Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.
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Articolo metodologico
Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diabrotica del mais (WCR) è un parassita importante di mais ed è ben noto per la sua capacità di adattarsi rapidamente alle strategie di lotta. Anche se l'interferenza del RNA (RNAi) ha dimostrato di essere un potente strumento per lo studio della biologia WCR, ha i suoi limiti. In particolare, il RNAi sé è transitoria (cioè non provocare a lungo termine eredità mendeliana del fenotipo associato), e richiede la conoscenza della sequenza del DNA del gene target. Quest'ultimo può essere limitante se il fenotipo di interesse è controllato da geni scarsamente conservati, o anche romanzo, perché sarebbe difficile identificare gli obiettivi utili, se non impossibile. Di conseguenza, il numero di strumenti nella casella degli strumenti genomico di WCR dovrebbe essere ampliato dallo sviluppo di metodi che potrebbero essere utilizzati per creare ceppi mutanti stabile e attivare sondaggi indipendente dalla sequenza del genoma del WCR. Nel presente documento, dettagliamo i metodi utilizzati per raccogliere e microinject precellular embrioni WCR con acidi nucleici. Mentre i protocolli descritti nel presente documento sono finalizzati alla creazione di transgenici WCR, editing CRISPR/Cas9-genomico potrebbe essere eseguita anche utilizzando gli stessi protocolli, con l'unica differenza è la composizione della soluzione iniettata gli embrioni.
Introduzione
Diabrotica del mais (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, è un parassita importante di mais1. È interessante notare, WCR sembra superare controllo misure più rapidamente di artropodi di interesse agrario più poiché essi non solo adattarsi fisiologicamente ma anche comportamentale2,3,4,5, 6. nell'ultimo decennio, interferenza del RNA (RNAi), un potente strumento di genomico funzionale, è stato studiato come un metodo di controllo potenziale per WCR7,8ed è stato utilizzato anche come mezzo per studiare il gene funzione9. Tuttavia, mentre RNAi è effettuato frequentemente dal microinjection di RNA double-stranded (dsRNA) in altre specie, basati su iniezione RNAi è raro in WCR. In realtà, ci sono soltanto alcuni rapporti di RNAi tramite microiniezioni di dsRNA in WCR9. Il motivo è che WCR possono raggiungere livelli elevati di gene atterramento tramite ingestione di dsRNA7,10, permettendo anche lo studio degli effetti embrionali di alimentazione dsRNA di madre11. Mentre questo metodo rende WCR un ottimo soggetto per analisi genomica funzionale tramite RNAi, ha rallentato progressi nello sviluppo di metodologie per il microinjection embrionale in questa specie.
Nonostante la potenza del RNAi, ci sono alcuni svantaggi. Ad esempio, non tutti i geni rispondono ugualmente a RNAi. Questa variabilità può rendere l'interpretazione dei risultati di un'analisi di genomica funzionale più difficile. Inoltre, RNAi è transitoria e non genera mutazioni ereditabili. D'altra parte, la trasformazione di germline, un altro strumento di genomico funzionale, può generare mutazioni ereditabili tramite inserimento di un elemento trasponibile contrassegnato nella genoma12,13. Questo rende la trasformazione di germline un ottimo strumento per la creazione di ceppi mutanti per uso a lungo termine studi genetici. Trasformazione può essere utilizzata anche per salvare una mutazione formulando una copia funzionale del gene per un genoma mutante14. Inoltre, la trasformazione di germline è la pietra angolare di un'ampia varietà di tecniche di genetica molecolare. Oltre a buttare giù e/o salvataggio di funzione del gene, germline trasformazione può essere utilizzata per enhancer intrappolamento15, gene dell'intrappolamento16, espressione ectopica basata su Gal417e genoma mutagenesi18.
Più recentemente, sono stati sviluppati strumenti che consentono la modifica del genoma sofisticato. Questi strumenti includono trascrizione Activator-Like effettrici nucleasi (TALEN) e il sistema CRISPR/Cas9-nucleasi19,20. Il vantaggio di questi nuovi strumenti è che essi offrono ai ricercatori la capacità di indurre una rottura del DNA double-stranded in quasi qualsiasi posizione all'interno di quasi qualsiasi genoma. Una volta indotta, queste rotture possono essere riparate attraverso entrambe le estremità non-omologo entrare, che possono introdurre le eliminazioni o inserimenti nel gene mirato, o riparazione di omologia-diretto, che in presenza di un costrutto ingegnerizzato, può catalizzare la sostituzione dell'intero geni o regioni genetiche21,22. Tuttavia, questi metodi richiedono la microiniezione di DNA, RNA e/o della proteina negli embrioni molto giovani.
Cosa importante, a differenza di RNAds utilizzato per RNAi, acidi nucleici e proteine utilizzate per germline trasformazione ed editing genomico non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Di conseguenza, microiniezione di plasmide DNAs, mRNA, e/o proteine deve avvenire durante la fase di blastoderm sinciziale (cioè prima che l'embrione dell'insetto cellularizes). Questo rende la tempistica delle iniezioni un fattore critico. Ad esempio, nella Drosophila melanogaster, embrioni necessario essere iniettata entro due ore dopo uovo laici12. Di conseguenza, lo sviluppo di un protocollo di successo embrionali microiniezione per WCR deve tener conto le migliori condizioni per la posa di uovo femminile, così come il metodo migliore per la raccolta di una quantità sufficiente di embrioni precellular.
Un tentativo di portare una vasta gamma di strumenti di genetica molecolare su biologia WCR richiede lo sviluppo di metodologie di raccolta ed microinjecting precellular embrioni WCR. Qui forniamo istruzioni dettagliate, insieme a suggerimenti e trucchi, per aiutare gli altri a utilizzare tecniche basate sulla trasformazione nella ricerca WCR. Oltre a estendere tecnologie transgeniche a WCR per uso negli studi di genomici funzionali, queste tecniche consentono anche potente nuove strategie di controllo dei parassiti come gene unità23,24 per essere testato in questo economicamente importante dei parassiti.
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Protocollo
1. a livello di Colonia allevamento del WCR adulti
- Ottenere una quantità sufficiente di adulti WCR (500-1.000) da un laboratorio affidabile azienda o ricerca (Vedi Tabella materiali per un esempio) e posto in una gabbia di3 cm 30.
Nota: È consigliabile l'uso di un ceppo non-diapausing. - Preparare la dieta artificiale WCR, seguendo il protocollo del produttore e versare uno strato dello spessore di cm 1 in un contenitore di 38 oz (Vedi Tabella materiali). Dopo la miscelazione, è possibile memorizzare inutilizzato dieta a 4 ° C fino a 2 mesi.
- Mettere una capsula Petri (100 x 15 mm) con adulti dieta (10-15 g) in una gabbia di3 cm 30. Aggiungere più dieta quando il cibo è scarso o asciutto.
- Mettere in un pallone (300 mL) con acqua, coperto con un batuffolo di cotone, che viene utilizzato per tenere in posizione un rotolo di cotone (6 "x 3/8"), per servire come una fonte d'acqua. Cambiare l'acqua quando sta per esaurirsi.
- Mantenere WCR a 26 ° C con 60% di umidità ed un 14:10 luce ciclo in un insetto allevamento incubatrice.
2. gruppi di raccolta e di allineamento
- Prenotare una camera di raccolta di uovo utilizzando 1% agar in acqua in una sterile 100 x 15 mm2 piastra di Petri. Conservare a 4 ° C dopo l'agar solidifica.
- Per raccogliere le uova appena deposte, posizionare un singolo strato di carta da filtro, seguita da 4 strati di garza (ogni taglio al formato) sulla superficie dell'agar (Figura 1A).
Nota: Garza può essere riutilizzata, dopo essere stato lavato in candeggina e sterilizzato nell'autoclave, ma non è necessario eseguire questa operazione per il primo utilizzo. Carta da filtro non dovrebbero essere riutilizzato e non ha bisogno di essere sterilizzato. - Luogo piastra di raccolta uova in gabbia WCR più tardi nel corso della giornata come possibile (fine della giornata lavorativa) e coprire con una tenda di carta stagnola. Lasciare durante la notte.
Nota: Avere le luci da 10 a deposizione delle uova 12 A.M. (14 h) ritardi, facilitando così la raccolta delle uova più giovane per il microinjection senza richiedere personale di laboratorio a luogo camera di raccolta in gabbia a tarda notte. - Rimuovere la vaschetta di raccolta uova circa 8 o 9
- Usare pinze per raccogliere 1 strato di garza in un momento e il luogo in un becher (500 mL) di acqua. Lavare le uova al largo di garza di mescolando delicatamente (Figura 1B e 1C).
- Utilizzare una pipetta per trasferire le uova in un altro Becher (500 mL) di acqua. Ripetere 2-3 volte per pulire le uova.
- Utilizzare la pipetta per trasferire uova su carta da filtro (Figura 1), riducendo al minimo la quantità di riporto di acqua.
- A listarelle nero carta da filtro largo come un vetrino e nastro saldamente alla diapositiva per assicurarsi che la carta appoggiato in piano (Figura 2A).
Nota: Nero carta da filtro aiuta a migliorare la visibilità sotto il microscopio, riducendo la quantità di luce riflessa. - Applicare la colla non tossico (per un esempio, vedere Tabella materiali ) per la carta da filtro in linee sottili (Figura 2B). Mantenere le linee di colla più sottile rispetto al diametro di un uovo per evitare che le uova rivestite in colla.
- Utilizzare un pennello fine per spostare delicatamente WCR uova uno per uno da loro carta da filtro per la linea di colla. Tenta di deporre le uova sulla colla prima si asciuga e mantenere distanza di almeno un uovo tra ogni uovo.
- Massimizzare l'efficienza di iniezione inserendo più righe di uova nella diapositiva di una carta da filtro (Figura 3).
- Dopo tutte le uova sono disposte su carta da filtro, attendere fino a quando tutta la colla asciuga prima microiniezione.
Nota: Per la trasformazione di germline e per editing genomico CRISPR/Cas9-mediata, iniettare tutti gli embrioni di mezzogiorno (12) affinché l'embrione più antica è vecchio non più di 19 h. Tuttavia, per RNAi, non c'è nessuna limitazione di tempo perché, a WCR, dsRNA può spostarsi tra le celle. Infatti, per RNAi, embrioni di invecchiamento potrebbero comportare meglio tassi di sopravvivenza.
3. preparazione del plasmide DNAs e aghi per iniezione
- Preparare il DNA del plasmide supercoiled alta qualità utilizzando un'endotossina-libero commerciale kit (Vedi Tabella materiali per un esempio).
- Per preparare la soluzione per iniezione, controllare la concentrazione di ogni plasmide e quindi combinare plasmide helper (concentrazione finale di 250 ng / µ l), donatore plasmide (concentrazione finale di 750 ng / µ l) e buffer di rosso fenolo (concentrazione finale di 20%). Vortice la soluzione brevemente e centrifugare per 3 min a velocità massima per far precipitare le particelle che potrebbero intasare l'ago.
- Tirare aghi di vetro borosilicato (O.D. 1 mm, D.I. 0,58 mm, lunghezza 10 cm) utilizzando un estrattore di Flaming/marrone tipo micropipetta. Per deposito, fissare aghi tirati il nastro adesivo su due lati in una capsula di Petri o altro contenitore chiaro.
Nota: Per il sistema di estrattore micropipetta, le impostazioni utilizzate erano: calore = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Recupero informazioni l'ago per iniezione utilizzando un micro-caricatore suggerimento (Vedi Tabella materiali) per dispensare 0,5 - 1,0 µ l giù all'interno dell'ago, vicino l'estremità appuntita. Rimuovere le bolle dalla punta dell'ago, qualora si verificassero.
- Il porta-aghi, inserire l'ago per iniezione.
- Aprire la punta dell'ago rompendo delicatamente con un bel paio di pinze, o delicatamente toccando/trascinando la punta sul vetrino coprioggetto o vetro.
Nota: L'obiettivo è di avere l'apertura più piccola che ancora permette il mix di iniezione a venire fuori (aperture più piccole richiedono generalmente più alta pressione di iniezione). Aghi smussati non richiedono questo passaggio, poiché essi sono già aperti.
4. microinjection e cura post-iniezione
- Usando un pennello fine, accuratamente bagnare la superficie di 1-3 uova con acqua sterile, inserire l'ago e iniettare la soluzione. Iniettare ogni uovo prima che la superficie si asciughi. Cercare l'aspetto una piccola quantità di colore rosso all'interno di uova durante l'iniezione per indicare il successo microiniezione. Schiacciare o rimuovere eventuali uova che guarda danneggiato, vuoto, o in caso contrario non può essere iniettata.
Nota: Anche se la pressione di iniezione variabile in base alla dimensione di foro di spillo, 10-13 psi è un buon punto di partenza. - Dopo tutte le uova sono iniettate, rimuovere la carta da filtro dal vetrino.
- Posizionare il filtro di carta sulla superficie di un piatto di 1% agar (descritto sopra).
- Usare paraffina plastica pellicola per sigillare il piatto e messo in un insetto di 26 ° C allevamento incubatore per 12 giorni.
Nota: Il film di paraffina aiuta a prevenire la contaminazione incrociata di muffa tra piatti. Tuttavia, qualsiasi altro trattamento per prevenire la crescita batterica e muffa potrebbe ridurre la sopravvivenza degli embrioni iniettati.
5. coltura e da cova di embrioni
- Avviare il controllo di embrioni 12 giorni dopo l'iniezione per le larve appena schiuse e continuare ogni giorno per le prossime 2 settimane.
- Trasferire le larve, usando un pennello fine, a una casella di allevamento con cereale germogliato e suolo.
Nota: Muffa potrebbe crescere nel piatto di agar, ma le larve si schiudono ancora nella maggior parte dei casi. Cercare larve attentamente all'interno dello stampo per catturarli tutti. Alcune larve potrebbero spostare il coperchio del piatto e potrebbero rimanere bloccati nella condensazione. - Posteriore larve a 26 ° C, seguendo standard WCR allevamento metodi25.
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Risultati
Una considerazione importante durante lo sviluppo di questo protocollo è stato il palcoscenico dello sviluppo embrionale al momento della microiniezione. In particolare, trasformazione di germline richiede microiniezione di DNAs prima del cellularization embrionale. Questo è perché DNAs non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Tentativi di visualizzare le fasi dello sviluppo embrionale WCR usando una macchia nucleare erano infruttuosi, perché dechorionation di embrioni WCR e...
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Discussione
Anche se microinjection di WCR con RNAds ai fini della RNAi è stato segnalato9, questo è il primo protocollo per stabilire le migliori pratiche per microinjecting precellular embrioni WCR, un processo critico per lo svolgimento di germline trasformazione e/o CRISPR/Cas9 genoma di editing in questa specie. Successo microiniezione di embrioni WCR è dipendente da molti fattori, come l'efficienza di trasformazione. Discussi di seguito alcune delle questioni principali stanno influenzando il risultato ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del programma di ricerca di Monsanto mais Diabrotica conoscenza, assegnare un numero AG/1005 (a MDL e YC) e fondi di Start-up per MDL dal NCSU. FC è stata sostenuta da sovvenzioni da parte mais Diabrotica Knowledge Research Program di Monsanto (AG/1005) e la National Science Foundation, concedere numero MCB-1244772 (MDL). Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. FC e MDL ideato e progettato gli esperimenti; FC, PW e SP effettuati gli esperimenti; FC e MDL ha analizzato i risultati; e FC, NG e MDL ha scritto il manoscritto. Ringraziamo Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski per loro assistenza di esperti in selezione WCR. Ringraziamo anche il dottor Wade French (USDA-ARS, laboratorio di ricerca agricola Centrale Nord, Brookings, SD) per le spedizioni di uova di stabilire colonie di laboratorio e fornendo protocolli di allevamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carta da filtro qualitativa (nera) | Ahlstrom | 8613-0900 | Per microiniezione di uova |
| Contenitori da 1 oz | Stoviglie in plastica Anny's | ASET101 | Contenitore per uova |
| Drosophila Agar Tipo II | Apex | 66-103 | Substrato per piatto per la deposizione delle uova WCR |
| Pinze peso piuma | Bioquip | 4748 | Manipolazione di larve e pupe |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Lavare mais e piatti |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Mais per l'alimentazione WCR |
| Microinjection System (fatto in casa) | NA | Parti e istruzioni disponibili su richiesta | Controlla la pressione di iniezione (0-20 psi) |
| Elmer's Colla non tossica | Elmer's Products, Inc. | E304 | Uova di colla su carta da filtro |
| epTIPS Punte per microloader | Eppendorf | C2554691 | Punte di riempimento per il caricamento dell'ago |
| tissutali Falcon | Falcon | 25383-103 | Germogliare mais /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Cerchi di carta da filtro di grado quantitativo | Fisher Scientific | S47576C | Produzione di piatti di agar per uova / 9 cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Lavare i piatti |
| Vetrini per microscopio semplici Fisher | Scientific | 12-549-3 | Contenere carta da filtro e uova per microiniezione |
| Diabrotica del mais occidentale senza sostituto del polline | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR dieta artificiale per adulti |
| Batuffoli di cotone, grandi | Genesee Scientific | 51-101 | Chiudi il pallone |
| Globe Scientific 3.0 mL Pipette per il trasferimento di piccoli bulbi | Globe Scientific | 137035 | Raccogli e trasferisci le uova |
| Leica M165 FC Stereomicroscopio a fluorescenza | Leica | M165 FC | Screening WCR |
| Set di filtri DsRed per stereomicroscopio a fluorescenza | Leica | DSR | Filtro di eccitazione: 510-560 nm, filtro di emissione: 590-650 nm |
| Filtro EGFP | Leica | GFP2 | Filtro di eccitazione: 440– 520 nm, filtro di emissione: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Gabbia per colonia adulta |
| Pennello in miniatura | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Micromanipolatore joystick | Narishige | MN-151 | Micromanipolatore e portaago |
| Microscopio XY Stage | Olympus | 265515 | Tavolino per microscopio (adattato per l'uso con stereoscopio) |
| Grado 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | Per la deposizione delle uova |
| Film di paraffina plastica | Imballaggio in plastica Pechiney | PM-996 | Sigillare il piatto di agar dopo la microiniezione/Rotolo di dimensioni 4 pollici x 125 piedi |
| Percival Incubatore | Percival | Camera di | crescita I41VLH3C8 WCR (incubatrice per l'allevamento di insetti) |
| Boccette di Erlenmeyer a bocca stretta | VWR | 4980-300-PK | Contenitore per acqua per colonia adulta |
| Griffin Forma Bassa Becher | VWR | 1000-600-PK | Per lavaggio delle uova |
| Rotoli di cotone intrecciato | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Uso nell'approvvigionamento idrico per colonie adulte |
| Piastre di Petri (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Per piastre dietetiche |
| Rosso fenolo | Sigma | 143-78-8 | Tampone per microiniezione |
| Estrattore per micropipiette basato su laser | Strumento Sutter Strumento | P-2000/G | Estrattore per aghi/Calore = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Terriccio Premium | The Scotts Company | 71130758 | Terriccio per la coltivazione |
| di cronReloc Zippit 2 Mil Sacchetti con cerniera | Stati Uniti Plastic Corporation | 48342 | Sacchetto di agar piatto dopo microiniezione / 5x7 |
| Petri Plates (100x15m) | VWR | 89038-968 | Produzione di piatto di agar per la deposizione di uova / 100 x 15 mm |
| 6 oz Contenitori | Webstaurantstore | 128E506 | WCR camera di accoppiamento a coppia singola |
| Contenitori da 38 once | Webstaurantstore | 128NC888 | Scatola per l'allevamento delle larve / 38 once |
| ChoiceHD 16 once Contenitore per gastronomia in plastica traslucida per microonde | Webstaurantstore | 128HRD16 | Scatola per l'allevamento delle larve / 16 once |
| Ambito di microiniezione | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Cannocchiale per microiniezione dotato di uno stadio XY |
| Capillari in vetro standard | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Aghi per microiniezione |
| Diabrotica occidentale adulta Laboratorio | ricerca sull'acquacoltura centro-settentrionale | Ceppo non diapasi | Richiesta dal laboratorio del Dr. Bryan Wade Kit |
| Midi DNA plasmidico del Dr | Qiagen | 12143 | Purificazione di DNA plasmidico pronto per l'iniezione |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
