Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diabrotica del mais (WCR) è un parassita importante di mais ed è ben noto per la sua capacità di adattarsi rapidamente alle strategie di lotta. Anche se l'interferenza del RNA (RNAi) ha dimostrato di essere un potente strumento per lo studio della biologia WCR, ha i suoi limiti. In particolare, il RNAi sé è transitoria (cioè non provocare a lungo termine eredità mendeliana del fenotipo associato), e richiede la conoscenza della sequenza del DNA del gene target. Quest'ultimo può essere limitante se il fenotipo di interesse è controllato da geni scarsamente conservati, o anche romanzo, perché sarebbe difficile identificare gli obiettivi utili, se non impossibile. Di conseguenza, il numero di strumenti nella casella degli strumenti genomico di WCR dovrebbe essere ampliato dallo sviluppo di metodi che potrebbero essere utilizzati per creare ceppi mutanti stabile e attivare sondaggi indipendente dalla sequenza del genoma del WCR. Nel presente documento, dettagliamo i metodi utilizzati per raccogliere e microinject precellular embrioni WCR con acidi nucleici. Mentre i protocolli descritti nel presente documento sono finalizzati alla creazione di transgenici WCR, editing CRISPR/Cas9-genomico potrebbe essere eseguita anche utilizzando gli stessi protocolli, con l'unica differenza è la composizione della soluzione iniettata gli embrioni.
Introduzione
Diabrotica del mais (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, è un parassita importante di mais1. È interessante notare, WCR sembra superare controllo misure più rapidamente di artropodi di interesse agrario più poiché essi non solo adattarsi fisiologicamente ma anche comportamentale2,3,4,5, 6. nell'ultimo decennio, interferenza del RNA (RNAi), un potente strumento di genomico funzionale, è stato studiato come un metodo di controllo potenziale per WCR7<....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. a livello di Colonia allevamento del WCR adulti
- Ottenere una quantità sufficiente di adulti WCR (500-1.000) da un laboratorio affidabile azienda o ricerca (Vedi Tabella materiali per un esempio) e posto in una gabbia di3 cm 30.
Nota: È consigliabile l'uso di un ceppo non-diapausing. - Preparare la dieta artificiale WCR, seguendo il protocollo del produttore e versare uno strato dello spessore di cm 1 in un contenitore di 38 oz (Vedi Tabella materiali). Dopo la miscelazione, è possibile memorizzare inutilizzato dieta a 4 ° C fino a 2 mesi.
- Mettere una capsula Petri (100 x 15 mm) con adulti d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Una considerazione importante durante lo sviluppo di questo protocollo è stato il palcoscenico dello sviluppo embrionale al momento della microiniezione. In particolare, trasformazione di germline richiede microiniezione di DNAs prima del cellularization embrionale. Questo è perché DNAs non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Tentativi di visualizzare le fasi dello sviluppo embrionale WCR usando una macchia nucleare erano infruttuosi, perché dechorionation di embrioni WCR e.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Anche se microinjection di WCR con RNAds ai fini della RNAi è stato segnalato9, questo è il primo protocollo per stabilire le migliori pratiche per microinjecting precellular embrioni WCR, un processo critico per lo svolgimento di germline trasformazione e/o CRISPR/Cas9 genoma di editing in questa specie. Successo microiniezione di embrioni WCR è dipendente da molti fattori, come l'efficienza di trasformazione. Discussi di seguito alcune delle questioni principali stanno influenzando il risultato .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del programma di ricerca di Monsanto mais Diabrotica conoscenza, assegnare un numero AG/1005 (a MDL e YC) e fondi di Start-up per MDL dal NCSU. FC è stata sostenuta da sovvenzioni da parte mais Diabrotica Knowledge Research Program di Monsanto (AG/1005) e la National Science Foundation, concedere numero MCB-1244772 (MDL). Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. FC e MDL ideato e progettato gli esperimenti; FC, PW e SP effettuati gli esperimenti; FC e MDL ha analizzato i risultati; e FC, NG e MDL ha scritto il manoscritto. Ringraziamo Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski per loro assistenza di e....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carta da filtro qualitativa (nera) | Ahlstrom | 8613-0900 | Per microiniezione di uova |
| Contenitori da 1 oz | Stoviglie in plastica Anny's | ASET101 | Contenitore per uova |
| Drosophila Agar Tipo II | Apex | 66-103 | Substrato per piatto per la deposizione delle uova WCR |
| Pinze peso piuma | Bioquip | 4748 | Manipolazione di larve e pupe |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Lavare mais e piatti |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Mais per l'alimentazione WCR |
| Microinjection System (fatto in casa) | NA | Parti e istruzioni disponibili su richiesta | Controlla la pressione di iniezione (0-20 psi) |
| Elmer's Colla non tossica | Elmer's Products, Inc. | E304 | Uova di colla su carta da filtro |
| epTIPS Punte per microloader | Eppendorf | C2554691 | Punte di riempimento per il caricamento dell'ago |
| tissutali Falcon | Falcon | 25383-103 | Germogliare mais /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Cerchi di carta da filtro di grado quantitativo | Fisher Scientific | S47576C | Produzione di piatti di agar per uova / 9 cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Lavare i piatti |
| Vetrini per microscopio semplici Fisher | Scientific | 12-549-3 | Contenere carta da filtro e uova per microiniezione |
| Diabrotica del mais occidentale senza sostituto del polline | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR dieta artificiale per adulti |
| Batuffoli di cotone, grandi | Genesee Scientific | 51-101 | Chiudi il pallone |
| Globe Scientific 3.0 mL Pipette per il trasferimento di piccoli bulbi | Globe Scientific | 137035 | Raccogli e trasferisci le uova |
| Leica M165 FC Stereomicroscopio a fluorescenza | Leica | M165 FC | Screening WCR |
| Set di filtri DsRed per stereomicroscopio a fluorescenza | Leica | DSR | Filtro di eccitazione: 510-560 nm, filtro di emissione: 590-650 nm |
| Filtro EGFP | Leica | GFP2 | Filtro di eccitazione: 440– 520 nm, filtro di emissione: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Gabbia per colonia adulta |
| Pennello in miniatura | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Micromanipolatore joystick | Narishige | MN-151 | Micromanipolatore e portaago |
| Microscopio XY Stage | Olympus | 265515 | Tavolino per microscopio (adattato per l'uso con stereoscopio) |
| Grado 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | Per la deposizione delle uova |
| Film di paraffina plastica | Imballaggio in plastica Pechiney | PM-996 | Sigillare il piatto di agar dopo la microiniezione/Rotolo di dimensioni 4 pollici x 125 piedi |
| Percival Incubatore | Percival | Camera di | crescita I41VLH3C8 WCR (incubatrice per l'allevamento di insetti) |
| Boccette di Erlenmeyer a bocca stretta | VWR | 4980-300-PK | Contenitore per acqua per colonia adulta |
| Griffin Forma Bassa Becher | VWR | 1000-600-PK | Per lavaggio delle uova |
| Rotoli di cotone intrecciato | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Uso nell'approvvigionamento idrico per colonie adulte |
| Piastre di Petri (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Per piastre dietetiche |
| Rosso fenolo | Sigma | 143-78-8 | Tampone per microiniezione |
| Estrattore per micropipiette basato su laser | Strumento Sutter Strumento | P-2000/G | Estrattore per aghi/Calore = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Terriccio Premium | The Scotts Company | 71130758 | Terriccio per la coltivazione |
| di cronReloc Zippit 2 Mil Sacchetti con cerniera | Stati Uniti Plastic Corporation | 48342 | Sacchetto di agar piatto dopo microiniezione / 5x7 |
| Petri Plates (100x15m) | VWR | 89038-968 | Produzione di piatto di agar per la deposizione di uova / 100 x 15 mm |
| 6 oz Contenitori | Webstaurantstore | 128E506 | WCR camera di accoppiamento a coppia singola |
| Contenitori da 38 once | Webstaurantstore | 128NC888 | Scatola per l'allevamento delle larve / 38 once |
| ChoiceHD 16 once Contenitore per gastronomia in plastica traslucida per microonde | Webstaurantstore | 128HRD16 | Scatola per l'allevamento delle larve / 16 once |
| Ambito di microiniezione | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Cannocchiale per microiniezione dotato di uno stadio XY |
| Capillari in vetro standard | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Aghi per microiniezione |
| Diabrotica occidentale adulta Laboratorio | ricerca sull'acquacoltura centro-settentrionale | Ceppo non diapasi | Richiesta dal laboratorio del Dr. Bryan Wade Kit |
| Midi DNA plasmidico del Dr | Qiagen | 12143 | Purificazione di DNA plasmidico pronto per l'iniezione |
Riferimenti
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
