in vitro per verificare l'ipotesi che citotossine sono prodotte durante l'infezione polmonare. Cellule endoteliali polmonari isolati del ratto e il batterio Pseudomonas aeruginosa sono utilizzati come sistemi modello, e la produzione di cytoxins dopo l'infezione delle cellule endoteliali dai batteri è dimostrata mediante coltura cellulare seguita da quantificazione diretta utilizzando dosaggi di lattato deidrogenasi e un nuovo metodo al microscopio che utilizza la tecnologia di ImageJ. La natura dell'amiloide di queste citotossine è stata dimostrata dalle analisi obbligatorie di tioflavina T e di immunoblotting e immunodepletion usando l'anticorpo dell'anti-amiloide A11. Ulteriori analisi mediante immunoblotting ha dimostrato che oligomerici tau e Aβ erano prodotte e rilasciate dalle cellule endoteliali dopo l'infezione da p. aeruginosa. Questi metodi dovrebbero essere facilmente adattabili alle analisi di campioni clinici umani.
Introduzione
I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevato i tassi di mortalità nei mesi successivi ospedale scarico1,2,3,4,5,6. Nella maggior parte dei casi, la morte si verifica da qualche tipo di organo di estremità guasto tra cui renale, polmonare, cardiaca, o eventi del fegato, come pure colpo5,6. Il motivo per l'elevato tasso di mortalità in questa popolazione di pazienti non è mai stato stabilito.
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Protocollo
Tutte le procedure di animali sono state esaminate e approvati dal comitato di cura di animale della University of South Alabama e istituzionale e sono state eseguite in conformità con tutte le normative federali, statali e locali. Colture primarie di cellule endoteliali microvascolari polmonare del ratto (PMVECs) sono stati ottenuti dall'impianto di Core di cultura cellulare presso la University of South Alabama di centro per biologia del polmone. Le cellule sono state preparate utilizzando le procedure precedentemente descritte16.
1. generazione di citotossici surnatanti
Nota: Qui, usiamo ....
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Risultati
Un test semplice in vitro è stato sviluppato per analizzare la presenza di citotossine in surnatanti delle cellule infettate dal batterio p. aeruginosa. Fondamentalmente, terreno di coltura da cellule infette sono raccolti 4 h dopo aggiunta batterica, i batteri sono stati rimossi da sterilizzazione filtro del surnatante della cultura, e quindi il surnatante sterile viene aggiunto a una nuova popolazione di cellule. Le cellule sono poi osservate 21-24 h dopo l'aggiunta de.......
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Discussione
Qui, metodi semplici in vitro sono delineati che consentono la dimostrazione della generazione di citotossici amiloidi durante l'infezione con una polmonite causando organismo. Questi metodi includono analisi di citotossicità di cultura cellulare, immunoblotting, quantificazione dell'utilizzo un metodo novello al microscopio e dell'associazione ThT di uccisione delle cellule. Analisi degli agenti citotossici hanno dimostrato che sono amiloide in natura (Figura 2 e .......
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Dichiarazioni
Nessuna relazione.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata in parti da sovvenzioni NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 a TS e HL136869 a MF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coniglio anti beta amiloide | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amiloide oligomero anticorpo | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomero anticorpo | EMD Millipore | ABN454 | |
| Tioflavina | T Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Filtri per siringhe da 0,22 micron | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Capra anticoniglio IgG Abcam | ab6721-1 | ||
| Ceppi PA103 e Δ PcrV | Questi ceppi di P. aeruginosa sono stati ottenuti dal Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectina | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectina | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0,22 micron nitrocellulosa | BioRad | 162-0112 | |
| Tipo 2 collagenasi | Worthington | LS004176 | |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillina Sale disodico | Sigma | C1389 | |
| Concentratori per microcetrifugazione - 10.000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassio fosfato bibasico | Sigma | 795496-500G | |
| Fosfato di magnesio eptaidrato | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Acido citrico | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Fosfato di sodio eptaidrato bibasico | Sigma | S9506-500G | |
| Contacellule automatizzato Countess | Invitrogen | C10277 |
Riferimenti
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F.
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Ristampe e permessi
