La procedura sperimentale su immunophenotyping di omotrapianti PDAC murino ortotopico mira a profilatura immuno-microambiente tumorale. I tumori sono orthotopically impiantato tramite intervento chirurgico. Tumori di 200 – 600 mm3 dimensioni sono state raccolte e dissociati per preparare sospensioni unicellulari, seguite da analisi dell'indicatore multi-immuni FACS usando diversi anticorpi fluorescente etichettati.
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Articolo metodologico
Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Omotrapianto (syngeneic) tumori sono il cavallo di battaglia di ricerca preclinica di immuno-Oncologia (i/o) di oggi. Il microambiente tumorale (TME), in particolare sua immunitario-componenti, è di vitale importanza per la prognosi e la previsione di risultati di trattamento, specialmente quelli di immunoterapia. TME immunitario-componenti sono composte di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie tumore-infiltrazione valutabile da FACS multi-colore. L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra i più letali malignances mancano opzioni di buon trattamento, così un'esigenza medica urgente e insoddisfatta. Una ragione importante per la sua non-risposta alle varie terapie (chemio-, mirati, I/O) è stata la sua abbondante TME, composto da fibroblasti e leucociti che proteggono le cellule del tumore da queste terapie. Orthotopically PDAC impiantato è creduto per più accuratamente riconquistare la TME di cancri del pancreas umani rispetto ai modelli convenzionali sottocutanei (SC).
Tumori dell'omotrapianto (KPC) sono trapianti di mouse spontanea PDAC originari da KPC-topi geneticamente ingegnerizzati (ras diKG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Il tessuto del tumore primario è tagliato in piccoli frammenti (~ 2 mm3) e trapiantato per via sottocutanea (SC) ai destinatari syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 settimane di età). Gli omotrapianti erano quindi chirurgicamente orthotopically trapiantato sul pancreas dei topi C57BL/6 nuovi, insieme a SC-impianto, che ha raggiunto volumi del tumore di 300 – 1.000 mm3 da 17 giorni. Solo i tumori di 400 – 600 mm3 sono state raccolte per la procedura di analisi approvati e puliti per rimuovere i tessuti non tumorali adiacenti. Essi fossero dissociati per protocollo utilizzando un dissociatore di tessuto in sospensioni unicellulari, seguite dalla macchiatura con pannelli designati di anticorpi fluorescente-etichetta per i vari indicatori di diverse cellule immunitarie (linfoidi, mieloidi e NK, DCs). I macchiato campioni sono stati analizzati utilizzando multi-colore FACS per determinare i numeri delle cellule immuni di stirpi differenti, come pure la loro percentuale relativa all'interno dei tumori. I profili immuni di orthotopic tumori poi sono stati confrontati a quelli dei tumori SC. I dati preliminari hanno dimostrato significativamente elevata infiltrazione TILs/TAMs nei tumori sopra pancreas e infiltrazione della B-cellula superiore orthotopic piuttosto che i tumori SC.
Introduzione
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) fa sì che quasi la metà un milione mortalità universalmente ogni anno, uno dei top 5 cancro killer. Ci sono poche opzioni terapeutiche efficaci e nessun immunoterapie approvati; di conseguenza, nuovi trattamenti sono disperatamente necessari. I cancri sempre più stanno riconoscendi come malattie immunologiche, tra cui PDAC, oltre le malattie genetiche come la conosciamo oggi. Fattori immunologici e genetici probabilmente sarebbero determinare prognosi della malattia così come il trattamento dei risultati. I tumori eludere la sorveglianza immunitaria ospite e finalmente avanzano per causare la morte. Molti di questi processi ....
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Protocollo
Tutti i protocolli e integrazioni o procedure che coinvolgono la cura e l'uso di animali saranno riesaminate e approvate dalla corona Bioscience istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) prima lo svolgimento degli studi. La cura e l'uso degli animali sarà solitamente condotta conformemente alle linee guida internazionali AAALAC (associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care) come riportato nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, ricerca nazionale Consiglio (2011). Tutte le procedure sperimentali animali saranno in condizioni di sterilità presso strutture di SPF (specifico patogeno-libera) e condotta in stret....
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Risultati
Impianto di orthotopic del PDAC ha provocato sviluppo veloce del tumore simile a quello visto per l'impianto di SC. Dopo i frammenti di tumore donatore sono stati impiantati in topi destinatari, sia per via sottocutanea e orthotopically secondo i protocolli descritto ai punti 2.1 e 2.2, i tumori di omotrapianto KPC impiantati dimostrato a rapida crescita come mostrato in figura 1A . Tumori dell'omotrapianto KPC raccolti in diversi momenti sono mostrati in
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Discussione
Sebbene più facilmente vengono condotti studi utilizzando i tumori SC, orthotopically impiantati tumori modelli possono essere potenzialmente più rilevanti per gli studi di farmacologia preclinica (in particolare le indagini di I/O) per fornire una maggiore traducibilità. Questo rapporto mira ad aiutare i lettori/pubblico interessato di essere in grado di visualizzare direttamente le procedure tecniche che possono essere utilizzate nelle loro rispettive ricerche. Nostri protocolli dimostrano che orthotopic l'impianto del.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori sono dipendenti a tempo pieno di corona Bioscience, Inc.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Dr. Jody Barbeau - per la lettura critica e di editing del manoscritto e grazie Ralph Manuel per la progettazione di opere d'arte. Gli autori vorrei anche ringraziare il team corona Bioscience oncologia Immuno-Oncology Biomarker e oncologia In Vivo , per i loro grandi sforzi tecnici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Macchina per anestesia | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Piastra di Petri | \ | \20 | mm |
| 100x antibiotici e antimicotici | \ | \ | |
| \Tamponi iodophor\ | \ | Acquisto quotidiano in farmacia | |
| Tamponi imbevuti di alcol | \ | \Acquisto | |
| giornaliero in farmaciaAzoto liquido | Aria chimica | \ | \Cappa |
| biosicurezza | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS macchina LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| anticorpi | BD | \ | \ |
| Trevigen MD o BD Matrigel Basement Membrane Matrix Alta concentrazione | BD | 354248 | \ |
| FACS tamponi | BD | 554656 | Tampone di macinazione |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µ m |
| provetta di routine | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1,5 | |
| piastre a 6 pozzetti | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Kit Fix/Perm | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Bisturi sterili usa e getta | Jin zhong | J12100 | 11# |
| di coltello | Jin zhong | J11010 | \ |
| forbici e pinzette per gli occhi | Jin zhong | Y00030 | Forbici per gli occhi 10 cm |
| Forbici per gli occhi e pinzette | Jin zhong | JD1060 | Pinzette per gli occhi 10 cm con denti |
| Serbatoio portatile di azoto liquido | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Bilancia elettronica | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS con blocchi riscaldanti | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Kit di dissociazione tumorale | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Contatore cellulare | Nexcelom | Cellometro | Cellometro Auto T4 |
| provetta per crioconservazione | Nunc | 375418 | 1,8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| siringhe | Shanghai MIWA industria medica | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance e supporto USB | OHAUS | SE601F | Balance e supporto USB |
| Studylog-Linea dati di calibri a corsoio | Sylvac | 926.6721 | Linea dati di calibri a corsoio |
| Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro | |
| Provette da centrifuga sterilizzate | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Provette da centrifuga sterilizzate | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Secchiello per il ghiaccio | Thermo | KLCS-288 | 4 gradi C |
| Secchiello per il ghiaccio | Thermo | PLF-276-20 | C |
| Secchiello per il ghiaccio | Thermo | DW-862626-80 | C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
Riferimenti
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S.....
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Ristampe e permessi
