Articolo metodologico

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 marzo 2018

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Abstract

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Il circuito di retinotectal girino di Xenopus , comprende le cellule retiniche del ganglio (RGCs) nell'occhio che formano le sinapsi direttamente sui neuroni nel tectum ottica, è un modello popolare di studiare circuiti neurali come auto-assemblarsi. La capacità di svolgere tutta la cella le registrazioni del morsetto di patch da neuroni tectal e per registrare le risposte evocate RGC, entrambi in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello, ha generato un grande corpo dei dati ad alta risoluzione circa i meccanismi di fondo normale e anormale, circuito formazione e funzione. Qui descriviamo come eseguire la preparazione in vivo , la preparazione originale di tutto il cervello, e più recentemente sviluppato preparazione di fetta di cervello orizzontale per ottenere le registrazioni a cellula intera patch clamp da neuroni tectal. Ogni preparazione ha vantaggi unici sperimentali. La preparazione in vivo permette di registrare la risposta diretta dei neuroni tectal agli stimoli visivi proiettato sull'occhio. Permette la preparazione di tutto il cervello per gli assoni RGC deve essere attivata in modo altamente controllato, e la preparazione di fetta di cervello orizzontale permette la registrazione da attraverso tutti gli strati del tectum.

Introduzione

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Il circuito di retinotectal è il componente principale del sistema visivo anfibio. Si compone di RGCs nell'occhio, che proiettano i loro assoni al tectum ottica dove formano connessioni sinaptiche con neuroni postsinaptici tectal. Il circuito di retinotectal girino Xenopus è un popolare modello di sviluppo per studiare la funzione e la formazione di circuiti neurali. Ci sono molti attributi del circuito retinotectal di questo girino che lo rendono un potente modello sperimentale1,2,3. Un attributo importante e il focus di questo articolo, è la capacità di effettuare tutta la cella patch morsetto registrazioni da neuroni tectal, in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello. Con un impianto di perforazione di elettrofisiologia equipaggiato con un amplificatore che supporta la modalità di registrazione a morsetto di tensione e corrente, le registrazioni a cellula intera patch clamp permettono di elettrofisiologia di un neurone a caratterizzarsi ad alta risoluzione. Di conseguenza, tutta la cella patch clamp le registrazioni da neuroni tectal attraverso le fasi chiave della formazione del circuito di retinotectal hanno fornito una comprensione completa e dettagliata dello sviluppo e plasticità di intrinseca4,5 , 6 , 7 e proprietà sinaptiche8,9,10,11 . Combinando le registrazioni a cellula intera patch clamp tectal del neurone, la capacità di esprimere geni o morpholinos di interesse in questi neuroni12e un metodo per valutare il comportamento visivo guidato tramite un stabilito elusione visual test13 promuove la identificazione dei collegamenti tra molecole, circuito funzione e comportamento.

È importante notare che il tipo di alta risoluzione di dati acquisiti da registrazioni di cellula intera patch clamp non sono possibili utilizzando i più recenti approcci di imaging come l'indicatore di calcio genetica GCaMP6, perché anche se utilizzando indicatori di calcio permette l'imaging di calcio dinamiche attraverso le grandi popolazioni di neuroni simultaneamente, non c'è nessun diretto o modo ovvio che i parametri elettrici specifici possono essere ottenuti misurando la fluorescenza di delta nel somata e non c'è alcun modo per tensione morsetto il neurone per misurare rapporti corrente-tensione. Chiaramente questi due approcci distinti, registrazioni elettrofisiologiche e imaging del calcio, possiedono punti di forza non sovrapposte e generare diversi tipi di dati. Pertanto, l'approccio migliore dipende la questione sperimentale specifica affrontata.

Qui, descriviamo il nostro metodo per l'acquisizione di registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni del tectum ottica girino utilizzando una preparazione in vivo , preparazione di tutto il cervello, e una più recente modificato preparazione di tutto il cervello che è stato sviluppato nel nostro laboratorio14 . Nella sezione risultati rappresentante, dimostriamo i vantaggi sperimentali di ogni preparazione e le tipologie di dati che possono essere ottenuti. I limiti e i punti di forza di preparazioni differenti, così come suggerimenti per la risoluzione dei problemi, sono inclusi nella sezione discussione.

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Wyoming. Tutte le procedure, comprese le registrazioni elettrofisiologiche, sono effettuate a temperatura ambiente, circa 23 ° C. Tutti i metodi descritti qui sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15).

1. preparazione in Vivo

  1. Anestetizzare il girino.
    1. Posizionare il girino in un piccolo piatto di Petri contenente soluzione di Steinberg con 0.01% MS-222 per circa 5 min.
      Nota: MS-222 aka "tricaina" è un comune pesci e anfibi anestetico. I girini sono allevati nella soluzione di Steinberg in mM: 0,067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
    2. Garantire che il girino è profondamente anestetizzato (non-responsivi e non più nuoto) prima di procedere al passaggio 2.
  2. Fissare il girino anestetizzato a un blocco di silicone sommerso al piano del piatto di dissezione/registrazione.
    1. Utilizzare una pipetta monouso per spostare il girino anestetizzato in un piatto di dissezione/registrazione contenente soluzione di registrazione esterna (115mm di NaCl, KCl, spessore 2 mM 3 mM di CaCl2, 3mm di MgCl2, 5mm di HEPES, 1 mM di glucosio; regolare il pH a 7,25 utilizzando 10 N di NaOH, osmolarità 255 mOsm).
      1. Per ridurre al minimo spontanea del muscolo twitches, aggiungere il bloccante del recettore dell'acetilcolina, tubocurarina (100 µM) alla soluzione esterna. (In genere, ciò avviene mediante una pipetta di 200 µ l per aggiungere 100 µ l di uno stock di tubocurarina 10 mM a 10 mL di soluzione esterna).
    2. Utilizzando spilli entomologici, sicuro il girino, lato dorsale fino, a un blocco sommerso di elastomero di silicone (ad esempio Sylgard 184, Vedi Tabella materiali per dettagli), che è stato incollato al pavimento piatto per dissezione.
      Nota: Il posizionamento dei perni è critico: metterli su entrambi i lati del cervello, sufficientemente caudale per evitare impalare gli assoni afferenti di RGC quel progetto dall'occhio ed entrare nel cervello solo anteriore il tectum ottica (Figura 1A).
  3. Filetto del cervello lungo la linea mediana.
    1. Per una visione chiara del cervello, togliere la pelle che ricopre il cervello facendo un'incisione superficiale lungo il midline usando un ago sterile 25-G.
    2. Sfilettare il cervello sullo stesso asse del midline inserendo l'ago nel tubo neurale e tirando delicatamente verso l'alto (dorsalmente) tale che la porzione dorsale del tubo è tagliata in modo pulito (mozzata), lasciando intatta la piastra di pavimento (Figura 1B).
      Nota: È importante che la piastra di pavimento del tubo neurale rimasto intatto perché l'input sensoriali afferenti immettere il tectum tramite la piastra di pavimento.
  4. Rimuovere la membrana trasparente ventricolare che copre i neuroni tectal.
    1. Spostare il piatto di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia e utilizzare la punta di una pipetta di vetro rotto per rimuovere la membrana ventricolare che ricopre i corpi cellulari di neuroni tectal. Rompere la punta leggermente trascinandolo attraverso un tergicristallo delicato compito.
    2. Avvitare la pipetta Dispensare titolare e abbassarla verso il tectum ottica tramite il micromanipolatore.
    3. Usare la pipetta rotta per sbucciare la membrana ventricolare lontano il tectum.
      Nota: Non è necessario rimuovere la membrana dal tectum intero; una piccola finestra sarà sufficiente e fornire l'accesso a un sacco di neuroni.
  5. Ottenere l'intera cellula registrazioni di patch clamp.
    Nota: L'approccio da questo punto in avanti è simile a svolgere le registrazioni a cellula intera patch clamp da fette di cervello del topo come descritto in Segev, et al. 16 (Figura 1C).
  6. Registrare le risposte di neuroni tectal a un flash di tutto il campo di luce proiettati sulla retina.
    1. Per proiettare un lampo di tutto il campo di luce sulla retina, posto adiacente all'occhio del girino una fibra ottica. A altra estremità della fibra ottica è un LED in linea con un resistore variabile che permette per la luminanza leggera essere controllato. Attivare il LED di uscita digitale dell'amplificatore. In questo modo, tutto il campo flash di diversa intensità della luce può essere registrata (Figura 4A).

2. whole Brain preparazione

  1. Eseguire i passaggi da 1.1 a 1.3.
    Nota: Non esiste alcuna necessità di tubocurarina nella soluzione esterna per questa preparazione.
  2. Isolare il cervello.
    1. Usare un ago da 25 G per interrompere hindbrain (Figura 2A).
    2. Per isolare l'intero cervello da girino, eseguire delicatamente l'ago sotto il cervello, in direzione caudale--rostrale di recidere tutti i laterale e ventrale del tessuto connettivo e fibre nervose.
  3. Fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone.
    1. Una volta completamente liberato, fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone inserendo un pin attraverso uno dei bulbi olfattivi e un altro attraverso il hindbrain (Figura 2B). Questa è la configurazione ottima per la registrazione da neuroni tectal.
  4. Spostare il piatto contenente la preparazione appuntato intero cervello dall'ambito dissezione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Togliere la membrana ventricolare usando una pipetta di vetro rotto come descritto al punto 1.4.
  5. Posizionare un elettrodo stimolante bipolare il chiasm ottico (dove i tratti dell'assone da ogni occhio Croce al mesencefalo) per attivare direttamente gli assoni RGC.
    1. Posizionare l'elettrodo stimolante bipolare rostrale e quasi adiacente al, ventricolo medio grande. Il chiasma ottico si trova immediatamente rostral al ventricolo medio grande (Figura 2B).
      1. Abbassare delicatamente l'elettrodo stimolante giù sul chiasma tale che una piccola ammaccatura è formata nel tessuto. L'elettrodo bipolare è guidato da uno stimolatore di impulso che permette la forza di stimolazione per essere controllato con precisione.
  6. Eseguire la registrazione di morsetto di patch intera cellula (Figura 2C) come descritto da Segev, et al. 16

3. orizzontale cervello fetta preparazione

  1. Eseguire i passaggi 2.1 a 2.3.
  2. Utilizzare una lama di rasoio per asportare il quarto più laterale (che in vivo corrisponde alla quarta più dorsale) di un lato di un ottica tectum. Questo taglio è fatto parallelo al piano rostrale caudale come mostrato in Figura 3A.
  3. Re-pin il cervello al lato dell'elastomero siliconico con le fette lato rivolto verso l'alto (in modo che il somata e neuropil sono direttamente accessibili per la registrazione) e la superficie ventricolare del cervello dalla parte opposta del blocco di elastomero di silicone (Figura 3 B) (in modo che un elettrodo bipolare può essere posizionato su chiasm ottico).
  4. Eseguire l'intera cellula patch morsetto o registrazione potenziali archiviato locale (Figura 3C) come descritto da Segev, et al. 16

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Risultati

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Per registrare le risposte evocate luce un lampo di tutto il campo di luce viene proiettato la retina, mentre la risposta risultante viene registrata da singoli neuroni tectal (Figura 4A). Questo particolare protocollo è progettato per misurare sia la risposta del neurone alla luce accensione ("On" risposta) e quindi spegnendo 15 s più tardi per misurare la "risposta fuori." Neuroni tectal esibiscono tipicamente robusto e disattivare le rispo...

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Discussione

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Tutti i metodi descritti in questo lavoro sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15). Dalla fase 42, i girini sono sufficientemente grandi e sufficientemente sviluppati affinché i perni degli insetti possono essere posizionati su entrambi i lati del cervello per le registrazioni in vivo e di eseguire la dissezione del cervello intero. Nelle fasi precedenti, quando i girini sono e...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Supportato dalla concessione NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Microscopio da dissezione
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAnestetico generale anfibio
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificS271-3Utilizzato per preparare la soluzione di Stienberg e la soluzione esterna
Cloruro di potassio (KCl)Fisher ScientificP217-500Utilizzato per preparare la soluzione di Stienberg e la soluzione esterna
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGUtilizzato per preparare la soluzione di Stienberg e la soluzione esterna
Tetrairato di nitrato di calcio (Ca(NO3)&toro; 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GUtilizzato per preparare la soluzione di Stienberg   
Solfato di magnesio (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Utilizzato per preparare la soluzione di Steinberg
Cloruro di calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GUtilizzato per preparare la soluzione di registrazione esterna
Cloruro di magnesio (MgCl2)J.T. Baker2444-01Utilizzato per preparare la soluzione di registrazione esterna
D-glucosio anidroMallinckrodt Sostanze chimiche6066-04Utilizzato per preparare la soluzione di registrazione esterna
Tubocurarina cloridrato pentaidratoSigmaT2379Antagonista nicotinico del recettore dell'acetilcolina
Perni per insetti Strumenti discienza fine 26002-10Perni in acciaio inossidabile di diametro 0,1 mm Kit
elastomero siliconico Sylgard 184Dow Corning761028Kit monomero e agente indurente prepesato
Piastra di Petri sterile in polistirene - 60x15mmFisher ScientificAS4052Piccole piastre di Petri
Ago PrecisionGlide 25Gx5/8 (0,5 mm X 16 mm)BD305122Aghi per siringhe
1mL Slip Tip Siringa di tubercolina BD309659Siringhe sterili monouso Pipetta in
vetro borosilicatoStrumento SutterBF150-86-10HPTirato secondo le specifiche desiderate utilizzando la macchina per l'estrazione delle pipette
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marroneSutter InstrumentsP-97Fabbrica micropipette per la registrazione elettrofisiologica
Kimwipes SalvietteKimtech Kimberly-Clark34120Delicate
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BPinza amperometrica e pinza di tensione
Headstage MP-285 Manipolatore motorizzato con controller da tavoloSutter InstrumentMP-285/TControllo per headstage su impianto di elettrofisiologia
LED accoppiato a fibra (verde)ThorlabsM530F2Cavo in fibra ottica abbinato a LED verde
Elettrodo bipolare a grappolo (25µ FHC30207Elettrodo stimolante bipolare
Stimolatore ISO-FlexA.M.P.I. (Israele) Contatta il produttoreIsolatore di stimolo flessibile
Axon Instruments 700B Amplificatore MultipatchMolecular Devices2500-0157Amplificatore per la registrazione di voltage- e current-clamp 
Digidata 1322A digitalizzatoreMolecular Devices2500-135Sistema di acquisizione dati per la registrazione elettrofisiologica
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Microscopio per elettrofisiologia
Tavolo da laboratorio Micro-gTMC63-533Tavolo ad aria per microscopio per elettrofisiologia
Inspiron 620 Personal Desktop Computer con Windows 7 64-bitDellD06D001Computer con software di elettrofisiologia
c2400 Telecamera CCDHamamatsu70826-5Telecamera per dispositivo ad accoppiamento di carica per imaging elettrofisiologico
Lame da barba in acciaio inossidabile Super Platinum a ore 7GilletteCMM01049Lame di rasoio in acciaio inossidabile rivestite di platino
Pipette di trasferimentoFisher Scientific13-711-7MPipette di trasferimento monouso in polietilene

Riferimenti

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