Descriviamo le prove meccaniche simultanea e live imaging 3D della parete arteriosa di isolato, arterie di resistenza umana e Fiji e Ilastik analisi di immagine per la quantificazione di elastina e collagene densità di volume e di organizzazione spaziale. Discutiamo l'uso di questi dati in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa.
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Articolo metodologico
Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il contributo di patogeno della resistenza dell'arteria rimodellamento è documentato nell'ipertensione essenziale, il diabete e la sindrome metabolica. Le indagini e lo sviluppo di modelli matematici microstructurally motivati per comprendere le proprietà meccaniche delle arterie di resistenza umana nella salute e nella malattia hanno il potenziale per aiutare la comprensione come malattia e trattamenti medici influenzare la microcircolazione umana. Per sviluppare questi modelli matematici, è essenziale per decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare. In questo lavoro, descriviamo un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e simultaneo imaging tridimensionale privo di etichetta della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per quantificare le modifiche i) pressione indotta in angoli ramificazione lamina elastica interna e rettilineità adventitial collagene utilizzando Fiji e densità di volume ii) collagene ed elastina determinato utilizzando il software Ilastik. Preferibilmente tutte le misure di formazione immagine e meccaniche vengono eseguite sulle arterie live, irrorate, tuttavia, è un approccio alternativo utilizzando pressione standard video-microscopia myography in combinazione con post-fissazione formazione immagine dei vasi ri-pressurizzati discussi. Questo metodo alternativo fornisce agli utenti con diverse opzioni per approcci di analisi. L'inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa, e lo sviluppo futuro e aggiunte al protocollo sono proposti.
Introduzione
Il contributo patogeno e gli effetti della resistenza dell'arteria rimodellamento sono documentati nell'ipertensione essenziale, diabete e sindrome metabolica1,2,3,4,5. Decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare è essenziale per lo sviluppo di modelli matematici di questa associazione. Tali modelli miglioreranno la comprensione del processo di rimodellamento e sosterranno lo sviluppo di modelli di silico utile per testare strategie farmacologiche ....
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Protocollo
Raccolta delle biopsie del pericardio parietale umana per l'uso in quest'opera è stata eseguita dopo consenso informato scritto, come descritto in precedenza33. Lo studio dei tessuti umani sono conformi ai principi delineati nella dichiarazione di Helsinki34 ed è stato approvato dai comitati regionali la salute ricerca etica per Southern Denmark (S-20100044 e S-20140202) e l'Agenzia danese per la protezione dei dati.
1. raccogliere tessuto e Isolate (umano) resistenza dell'arteria
- Raccogliere campioni di tessuto di interesse immediatamente dopo l'asportazione durante un intervento ch....
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Risultati
Il myograph di pressione su misura per l'imaging utilizzato in questo lavoro è illustrato nella Figura 1. Un'attenzione particolare per la progettazione del myograph è stata pagata ai) camera con un piccolo volume (2 mL) e ii) la possibilità di posizionamento cannule vicino a e in parallelo con il fondo di vetro (Figura 1B). Parte inferiore della camera di misura 50 × 24 mm #1.5 vetrino coprioggetti (sostituibile). Il regolatore .......
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Discussione
Questo lavoro rappresenta la nostra proposta per un standardizzato combinato imaging e pressione myography approccio, prezioso per la valutazione simultanea delle proprietà meccaniche di resistenza arterie e pressione relativi cambiamenti nella struttura dell'arterioso parete in un intervallo di pressione da 0 a 100 mmHg. L'approccio presentato è stato sviluppato utilizzando attrezzature costruzione personalizzata, tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi myograph di pressione che si inserisce su un microscopio di fluor.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il centro di Imaging biomedico di danese molecolare presso la facoltà di scienze naturali, Università della Danimarca meridionale, per l'utilizzo di laboratori e microscopi. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior sono riconosciuti per l'eccellente assistenza tecnica con la pressione myography e imaging.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Strumenti di Fine Science | 15401-12 | ||
| Strumenti di Fine Science | 11251-23 | ||
| Nikon | SMZ800N | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | 761028 | per dissezione | |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Danimarca | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| Smiths medical Intl, Regno Unito | |||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | ||
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | ||
| Mettler toledo | |||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | B3259 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | A7030 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | C5670 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | G7021 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | E3889 | ||
| Merck Millipore, Hellerup, Danimarca | 1.00496.9010 | Fosfato tamponato (pH 6,9) Soluzione di formaldeide al 4% | |
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | H3784 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | P9666 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | P5655 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | M2643 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | S2002 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | S5886 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | S5761 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | 1.06462 | ||
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | PHR1423 | ||
| Sigma-Aldrich, Bröslash; ndby, Danimarca. | Z370525 | ||
| Tocris Bioscience, Bristol, Regno Unito | 538944 | ||
| Nikon | Custom built | ||
| Spectra Physics, Mountain View, CA | |||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersione) NA 0.75 | ||
| Hamamatsu, Ballerup, Danimarca | H7422P-40 | ||
| AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Germania). | ChromaET 460 nm passa-lungo passamento dicroico | ||
| AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Germania). | Filtro Semrock FF01-520/35-25 BrightLine | ||
| AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Germania). | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch TM | |||
| deve corrispondere all'obiettivo utilizzato sul microscopio (#1 o #1,5), in alternativa, impostare il collare di regolazione in modo che corrisponda al vetrino |
Riferimenti
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med.....
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Ristampe e permessi
Tag
Microarchitettura del collagene e dell'elastinaMeccanica delle arterie di resistenzaImaging a eccitazione a due fotoniAutofluorescenza dell'elastinaGenerazione di seconda armonica del collageneAnalisi delle immagini con FijiAnalisi con software IlastikCambiamenti vascolari indotti dalla pressioneQuantificazione della matrice extracellulare
