Questo articolo presenta un protocollo semplice ed economico per il semplice isolamento e purificazione delle cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale di coniglio bianco di Nuova Zelanda.
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Articolo metodologico
Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono la fonte principale delle cellule per terapia cellulare. MSCs dal liquido sinoviale cavità articolare potrebbero essere utilizzati per l'ingegneria tissutale della cartilagine. MSCs dal liquido sinoviale (SF-MSCs) sono stati considerati promettenti candidati per rigenerazione articolare, e loro potenziale beneficio terapeutico li ha resi un tema di ricerca importante di ritardo. SF-MSCs dalla cavità del ginocchio del coniglio bianco di Nuova Zelanda può essere impiegato come un modello traslazionale ottimizzato per valutare umana medicina rigenerativa. Per mezzo di CD90-base magnetica attivato cella (MACS) tecnologie di differenziazione, questo protocollo ottiene correttamente coniglio SF-MSCs (rbSF-MSCs) da questo modello di coniglio e completamente dimostra ulteriormente il fenotipo MSC di queste cellule inducendo loro di differenziarsi per osteoblasti, adipociti e condrociti. Di conseguenza, questo approccio può essere applicato nella ricerca di biologia cellulare e tissutale utilizzando procedure e attrezzature semplici.
Introduzione
MSCs sono stati suggeriti come una preziosa fonte per la medicina rigenerativa, soprattutto per le lesioni della cartilagine. MSCs, tra cui condrociti, osteoblasti, adipociti, miociti scheletrici e viscerali cellule stromali, largamente espandere le aree per il trapianto di cellule staminali a causa della loro alta espansione tasso e multi-lignaggio differenziazione potenziali1. MSCs può essere isolato dal scheletrico muscolare, synovium, midollo osseo e del tessuto adiposo2,3,4. Risultati hanno inoltre confermato la presenza di cellule staminali mesen....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità degli orientamenti regionali del comitato etico, e tutte le procedure di animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e di utilizzo Comitato di Shenzhen secondo persone Hospital, Università di Shenzhen.
1. isolare e cultura rbSF-MSCs
-
Preparativi per la procedura di animale
- Preparare scheletricamente maturo femmina Nuova Zelanda conigli bianchi per la raccolta di rbSF-MSCs. eseguire un esame clinico dei conigli un giorno prima della procedura di anestesia e artrocentesi.
Nota: gli esami fisici dovrebbe includere peso (....
- Preparare scheletricamente maturo femmina Nuova Zelanda conigli bianchi per la raccolta di rbSF-MSCs. eseguire un esame clinico dei conigli un giorno prima della procedura di anestesia e artrocentesi.
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Risultati
Isolamento, purificazione e la cultura delle rbSF-msc:
Questo protocollo utilizza Mac per isolare rbSF-MSCs, basato sull'espressione del marcatore di superficie MSC CD90. Un diagramma di flusso del processo di isolamento, purificazione, dei rbSF-MSCs e la caratterizzazione e il protocollo di coltura in vitro è illustrato nella Figura 1.
Morfologia delle cellule d.......
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Discussione
L'esistenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale fornisce un'alternativa per la terapia cellulare. Gli studi precedenti hanno dimostrato che lesioni siti contengono una maggiore quantità di cellule staminali mesenchimali in loro liquido sinoviale, che può essere correlata positivamente con il periodo di alberino-ferita di5. MSCs nel liquido sinoviale può essere favorevole al tessuto per migliorare la guarigione spontanea dopo un infortunio18,
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalle seguenti sovvenzioni: il Natural Science Foundation della Cina (n. 81572198; N. 81772394); il fondo per la costruzione di alto livello disciplina medica della Università di Shenzhen (No. 2016031638); il fondamento di ricerca medica della provincia del Guangdong, Cina (No. A2016314); Scienza di Shenzhen e progetti tecnologici (No. JCYJ20170306092215436; No. JCYJ20170412150609690; No. JCYJ20170413161800287; No. SGLH20161209105517753; No. JCYJ20160301111338144).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso |
| MesenGro Integratore | StemRD | MGro-500 M1512 | Componente del terreno di coltura MSC |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | Terreno di differenziazione delle MSC |
| Soluzione salina isotonica | Litai, Cina | 5217080305 | Reagente per la procedura di artrocentesi della cavità |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | HyClone Inc. | SH30256,01B | PBS, privo di Ca2+/Mg2+ |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Componente del terreno di coltura MSC Soluzione di |
| iodio povidone | Guangdong, Cina | 150605 | Agente di sterilizzazione |
| 75% etanolo | Lircon, Cina | 170917 | Agente di sterilizzazione |
| 0,25% Tripsina/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Reagente di dissociazione cellulare |
| 1% Penicillina-Streptomicina | Gibco Inc. | 15140-122 | Componente del tampone di corsa MACS medio delle MSC |
| MiltenyiBiotec | 5160112089 | Contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) e 2 | |
| microsfere coniugate con anticorpi mMEDTA CD90 | MiltenyiBiotec | 5160801456 | Per la selezione cellulare attivata magneticamente |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | P2256 | Componente delle MSC condrogeniche differenziazione |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Componente della differenziazione osteogenica delle MSC |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC |
| L-prolina | Sigma-Aldrich | P5607 | 0,35 mM, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC |
| Acido L-ascorbico-2-fosfato | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC |
| 3-isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Componente della differenziazione adipogenica |
| Indometacina | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Componente della differenziazione adipogenica |
| TGFβ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC& |
| alfa;-gliceroffato | Sigma-Aldrich | G6751 | Componente della differenziazione osteogenica delle MSC |
| Anticorpo policlonale CD34, FITC coniugato | Bioss | bs-0646R-FITC | Marcatore di cellule staminali ematopoietiche |
| Membrana di topo CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 glicoproteina (marcatore delle MSC) |
| CD45 (anticorpo monoclonale) | Bio-Rad | MCA808GA | Marcatore delle cellule staminali ematopoietiche |
| Anticorpo CD105 | Genetex | GTX11415 | marcatore delle MSC |
| Alcool isopropilico | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipita l'estrazione dell'RNA fasi organiche |
| Triclorometano | Wengè, Cina | 61553 | Estratto di RNA totale |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolato di RNA totale |
| SYBR verde master mix | Takara Bio, Giappone | RR420A | per test PCR |
| Takara Bio, Giappone | RR047A | Trascritto inversamente su DNA complementare | |
| Alizarina Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Colorazione di composti di calcio |
| Toluidina Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Colorazione di tessuto cartilagineo |
| Olio Soluzione di O rosso | Sigma-Aldrich | O1391L | Colorazione del vacuolo lipidico |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separatore | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | Per la selezione di cellule attivate magneticamente |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | Per la selezione di cellule attivate magneticamente |
| Colonne MS | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | Per la selezione cellulare attivata magneticamente |
| Filtro | cellulare FALCON Inc. | 352340 | 40 μ m Emocitometro in nylon |
| ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Conteggio delle cellule | |
| Falcon Piatto da 100 mm | Corning | 353003 | Piatto per coltura cellulare Provetta |
| per microcentrifuga | Axygen | MCT-150-C | Provette per centrifuga per estrazione RNA e PCR |
| Sigma-Aldrich | 91050 | Centrifuga ad | |
| Eppendorf | 5804R | Cella | |
| centrifuga incubatore | Thermo scientific | 3111 | Coltura cellulare |
| PCR in tempo reale Strumento | Life Tech | QuantStudio Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences | 342975 | Analizzatore cellulare |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Trasferimento del liquido |
| Cilindro di clonazione | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolare e prelevare singole colonie cellulari |
| Siringa ipodermica sterile | Double-Dove, China | 131010 | Procedura di artrocentesi |
| Gabbia per conigli | Zhike, China | ZC-TGD | Trattenere il coniglio |
Riferimenti
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M.
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Ristampe e permessi
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