Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

Seoghyun Lee; Minho Won; Ran Hee Hwang; Gang Min Hur; Hyunju Ro

doi:10.3791/57494

Articolo metodologico

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

DOI:

10.3791/57494

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7 maggio 2018

Seoghyun Lee^*¹ , Minho Won^*² , Ran Hee Hwang³ , Gang Min Hur² , Hyunju Ro¹

¹Department of Biological Sciences, College of Bioscience and Biotechnology, Chungnam National University, ²Department of Pharmacology, College of Medicine, Chungnam National University, ³Department of Nursing, Gwangju Women's University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell'espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.

Abstract

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Controllo preciso dell'espressione del transgene è auspicabile in studi biologici e clinici. Tuttavia, poiché la funzionalità binaria di gene attualmente impiegati interruttori richiede il trasferimento di due unità di espressione terapeutica simultaneamente in una singola cella, l'applicazione pratica del sistema per la terapia genica è limitato. Per semplificare il sistema di espressione del transgene, abbiamo generato un interruttore gene designato come pEUI(+) che comprende un set completo di moduli di espressione del transgene in un singolo vettore. Che comprende il dominio di legame al DNA di GAL4 e modificate EcR (GvEcR), un dominio di attivazione VP16 minimal fuso con un dominio di legame al DNA di GAL4, così come un recettore di ecdisone di Drosophila (EcR), modificato l'opzione di nuova concezione singolare gene è altamente sensibile alla somministrazione di un induttore chimico in un modo dipendente dal tempo e dal dosaggio. Il vettore di pEUI(+) è uno strumento potenzialmente potente per migliorare il controllo dell'espressione del transgene in studi pre-clinici e ricerca biologica. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la modulazione di un'espressione del transgene transiente e stabile utilizzando il vettore pEUI(+) dal trattamento di tebufenozide (Teb). Inoltre, condividiamo importanti linee guida per l'uso di Teb come un induttore chimico.

Introduzione

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Numerose opzioni differenti del gene sono stati esplorati per la loro capacità di regolare con precisione l'espressione del transgene in colture cellulari e modelli animali, con vari gradi di successo¹^,²^,³. Sistemi di interruttori potenziale gene devono soddisfare diversi criteri rigorosi, tra cui: direzionale precisa espressione del transgene, la risposta dose - e tempo-dipendente di induttori, trascurabile permeabilità del promotore, reversibilità del transgene attivazione attraverso la rimozione di induttore e livelli di tossicità induttore tollerabili da linee cellulari e....

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Protocollo

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1. Transgene Subcloning

Scegli un sito di riconoscimento degli enzimi di limitazione appropriato (o siti) a MCS di pEUI(+) e subclone il gene di interesse nella direzione desiderata (Figura 1).
Nota: Il ankyrin epitopo-etichetta EGFP o bandiera ripetere dominio 13A transgene (ANKRD13A) è stato subclonato nel sito EcoRI del vettore pEUI(+) tramite T4 DNA polimerasi in una sequenza e legatura-indipendente dalla clonazione metodo¹⁹.
Linearizzare il pEUI(+) con EcoRI per 1h a 37 ° C. Mix 50 ng / µ l di linearizzato pEUI(+) con 40 ng / µ l di PCR-amplificato EGFP o A....

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Risultati

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L'interruttore GvEcR-based singolare gene è raffigurato in Figura 1A. Il vettore di pEUI(+) è stato ottimizzato per l'espressione del transgene regolamentato dal trattamento con Teb. La regione dell'effettore di pEUI(+) comprende un 10xUAS e un E1b promotore minimo seguita da un MCS contenenti siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII. Un segnale di poli (a) di SV40 è stato aggiunto dietro il MCS (

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Discussione

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Lo svantaggio principale dell'utilizzo di un interruttore di espressione genica binario è la necessità di trasportare contemporaneamente due plasmidi separati (driver ed effettrici) nella cella di destinazione. Questo può portare a una distribuzione iniqua dei plasmidi e causare una risposta incoerente dell'interruttore a induttori¹^,²^,³. Altro difetto del sistema due-vector è che un minimo di due turni di selezione antibiotica s.......

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Dichiarazioni

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Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano S-Y Choi (Università nazionale di Chonnam) per i preziosi commenti e lettura approfondita del nostro manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di ricerca dell'Università nazionale di Chungnam.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pEUI(+)	TransLab		La licenza di brevetto è stata trasferita a TransLab Inc.
Reagente di trasfezione Gene-Fect	TransLab	TLC-001
HEK293	ATCC	CRL-1573
Tebufenozide	Fluka	31652
Cilindro di clonazione	Sigma	CLS31668
Puromicina	Corning	58-58-2
Antibiotici	Gibco	15240-062
Tripsina-EDTA	Welgene	LS015-01
DMEM	Welgene	LM001-05
Siero fetale bovino	Welgene	S001-01
Piatto per colture cellulari	SPL scienze della vita	11090
topo FLAG M2	Sigma	F3165
anticorpo anti-alfa tubulina	Calbiochem	CP06
Cilindro di clonazione	Sigma	CLS31668
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410.1
M-PER Proteina di mammifero Reagente di estrazione	Thermo Fisher	78505
100X Inibitore della proteasi . III	T& I	BPI-9200

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system.

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Espressione del transgene induttore Tebufenozide cellule HEK 293 microscopia a fluorescenza analisi mediante immunoblotting sistema di espressione reversibile trattamento con induttore chimico trasfezione stabile transitoria

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