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Articolo metodologico

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

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DOI:

10.3791/57474

⸱

18 giugno 2018

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo viene illustrata una procedura sicura ed efficace per modificare CD133+ cellule staminali ematopoietiche. L'approccio non-virale, magnetico presentato basato su polyplex può fornire una base per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali anche per quanto riguarda il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica.

Abstract

CD133, mentre+ cellule staminali ematopoietiche (SCs) hanno dimostrate di fornire alto potenziale nel campo della medicina rigenerativa, loro tariffe bassa ritenzione dopo iniezione nei tessuti danneggiati, così come i tassi di mortalità osservati massiccia delle cellule portano a molto limitato gli effetti terapeutici. Per superare queste limitazioni, abbiamo cercato di stabilire un protocollo di base non-virali per l'ingegneria cellulare adeguata prima della loro somministrazione. La modifica di CD133 umano+ esprimendo SCs utilizzando polyplexes magnetico microRNA (miR) caricato è stato risolto per quanto riguarda l'efficienza di assorbimento e sicurezza, nonché il potenziale targeting delle cellule. Basandosi sul nostro protocollo, possiamo raggiungere velocità di assorbimento di miR alta di 80 – 90% mentre il CD133+ proprietà delle cellule staminali rimangono inalterate. Inoltre, queste cellule modificate offrono l'opzione di targeting magnetico. Descriviamo qui una procedura sicura ed altamente efficace per la modifica di CD133+ SCs. Ci aspettiamo che questo approccio per fornire una tecnologia standard per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali e per il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica (MRI).

Introduzione

CD133+ SCs rappresentano una popolazione eterogenea di cellule staminali e progenitrici con promettenti potenzialità per la medicina rigenerativa. Loro potenziale di2,di1,di differenziamento ematopoietico, endoteliale e miogenico3 consente il CD133+ cellule, per esempio, a contribuire ai processi di neovascolarizzazione attraverso la differenziazione nel formare nuovi vasi e l'attivazione di pro-angiogenica segnalazione di paracrine meccanismi4,5,6,7.

Nonostante il loro elevato potenziale dimostrato in più di 30 studi clinici approvati (ClinicalTrails.gov), il loro risultato terapeutico è ancora sotto discussione discutibile4. Infatti, un'applicazione clinica di SCs è ostacolata dalla bassa ritenzione nell'organo di interesse e voluminosa iniziale delle cellule morte5,8,9. Ingegneria del CD133 addizionale+ SCs precedente trapianto potrebbe aiutare a superare queste sfide.

Un prerequisito per una terapia cellulare efficiente sarebbe la riduzione della morte massiccia delle cellule iniziali di attecchimento delle cellule terapeutiche rilevanti10. Studi attuali hanno dimostrato una perdita immensa cella del 90-99% in organi altamente perfusi come il cervello e il cuore durante i primi 1-2 h, indipendentemente dal tipo delle cellule trapiantate o applicazione route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC di etichettatura usando nanoparticelle magnetiche (MNPs) consente una strategia innovativa non invasiva alle cellule bersaglio al sito di interesse22,23,24,25,26 e contemporaneamente consente il cellulare monitoraggio utilizzando MRI27 e particelle magnetiche (MPI) di imaging. Il più efficiente in vivo studi applicando magnetizzata cella cella utilizzata ritenzione di targeting dopo amministrazione locale anziché orientamento di cella dopo iniezione endovenosa23,24,28 . Di conseguenza, il nostro gruppo progettato un sistema di consegna costituito da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico29. Con questa tecnica, CD133+ SCs e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) potrebbero essere efficientemente orientate, come dimostrato da in vitro tentativi30,31.

Un altro ostacolo per terapie SC è l'ostile ambiente infiammatorio del tessuto colpito dopo trapianto, che contribuisce al iniziale delle cellule morte32. Oltre a diversi studi di pre-condizionamento, l'applicazione di terapeutici rilevanti Mir era testata33; è stato dimostrato con successo che anti-apoptotiche miRs inibire l'apoptosi in vitro e che permettono di migliorare il engraftment delle cellule in vivo33. Queste piccole molecole, composti da 20-25 nucleotidi, svolgono un ruolo cruciale come modulatori di posttranscriptional di RNA messaggeri (mRNA) e quindi influenzano il destino e il comportamento di cellule staminali34. Inoltre, l'introduzione esogena di miRs evitare l'integrazione stabile indesiderato nel genoma ospite34.

Tentativi in corso per introduzione efficiente degli acidi nucleici (NAs) nella primaria SCs sono principalmente basati su virus ricombinante8,35. Nonostante l'efficienza di trasfezione alta, manipolazione del virus ricombinante presenta un grosso ostacolo per una traduzione in panchina al capezzale, per esempio, espressione genica incontrollabile, patogenicità, immunogenicità e mutagenesi inserzionale35 ,36. Di conseguenza, sistemi di erogazione non virali come costrutti a base di polimeri sono fondamentali per sviluppare. Tra quelli, polyethylenimine (PEI) rappresenta un veicolo di consegna valido che offre vantaggi per miRs quali condensa NA di proteggere dalla degradazione, l'assorbimento cellulare, e rilascio intracellulare attraverso endosomal fuga37,38. Inoltre, complessi di miR-PEI ha dimostrato un'elevata biocompatibilità in studi clinici39. Di conseguenza, il nostro sistema di consegna è costituito da un biotinilati ramificati 25 kDa PEI associato a un rivestite con streptavidina MNP-core30,31,40.

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo che descrive (i) l'isolamento manuale di CD133+ SC da umane del midollo osseo (BM) donazione con una dettagliata caratterizzazione del prodotto SC e (ii) una strategia efficace e delicata la transfezione di un sistema di consegna a base di polimeri magneticamente non-virali per l'ingegneria genetica del CD133+ SCs utilizzando miRs. CD133+ SCs sono isolati e magneticamente arricchita da aspira BM umano sternale utilizzando una superficie anticorpo-basato magnetico-attivato delle cellule (MACS) sistema di smistamento. In seguito, l'attuabilità delle cellule come pure la purezza delle cellule è analizzata mediante citometria a flusso. Successivamente, miR/PEI/MNP complessi sono preparati e CD133+ SCs transfected. 18 ore dopo la trasfezione, l'efficienza di assorbimento e l'impatto della transfezione sulla vitalità delle cellule e l'espressione marcatore di SC sono analizzati. Inoltre, la valutazione della distribuzione intracellulare dei composti complessi transfezione viene eseguita utilizzando etichettatura quadricromia e microscopia strutturata di illuminazione (SIM).

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Protocollo

BM umano sternale per isolamento delle cellule è stata ottenuta da donatori informati, che hanno dato il loro consenso scritto di utilizzare i loro campioni per la ricerca secondo la dichiarazione di Helsinki. Il comitato etico dell'Università di Rostock ha approvato lo studio presentato (reg. n. A 23 2010, prolungato nel 2015).

1. cella preparazione

Nota: Utilizzare eparina sodica (BM 250 IU/mL) per impedire la coagulazione per esame di BM.

  1. CD133+ SC isolamento
    1. Preparazione delle soluzioni richieste
      1. Preparare il tampone fosfato salino (PBS) / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) stock soluzione (2 mM) mescolando 996 mL di PBS 1x con 4 mL di EDTA (0,5 M). Vigorosamente miscelare la soluzione e filtrato con un filtro da 0,45 µm. Conservare a temperatura ambiente (TA).
      2. Preparare il tampone di MACS mescolando 995 mL di PBS/EDTA da 2 millimetri con 5 g di albumina di siero bovino (BSA). Vigorosamente miscelare la soluzione e filtrato con un filtro da 0,45 µm. Conservare a 4 ° C.
      3. Preparare soluzione di riserva della collagenosi B (40 mg/mL) diluendo 500 mg di collagenasi B (da Clostridium histolyticum) in 12,5 mL di PBS. Miscelare la soluzione vigorosamente, rendere le aliquote di 350 µ l e conservare a-20 ° C.
      4. Preparare deossiribonucleasi (DNAse) stock soluzione (10 mg/mL) diluendo 100 mg di dnasi I (dal pancreas bovino) in 10 mL di PBS. Miscelare la soluzione vigorosamente, rendere le aliquote di 350 µ l e conservare a-20 ° C.
    2. Digestione enzimatica di BM umano
      1. Pre-riscaldare il mezzo di linfociti umani a RT e scongelare gli enzimi (1 aliquota ogni di collagenasi B e dnasi / 20 mL BM).
      2. Raccogliere il BM da siringhe in una provetta conica da 50 mL e mescolare delicatamente. Eliminare eventuali coaguli esistenti.
        Nota: Trasferire 200 µ l di BM non diluito in una provetta da 1,5 mL per l'analisi citofluorimetrica. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      3. Trasferire 10 mL BM in una nuova provetta conica 50 mL, aggiungere 6 mL di PBS/EDTA (2 mM), 20 mL di mezzo di linfociti umani, 175 µ l di collagenasi B (40 mg/mL) e 175 µ l della dnasi I (10 mg/mL). Delicatamente mescolare la soluzione e incubare per 30 min a RT su un agitatore. Ripetere per il restante campione di BM.
    3. Centrifugazione in gradiente di densità
      1. Adescare un tubo di centrifugazione su gradiente di densità 50 mL applicando 15ml del linfocita umano medio la separazione in una provetta da 50 mL. Centrifugare a 1.000 x g per 30 s.
      2. Strato con attenzione 35 mL di diluito BM in cima al filtro tubo mediante centrifugazione in gradiente di densità e centrifugare a 445 x g per 35 minuti a TA.
        Nota: Le impostazioni della centrifuga sono bassa accelerazione (3) e nessun freno (1).
      3. Rimuovere con cautela il tubo da centrifuga senza agitazione. Eliminare attentamente ~ 20 mL di soluzione limpida superiore senza toccare lo strato nuvoloso direttamente sopra il filtro.
      4. Attentamente trasferire lo strato nuvoloso (che è direttamente sopra il filtro e contiene le cellule mononucleari (MNCs)) in una nuova provetta conica 50 mL e riempire con PBS/EDTA ad un volume finale di 50 mL.
        Nota: Combinare tutti i MNCs da un campione clinico di BM in una nuova provetta.
      5. Contare i MNCs trasferendo 10 µ l di sospensione cellulare 50 mL in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di acido acetico al 3% con blu di metilene. Delicatamente mescolare e applicare 10 µ l in una camera di conteggio. Calcolare il numero di multinazionali.
      6. Centrifugare la sospensione MNC a 300 x g per 10 min. eliminare il supernatante.
        Nota: Durante la centrifugazione, raffreddare la centrifuga da RT a 4 ° C.
    4. Selezione magnetica di CD133+ SCs utilizzando umano CD133 anticorpo-collegato superparamagnetiche ferro destrano particelle
      Nota: Durante questa fase, lavorare sul ghiaccio. Soluzioni di Store fino all'utilizzo a 4 ° C. Negozio Mac a magnete permanente e colonne di separazione pre-separazione filtro a 4 ° C.
      1. Scegliere la dimensione della colonna. Per < 1.2 x 108 MNCs, utilizzo di colonne di MS e per > 1.2 x 108 MNCs, utilizzare colonne di LS (Vedi Tabella materiali).
      2. Per preparare della selezione magnetica per numero totale delle cellule di 1 x 108 , Risospendere accuratamente MNCs in 300 µ l di tampone di MACS (4 ° C). Aggiungere 100 µ l di FcR reagente di blocco (4 ° C) e particelle di 100 µ l CD133 anticorpo-collegato superparamagnetiche ferro destrano (4 ° C).
      3. Delicatamente mescolare la sospensione cellulare ed incubare per 30 min a 4 ° C. Agitare delicatamente la sospensione cellulare durante l'incubazione (2 – 3 volte).
      4. Aggiungere 2 mL di buffer di MACS (4 ° C) 1 x 108 totale che MNCs. mescolare delicatamente la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
      5. Impostare il magnet holder MACS e fissare il magnete permanente di MACS. Installare la colonna MACS e applicare il filtro pre-separazione sulla parte superiore.
      6. Equilibrare la prima colonna di MACS MS/LS e filtro pre-separazione con 0,5 mL (MS) o (LS) da 3 mL di tampone di MACS (4 ° C).
        Nota: Non lasciare le colonne MACS per asciugarsi dopo l'equilibratura.
      7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 500 µ l di tampone di MACS (4 ° C) per la quantità totale delle cellule di 1 x 108 . Applicare la sospensione cellulare nel filtro pre-separazione.
      8. Lavare il filtro di colonna e pre-separazione di MACS tre volte utilizzando, per ogni lavaggio, 0,5 mL (MS) o 3 mL (LS) di MACS tampone (4 ° C).
        Nota: Durante la terza fase di lavaggio, installare una seconda colonna di MACS nel magnete permanente MACS ed equilibrare la seconda colonna di MACS MS/LS con 0,5 mL (MS) o da 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      9. Gettare il filtro pre-separazione.
      10. Eluire la frazione di cella direttamente sulla seconda colonna MACS: aggiungere 1 mL (MS) o buffer di MACS 5ml (LS) (4 ° C) nella prima colonna MACS e rimuovere la colonna di MACS dal magnete permanente MACS. Immediatamente trasferire la prima colonna di MACS sopra la seconda colonna di MACS e spingere la sospensione cellulare attraverso la colonna Mac utilizzando lo stantuffo fornito.
      11. Lavare la colonna di MACS tre volte, utilizzando per ogni lavaggio 0,5 mL (MS) o Mac (LS) da 3 mL Tampone (4 ° C).
      12. Eluire la frazione di cella dalla colonna aggiungendo 1 mL (MS) o buffer di MACS 5ml (LS) (4 ° C) nella seconda colonna di MACS e rimuovendo la colonna MACS dal magnete permanente MACS. Immediatamente trasferire la seconda colonna di MACS sopra una provetta da 1,5 mL (MS) o la provetta conica da 15 mL (LS) e spingere la sospensione cellulare attraverso la colonna Mac utilizzando lo stantuffo fornito.
      13. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Attentamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l di tampone di MACS (4 ° C).
      14. Contare il CD133+ cellule: trasferire 6 µ l della sospensione delle cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 6 µ l di soluzione di blu di trypan (0,4%). Delicatamente mescolare e applicare 10 µ l in una camera di conteggio. Calcolare il numero di CD133+ cellule.
      15. Memorizzare il CD133+ celle su ghiaccio fino alla semina.
  2. Caratterizzazione di recente isolate CD133+ SCs
    Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim). Mantenere i tubi, buffer e anticorpi su ghiaccio salvo diversa indicazione.
    1. Preparazione di SCs per l'analisi cytometric di flusso
      1. Utilizzare due campioni (ogni 10 µ l) di aliquote di BM e un campione di recente isolate CD133+ SCs (minimo, 1 x 104 cellule) per l'analisi. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di Reagente Bloccante FcR e riempire con buffer di MACS (4 ° C) per un volume di 33 µ l.
      2. Aggiungere i seguenti anticorpi sul lato interno del rispettivo tubo (vedere tabella 1): anti-CD34-isotiocianato di fluoresceina (FITC) (clone: AC136), anti-CD133/2-ficoeritrina (PE) (clone: 293 3), isotype controllare mouse IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (clone: 2D 1) e 7-aminoactinomycin (AAD). Dopo aver aggiunto tutti gli anticorpi, agitare giù il lato di anticorpi del tubo. Delicatamente mescolare la soluzione (volume finale 50 µ l) e incubare per 10 min a 4 ° C.
      3. Aggiungere 1 mL di buffer di lisi di globuli rossi (RBC) x 1, delicatamente mescolare la sospensione e incubare in ghiaccio 10 min. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
      4. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l PBS (4 ° C). Conservare il ghiaccio fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
    2. Analisi citofluorimetrica del CD133+ SCs
      1. Per esaminare la vitalità cellulare e la purezza del CD133+ SC, utilizzare un adattato della società internazionale di Hematotherapy e innesto Engineering (ISHAGE) flusso cytometry gating strategia41 (vedere la raffigurazione rappresentanza nella Figura 1). Utilizzare il seguente ordine:
        Passaggio 1: selezione della popolazione delle cellule (Figura 1A)
        Fase 2: selezione di CD45+ cellule (Figura 1B)
        Passo 3: selezione di CD45 vitali+ cellule (Figura 1)
        Passaggio 4: selezione di CD45 vitali+/CD34+ cellule (Figura 1)
        Fase 5: selezione di CD45 vitali+/CD34+/CD133+ cellule (Figura 1E)
        Eseguire cytometer di flusso (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
      2. Calcolare l'attuabilità delle cellule e la purezza utilizzando le seguenti equazioni:

figure-protocol-1   Equazione 1

figure-protocol-2   Equazione 2

  1. Colture cellulari di recente isolate CD133+ SCs
    1. Aliquotare 100x ricombinante umana di citochina supplemento in aliquote di 100 µ l e conservare a-20 ° C. Disgelo uno 100 x aliquota prima della preparazione media.
    2. Preparare il CD133+ SC cultura medium, medium di espansione di cellule ematopoietiche privo di siero completate con supplemento di citochina umana ricombinante (1x finale) e 1% di penicillina/streptomicina.
    3. Seme 5 x 104 appena isolato CD133+ SCs per la transfezione in una piastra a 24 pozzetti con 500 µ l di coltura. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 e 20% O2.
      Nota: Seme 5 x 104 appena isolato CD133+ SCs come controllo per analisi cytometric di flusso.

2. preparazione di complessi di transfezione

Nota: Durante questa fase, tenere la ribonucleasi di spazio di lavoro intero (RNasi)-gratuitamente utilizzando la soluzione di decontaminazione di RNAsi e utilizzare solo RNAsi-libera materiale di consumo.

  1. Preparazione di miR
    Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
    Nota: per l'esemplare di miR: uso cianina 3 tingere contrassegnati precursore miR e miR precursore senza etichetta.
    1. Per preparare la soluzione di riserva di miR (50 µM), diluire la quantità desiderata di miR nel volume appropriato di acqua esente da nucleasi (ad es., diluire 5 nmol di miR in acqua di 100 µ l). Delicatamente mescolare la soluzione, aliquota il brodo di miR (5 µ l) e conservare a temperatura inferiore a-20 ° C.
  2. Preparazione di PEI
    1. Preparare il PEI seguendo protocolli standard e nota il PEI concentrazione stock31,42 .
  3. Preparazione di MNP
    1. Preparare l'allontaneranno seguendo protocolli standard e notare la MNP concentrazione stock31,42.
  4. Preparazione di complessi di miR/PEI
    1. Preparare soluzione glucosata al 5% diluendo D-(+)-glucosio in acqua priva di nucleasi. Delicatamente mescolare la soluzione, aliquota il brodo (1,5 mL) e conservare a 4 ° C.
      Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
    2. Utilizzare 20 pmol miR per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti30. Diluire miR della soluzione di glucosio 5% ad una concentrazione finale di 0,25 pmol miR / µ l.
    3. Calcolare la quantità di PEI necessaria basata sulla quantità di miR (20 pmol, punto 2.3.1) e azoto ottima (di PEI) al fosfato (di miR) rapporto (N/P) sulla base della concentrazione di stock di PEI (punto 2.2.1; qui, un rapporto di 7.5 è stato usato)30. Diluire il PEI in una quantità uguale di soluzione glucosata al 5% basati sull'equazione:
      figure-protocol-3
      che riorganizza per
      figure-protocol-4    Equazione 3
      dove PEI volume è in µ l e [PEI] è in mM e N/P (ottimizzato per questo protocollo) è di 0,75. 0.12 è un fattore di conversione specifico a miR.
    4. Aggiungere il PEI pre-diluito nella pre-diluito miR e vortexare per 30 s.
    5. Incubare il miR/PEI complessi per 30 minuti a TA.
  5. Preparazione dei complessi miR/PEI/MNP
    Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
    1. Mentre incubando i complessi di miR/PEI, preparare l'allontaneranno sonicating allontaneranno per 20 min a 35 kHz nel bagno d'acqua sonicating a RT affinché che siano le particelle in sospensione e non aggregando.
    2. Calcolare il numero di richieste allontaneranno (ferro 3 µ g/mL) basato sulla soluzione stock MNP (punto 2.3.1).
    3. Aggiungere l'allontaneranno lisati mediante nella complessi di miR/PEI e vortex per 30 s. Incubare i complessi di miR/PEI/MNP per 30 minuti a TA.
  6. Preparazione dei complessi di transfezione per etichettatura quadricromia utilizzando SIM
    Nota: Utilizzare miR precursore senza etichetta.
    1. Etichettare la miR con cianina 5 tintura utilizzando un'etichettatura per la miR della tintura di cianina 5 kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione di miR finale utilizzando lo spettrofotometro elencato (Vedi Tabella materiali) in accordo con pre-l'impostazione fornito dal produttore (acido nucleico, RNA-40). Aliquota che del miR (5 µ l) e conservare a-80 ° C al riparo dalla luce.
    2. Etichettare il PEI con una brillante fluorescenza verde colorante mediante un'etichettatura appropriata della proteina kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore. Definire la concentrazione finale di PEI usando l'analisi di ninidrina (punto 2.2.1). Aliquota del PEI (nel volume calcolato sulla base equazione 3) e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.
    3. Etichetta l'allontaneranno con rodamina colorante coniugato alla biotina utilizzando un rapporto di 1:1,000 w/w, tingere a MNP. Mescolare la tintura di rodamina e allontaneranno in concomitanza con la preparazione della formazione del complesso di miR/PEI e incubare la soluzione per 30 min al buio. Utilizzare direttamente con etichetta allontaneranno.

3. la transfezione di CD133+ SCs

Nota: Durante questa fase, tenere la ribonucleasi di spazio di lavoro intero (RNasi)-gratuitamente utilizzando la soluzione di decontaminazione di RNAsi e utilizzare solo RNAsi-libera materiale di consumo
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).

  1. Aggiungere goccia a goccia il complesso miRNA/PEI/MNP preparato direttamente nel pozzetto corrispondente contenente il CD133 appena isolate+ SCs in terreno di coltura.
  2. Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra. Incubare le cellule per 18 h a 37 ° C, 5% CO2 e 20% O2.

4. analisi del miR transfezione

  1. Esame dell'efficienza di assorbimento di miR e la citotossicità dei complessi di transfezione
    Nota: per l'esemplare di miR: uso della tintura di cianina 3 etichettata miR precursore per la valutazione di assorbimento e non trasfettate CD133+ SCs per i cancelli di controllo di flusso cytometry.
    Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
    Nota: Mantenere i tubi, buffer e anticorpi il ghiaccio se non diversamente specificato.
    1. Preparare la soluzione di riserva di paraformaldeide (PFA, 4%) diluendo 4G PFA in 100 mL di PBS e riscaldando la soluzione a 80 ° C. Vigorosamente miscelare la soluzione e regolare il pH a 7,3. Aliquotare il PFA stock (1,5 mL) e conservare a-20 ° C.
    2. 18 ore dopo la trasfezione, raccogliere ogni pozzetto in un separato da 1,5 mL tubo. Lavare ogni bene una volta con 500 µ l di PBS e trasferire la sospensione cellulare al tubo stesso.
    3. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l di tampone di MACS di 4 ° C.
    4. Aggiungere 0,5 µ l di un colorante reattivo di ammina per distinguere tra cellule vivi e morte, delicatamente mescolare la sospensione e incubare per 10 min a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di PBS (4 ° C) e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
    5. Eliminare il supernatante, risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l PBS, µ l 33 PFA (4%) e conservare in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
    6. Organizzare la strategia di gating secondo la rappresentazione rappresentativa nella Figura 2. Eseguire gli esempi sul citofluorimetro (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  2. Caratterizzazione del CD133 miR-transfettate+ SCs
    Nota: Usato miR precursore senza etichetta come pure non trasfettate CD133+ SCs per cancelli di controllo di flusso cytometry.
    1. Raccogliere ogni bene in un tubo separato 1,5 mL e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
    2. Utilizzare la strategia di gating come descritto al punto 1.2.
  3. Esame della distribuzione intracellulare di complessi di transfezione di SIM
    1. Preparare i complessi e transfect le celle come descritto nella sezione 2 e sezione 3.
    2. 18 ore dopo la trasfezione, raccogliere ogni pozzetto in un separato da 1,5 mL tubo. Lavare ogni bene una volta con 500 µ l di PBS e trasferire il lavaggio nel rispettivo tubo del pozzo. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
    3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 1 mL di 2% siero bovino fetale (FBS) in PBS, delicatamente mescolare la sospensione e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
    4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l di PBS aggiungere µ l 33 PFA (4%) per 20 min.
    5. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra 24-cultura contenente lamelle di vetro sterile e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
    6. Scartare il surnatante e aggiungere 500 µ l di PBS. Agitare la piastra delicatamente e scartare PBS.
    7. Posizionare i coprioggetti preparati sui vetrini al microscopio utilizzando montaggio acquoso mantenere fluorescenza e asciugare a temperatura ambiente per almeno 1 h.
    8. Acquisire immagini utilizzando un obiettivo a immersione in olio X 100. Impostazioni SIM: 405, 488, 561 e 633 nm laser linee per eccitazione e z-pile con una profondità di 16 bit a 3 angolazioni, 3 fasi, con una media di 4, griglie per linea laser: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.

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Risultati

Il protocollo presentato descrive un isolamento manuale e arricchimento magnetico del CD133 BM-derivati umani+ SCs con una cellula indipendente virus successivi ingegneria strategia, come una tecnologia non invasiva per in vitro manipolazione cellulare e in vivo strumento di monitoraggio.

Questa tecnologia di isolamento di tre fasi consente una separazione delle MNCs da BM sternal pre-digeriti median...

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Discussione

Negli ultimi anni, CD133+ SCs sono emersi come una popolazione di cellule promettente per terapie basate su SC come evidenziato da diversi di fase I, II e III studi clinici43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale dell'educazione e ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), la Pomerania Mecklenburg-occidentale dello stato con fondi strutturali (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e il DFG (DA1296/2-1), la Fondazione tedesca del cuore (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) e la Fondazione umida. Inoltre, F.H. e P.M. sono supportati dal foro con. rar programma di Rostock University Medical Centre (889001).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
7-AADBD Biosciences559925
Acido acetico con tecnologiedi cellule staminali70603%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)BD Biosciences
colorante di rodamina; Colorante Atto 565 coniugato alla biotinaATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII citometroa flusso BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 particelle di destrano superparamagnetico legate agli anticorpi; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
collagenasi BRoche Diagnostics GmbH11088831001
camera di conteggioPaul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cianina 3 colorante marcato precursore miR; Cy3 Dye-Marcato Pre-miR Controllo negativo #1AmbionAM17120
Kit di etichettatura miR colorante Cyanine 5; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling KitMirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 microscopio confocaleCarl Zeiss Jena GmbH
FcR Reagente, umanoMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
kit di marcatura delle proteine verde brillante; Oregon Green 488 Kit di Etichettatura ProteicaThermo Fisher ScientificO10241
terreno di montaggio acquoso; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
provetta per centrifugazione a gradiente di densità; Leukosep Provetta per centrifugaGreiner Bio-One89048-932
Supporto magnetico MACS; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
Filtro di pre-separazione MACSMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 &; m
Colonna di separazione MACS (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
Magnete permanente MACS; Separatore MACSMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Filtro PVDF Millex-HVMerckSLHV013SL0,45 μ m
topo IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
colorante reattivo all'ammina; Kit per colorante di cellule morte fissabile Near-IR LIVE/DEADThermo Fisher ScientificL10119
terreno di separazione dei linfociti umani; PancollPan Biotech GmbHP04-60500densità: 1,077 g/mL
PBSPan Biotech GmbHP04-53500senza Ca e Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727ramificato; 25 kDa
Penicillina/StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μ g/mL
di PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
miR precursore non marcato; Controllo negativo del precursore del precursore del pre-miR miRNA #1AmbionAM17110
tampone di lisi dei globuli rossieBioscience00-4333-57
Soluzione di decontaminazione dell'RNAsi; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
terreno linfocitario umano; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumPan Biotech GmbHP04-16500
integratore di citochine umane ricombinanti; Terreno di espansione per cellule ematopoietiche StemSpan CC100 StemcellTechnologies2690
privo di siero; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptavidina MagneSphere Particelle paramagnetichePromega CorporationZ5481
Soluzione di tripano bluSigma-Aldrich GmbHT81540,4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200,5 M; pH 8,0
ZEN2011 softwareCarl Zeiss Jena GmbH
Spettrofotometro NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH bagnomaria sonicanteBandelin electronicPotenza nominale ultrasonica: 80 W; Frequenza ultrasonica: 35 kHz
blu di metilene 560178

Riferimenti

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