Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il ciclo di vita di Leishmania, l'agente eziologico della leishmaniosi, alterna fasi promastigote ed amastigote all'interno l'insetto e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Mentre patogeni sintomi della leishmaniosi possono variare ampiamente, da lesioni cutanee benigne a forme altamente fatale malattia viscerale a seconda della specie infettiva, tutte le specie di Leishmania risiedono all'interno di host macrofagi durante la fase di vertebrati di il ciclo di vita. Leishmania infettività pertanto è direttamente correlata alla sua capacità di invadere, sopravvivere e replicare all'interno di vacuoli parasitophorous (PVs) all'interno dei macrofagi. Così, valutando la capacità del parassita di replicare intracellulare serve come un metodo affidabile per determinare la virulenza. Studiare lo sviluppo di leishmaniosi utilizzando modelli animali è lungo, noioso e spesso difficile, specialmente con il patogeno importante forme viscerali. Descriviamo qui una metodologia per seguire lo sviluppo intracellulare di Leishmania in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi). Parassita intracellulare numeri sono determinati a intervalli di 24 h per 72-96 ore dopo l'infezione. Questo metodo consente una determinazione affidabile degli effetti di vari fattori genetici sulla virulenza di Leishmania . Ad esempio, mostriamo come un'omissione di singolo allele del gene del trasportatore mitocondriale di ferro Leishmania (LMIT1) altera la capacità del ceppo mutante Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 a crescere all'interno di saggi, riflettendo una drastica riduzione nella virulenza rispetto al wild type. Questo test consente inoltre un controllo preciso delle condizioni sperimentali, che possono essere manipolati individualmente per analizzare l'influenza di vari fattori (nutrienti, specie reattive dell'ossigeno, ecc.) sull'interazione ospite-patogeno. Pertanto, l'esecuzione appropriata e la quantificazione degli studi infezione BMM forniscono un'alternativa non invasiva, veloce, economica, sicura e affidabile agli studi di modello animali convenzionali.
Introduzione
La leishmaniosi si riferisce ad un ampio spettro di malattie umane causate da specie di protozoo parassita del genere Leishmania. Circa 12 milioni di persone sono attualmente infettati con Leishmania in tutto il mondo, e più di 350 milioni sono a rischio. La patologia della malattia dipende dalla specie di Leishmania e fattori dell'ospite, e sintomi variano da lesioni cutanee autorigenerante innocuo a forme visceralizing letali. Se non trattata, viscerale di leishmaniosi è fatale, classifica solo dopo la malaria come la più letale malattia umana causata tramite l'infezione con un protozoo parassita1. Nonostante le dif....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da National Institutes of Health e sono state approvate dall'IACUC di Università del Maryland. Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 4 dovrebbero essere eseguiti in modo sterile all'interno biologica a flusso laminare. Protezione personale dovrebbe essere usato, e deve prestare attenzione durante la manipolazione di parassiti di Leishmania vivi durante tutte le fasi di sperimentazione.
1. isolamento e la differenziazione dei macrofagi derivate da midollo osseo (saggi)
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Leishmania ha due forme infettive - metacyclic promastigotes che differenziano da prociclico promastigotes presso la fase stazionaria della cultura e amastigoti, che sono le fasi intracellulari (Figura 1). In alcune specie di Leishmania come L. amazonensis, amastigoti possono essere differenziate anche in coltura axenica a spostando le celle promastigote per abbassare il pH (4.5) e temperatura elevata (32 ° C), condizioni simili a q.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I dati quantitativi di prodotto da BMM infezione dosaggio descritto in precedenza, consente ai ricercatori di ottenere tassi di infezione e una determinazione affidabile delle modifiche nelle proprietà di virulenza in un relativamente breve periodo di tempo (massimo 2 settimane, rispetto al 2 mesi previsti per gli esperimenti in vivo ). Questo metodo si basa sul colorante specifico DNA DAPI, che in particolare i nuclei del macrofago e parassita di macchie e permette la rapida identificazione e quantificazione de.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari,
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute RO1 AI067979 a NWA.
YK è destinatario della borsa di studio dello studente non laureato da Howard Hughes Medical Institute/Università di Maryland College Park.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Punte per pipette con barriera all'aerosol (100-1000 μ L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Punte per pipette con barriera per aerosol (20-200 μ L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Punte per pipette con barriera all'aerosol (2-20 μ L) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Lama chirurgica in acciaio al carbonio #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Siringa | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Piatto per colture cellulari 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Pallone per colture cellulari | Cellstar | 660175 | |
| Bicchieri di copertura: cerchi da 12 mm | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotina | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alcool etilico 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non trattato TC-trattato Piastra di Petri in polistirene Corning | 351029 | ||
| Siero fetale bovino | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | E200 | |
| Capra anti-topo IgG Texas rosso | Invitrogen | T-862 | |
| Capra anti-coniglio IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluente | Beckman Coulter | ||
| L-Glutammina | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na piruvato (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldeide | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gemini | 400-109 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Provette da centrifuga coniche in polipropilene 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Provette da centrifuga coniche in polipropilene 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| Reagente antisbiadimento ProLong Gold | ThermoFisher | P36930 | |
| Anticorpo Lamp-1 anti-topo per ratto | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi | 1D4B | |
| Umano Ricombinante M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Emocitometro | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Tensioattivo | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Forbici delicate, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Pinze da dissezione, punta fine | VWR | 82027-386 | |
| Vetrini per microscopio | VWR | 16004-368 | |
| Contatore di particelle Z1 Coulter, doppia soglia | Beckman Coulter | 6605699 |
Riferimenti
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
