Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell'espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.
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Articolo metodologico
Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Controllo preciso dell'espressione del transgene è auspicabile in studi biologici e clinici. Tuttavia, poiché la funzionalità binaria di gene attualmente impiegati interruttori richiede il trasferimento di due unità di espressione terapeutica simultaneamente in una singola cella, l'applicazione pratica del sistema per la terapia genica è limitato. Per semplificare il sistema di espressione del transgene, abbiamo generato un interruttore gene designato come pEUI(+) che comprende un set completo di moduli di espressione del transgene in un singolo vettore. Che comprende il dominio di legame al DNA di GAL4 e modificate EcR (GvEcR), un dominio di attivazione VP16 minimal fuso con un dominio di legame al DNA di GAL4, così come un recettore di ecdisone di Drosophila (EcR), modificato l'opzione di nuova concezione singolare gene è altamente sensibile alla somministrazione di un induttore chimico in un modo dipendente dal tempo e dal dosaggio. Il vettore di pEUI(+) è uno strumento potenzialmente potente per migliorare il controllo dell'espressione del transgene in studi pre-clinici e ricerca biologica. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la modulazione di un'espressione del transgene transiente e stabile utilizzando il vettore pEUI(+) dal trattamento di tebufenozide (Teb). Inoltre, condividiamo importanti linee guida per l'uso di Teb come un induttore chimico.
Introduzione
Numerose opzioni differenti del gene sono stati esplorati per la loro capacità di regolare con precisione l'espressione del transgene in colture cellulari e modelli animali, con vari gradi di successo1,2,3. Sistemi di interruttori potenziale gene devono soddisfare diversi criteri rigorosi, tra cui: direzionale precisa espressione del transgene, la risposta dose - e tempo-dipendente di induttori, trascurabile permeabilità del promotore, reversibilità del transgene attivazione attraverso la rimozione di induttore e livelli di tossicità induttore tollerabili da linee cellulari e....
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Protocollo
1. Transgene Subcloning
- Scegli un sito di riconoscimento degli enzimi di limitazione appropriato (o siti) a MCS di pEUI(+) e subclone il gene di interesse nella direzione desiderata (Figura 1).
Nota: Il ankyrin epitopo-etichetta EGFP o bandiera ripetere dominio 13A transgene (ANKRD13A) è stato subclonato nel sito EcoRI del vettore pEUI(+) tramite T4 DNA polimerasi in una sequenza e legatura-indipendente dalla clonazione metodo19. - Linearizzare il pEUI(+) con EcoRI per 1h a 37 ° C. Mix 50 ng / µ l di linearizzato pEUI(+) con 40 ng / µ l di PCR-amplificato EGFP o A....
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Risultati
L'interruttore GvEcR-based singolare gene è raffigurato in Figura 1A. Il vettore di pEUI(+) è stato ottimizzato per l'espressione del transgene regolamentato dal trattamento con Teb. La regione dell'effettore di pEUI(+) comprende un 10xUAS e un E1b promotore minimo seguita da un MCS contenenti siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII. Un segnale di poli (a) di SV40 è stato aggiunto dietro il MCS (
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Discussione
Lo svantaggio principale dell'utilizzo di un interruttore di espressione genica binario è la necessità di trasportare contemporaneamente due plasmidi separati (driver ed effettrici) nella cella di destinazione. Questo può portare a una distribuzione iniqua dei plasmidi e causare una risposta incoerente dell'interruttore a induttori1,2,3. Altro difetto del sistema due-vector è che un minimo di due turni di selezione antibiotica s.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano S-Y Choi (Università nazionale di Chonnam) per i preziosi commenti e lettura approfondita del nostro manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di ricerca dell'Università nazionale di Chungnam.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pEUI(+) | TransLab | La licenza di brevetto è stata trasferita a TransLab Inc. | |
| Reagente di trasfezione Gene-Fect | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cilindro di clonazione | Sigma | CLS31668 | |
| Puromicina | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotici | Gibco | 15240-062 | |
| Tripsina-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Siero fetale bovino | Welgene | S001-01 | |
| Piatto per colture cellulari | SPL scienze della vita | 11090 | |
| topo FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anticorpo anti-alfa tubulina | Calbiochem | CP06 | |
| Cilindro di clonazione | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Proteina di mammifero Reagente di estrazione | Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Inibitore della proteasi . III | T& I | BPI-9200 |
Riferimenti
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system.
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Ristampe e permessi
