Articolo metodologico

La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

DOI:

10.3791/57510

⸱

26 aprile 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di mutazione di Lambda selezionare cII in cellule coltivate di roditori transgenici o corrispondenti animali trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una serie di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione è stata sviluppata per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici e la Lambda (λ) Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per il Lambda selezionare cII test di mutazione, che può essere applicato alle cellule coltivate di topi/ratti transgenici o gli animali corrispondenti trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Il protocollo prevede i passaggi seguenti: (1) isolamento di DNA genomic dalle cellule o tessuti o organi di animali transgenici trattati in vitro o in vivo, rispettivamente, con un composto in esame; (2) il recupero del vettore navetta lambda portatrice di un gene reporter mutazionale (cioè, cII transgene) dal DNA genomico; (3) imballaggio dei vettori hanno salvati in infettivi batteriofagi; (4) che infetta un batterio ospite e coltura in condizioni selettive per consentire la propagazione delle mutazioni indotte cII ; e (5) segnando il cII-analisi per determinare la frequenza dei mutanti cII e spettro di mutazione, rispettivamente di sequenza del DNA e mutanti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una vasta gamma di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione sono stati sviluppati per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici Big Blue (di seguito chiamato BB) e λ Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da questo gruppo e molti altri ricerca gruppi in tutto il mondo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Per i 16 anni, abbiamo studiato gli effetti mutageni di vari agenti chimici e/o fisici, utilizzando questi animali transgenici o loro colture di cellule embrionali del fibroblasto corrispondente trattato con un composto in esame e successivamente analizzato il fenotipo e genotipo del transgene cII dal saggio Select cII λ e sequenziamento del DNA, rispettivamente10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. il genoma di questi animali transgenici contiene un vettore navetta λ di batteriofago (λLIZ) integrato sul cromosoma 4 come multi-copia testa-coda concatemer1,2,25. Il vettore λLIZ navetta trasporta due geni reporter mutazionale, vale a dire i lacI e cII transgeni1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. il saggio di Select cII λ si basa sul recupero dei vettori navetta λLIZ dal DNA genomico delle cellule derivate da tessuti o organi di animali transgenici1,2,25 . I vettori di navetta λLIZ recuperati vengono quindi assemblati in teste di fago λ in grado di infettare un ospite indicatore Escherichia coli. Successivamente, i batteri infetti sono coltivati in condizioni selettive per consentire per il punteggio e l'analisi delle mutazioni in cII transgene1,3.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per il dosaggio di Select cII λ, che consiste di isolamento del DNA genomico da cellule/organi di animali transgenici trattati in vitro/in vivo con un test composto, recupero della λLIZ navetta vettori da DNA genomic, imballaggio dei vettori in fagi λ infettiva, infezione dell'ospite e. coli con batteriofagi, identificazione di cII-mutanti sotto condizioni selettive per determinare la frequenza mutante cII , e Analisi di sequenza del DNA per stabilire lo spettro di mutazione di cII . Il protocollo può essere applicato a transgenici topo/ratto cell culture trattate in vitro con un agente chimico/fisiche di interesse, o tessuti/organi degli animali corrispondenti trattati in vivo con il test chimico/agente1, 2,4,48,49,50,51,52. Una presentazione schematica del dosaggio Select cII λ è illustrata nella Figura 1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. isolamento genomic del DNA da fibroblasti embrionali del Mouse

Nota: Fibroblasti embrionali del mouse primario sono isolate da embrioni ottenuti da topi transgenici BB con background genetico C57BL/6, secondo il protocollo pubblicato53. Il materiale di partenza per questo protocollo è costituito da 1 x 106 a 1 x 107 embrionali del fibroblasto cellule trattate con un test composto rispetto al controllo. La raccolta e il conteggio di queste cellule, utilizzando metodi standard sono descritti in riferimenti10,54,55.

  1. Preparare buffer un (0,3 M saccarosio 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, spermidina 0,5 mM, spermina 0,15 mM e 2 mM EDTA), B (150 mM NaCl e 5 mM EDTA, pH 7,8) del buffer e buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 20 mM NaCl, 20 mM EDTA e 1% SDS) in anticipo e conservare a temperatura ambiente (TA) per fino a un anno54,55.
  2. Risospendere le cellule in 2 – 4 mL in una provetta conica per centrifuga 15 mL pipettando ripetutamente su e giù utilizzando un ampio foro punta della pipetta 1.000 µ l di tampone.
  3. Aggiungere un volume (2 – 4 mL) tampone A contenente 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (ad es., Nonidet P40) usando una pipetta sierologica di vetro.
  4. Incubare la provetta in ghiaccio per 5 min.
  5. Centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 minuti a TA.
  6. Scartare il surnatante e lavare la pallina con 10 – 15 mL di tampone per un utilizzo di una pipetta sierologica di vetro.
  7. Risospendere il pellet in 2 – 4 mL di tampone B.
  8. Aggiungere un volume (2 – 4 mL) tampone C contenente 600 µ g/mL proteinasi K.
  9. Incubare la provetta per 3 h a 37 ° C.
  10. Aggiungere la RNasi A una concentrazione finale di 100 µ g/mL.
  11. Incubare la provetta per un ulteriore 1 h a 37 ° C.
  12. Aggiungere un fenolo di volume (2 – 4 mL) (saturi in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alcol (25:24:1 vol/vol).
    Nota: Fenolo può rappresentare un pericolo per la salute gravi e dovrà essere maneggiato con estrema cautela. Fenolo è altamente corrosivo per la pelle e facilmente assorbito attraverso di essa e presenta altri effetti. Quando Gestione fenolo, utilizzare sempre doppia calzata, indossare occhiali protettivi e lavorare in una cappa chimica.
  13. Mescolare bene capovolgendo la provetta per 5 minuti sull'agitatore tubo a 4 ° C.
  14. Centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C.
  15. Rimuovere la fase acquosa (strato superiore) ad un nuovo tubo usando una pipetta sierologica di vetro.
  16. Ripetere fenolo: cloroformio: isoamil alcool estrazione da 1 a 3 volte fino a quando la fase acquosa è chiara e l'interfaccia non è più torbida.
  17. Aggiungere 1/10 di volume (200 – 400 µ l) 3M sodio acetato, pH 5.2.
  18. Aggiungere 2,5 volume (5 – 10 mL) di 100% di etanolo (refrigerato) e capovolgere la provetta delicatamente a mano per 2 – 3 min.
  19. Lo spooling il DNA con un gancio di vetro e trasferirlo in una nuova provetta contenente 1 – 5 mL 70% etanolo e lavarlo con cura. In alternativa, centrifugare la provetta a velocità elevata (3.500 x g) a 4 ° C per il DNA di pellet e lavarlo accuratamente con 1 – 5 mL 70% etanolo.
  20. Centrifugare la provetta a velocità elevata (3.500 x g) a RT, rimuovere il supernatante e asciugare all'aria il DNA per 10-15 min.
  21. Sciogliere il DNA in 10 – 100 µ l di tampone di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) e conservare a 4 ° C (per breve deposito fino ad un mese) o a-20 ° C (per il periodo di conservazione più lungo). La concentrazione ottimale per il DNA per il dosaggio di Select cII λ è 0,5 – 1,0 µ g / µ l (nel buffer di TE)56.

2. in Vitro Packaging reazione

  1. Per una reazione di imballaggio, aggiungere ~ 5 µ g di DNA genomico (volume finale: 8 – 12 µ l, il DNA di genomic è stato isolato nella sezione 1 del mouse fibroblasti embrionali trattate in vitro con una sostanza in esame o controllo) ad un tubo del microcentrifuge contenente il primo miscela di reazione (~ 10 µ l).
    Nota: In-House preparati o λ commercialmente disponibili imballaggio estratti sono utilizzati in laboratori diversi. Nella confezione commerciale Estratto kit utilizzato qui56 (Vedi la Tabella materiali), tubi rossi conteneva la prima miscela di reazione (~ 10 µ l) e tubi blu conteneva il mix di reazione secondo (~ 70 µ l per almeno 5 reazioni).
  2. Incubare la provetta per 90 min a 30 ° C.
  3. Aggiungere il volume richiesto (~ 12 µ l) del secondo mix di reazione per il tubo.
  4. Incubare la provetta per altri 90 minuti a 30 ° C.
  5. Aggiungere 1,1 mL di tampone di SM al tubo.
    Nota: 1 mL di questa soluzione (cioè, miscela di reazione di imballaggio) verrà utilizzato per lo screening di λ cII-mutanti. Il resto servirà per titolazione.
    1. Preparare il tampone di SM mescolando 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7h2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5) e 5 mL 2% (p/v) gelatina. Aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 litro, autoclave per 30 min. Store a temperatura ambiente per fino a 1 anno.
  6. Vortice nella provetta contenente il campione di DNA confezionato per 10 s a RT (vigoroso Vortex).
  7. Impulso girare il tubo in un microcentrifuge e conservare il ghiaccio fino all'uso. Se il campione non sta per essere utilizzato entro il giorno stesso del packaging, aggiungere 50 µ l di cloroformio di DNA confezionato per mL del campione, vortice delicatamente e conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.

3. preparare la coltura batterica di e. coli G1250

  1. Almeno due giorni prima della placcatura, fare qualche striatura batterica tavole da Escherichia coli (Escherichia coli) G1250 su piastre di agar TB1-kanamicina.
    1. Preparare piatti di agar TB1-kanamicina come segue. Mescolare 5,0 g di NaCl, 10,0 g peptone di caseina e 12,0 g di agar. Aggiungere il cloridrato della tiamina di 800ml dH2O. aggiungere 1 mL 0,1%. Regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl. Aggiungi dH2O ad un volume finale di 1 litro.
    2. Mescolare bene e autoclave per 30 min. Consenti raffreddare a 55 ° C. Aggiungere 50,0 mg kanamicina e mescolare. Versare in capsule di Petri sterili 100 mm (20 – 25 mL per ogni piatto). Conservare le piastre a 4 ° C fino a due settimane.
  2. Incubare le piastre di striatura batterica in un incubatore stazionario 30 ° C per almeno 24 h.
  3. Un giorno prima della placcatura, combinare 10 mL di terreno liquido TB1 con 100 µ l di soluzione di 20% (p/v) maltosio-1 M MgSO4 in un tubo conico di sterile 50 mL con tappo a vite.
    1. Preparare il mezzo liquido TB1 come segue. Mix 5.0 g NaCl e peptone di caseina 10,0 g, aggiungere mL 800 dH2O, cloridrato di tiamina 0,1% 1 mL, quindi regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl. Quindi aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 litro, mescolare bene e autoclave per 30 min. memorizzare il mezzo al RT fino a tre mesi.
    2. Preparare il 20% (p/v) di maltosio-1 M MgSO4 come segue. Mescolare 20,0 g maltosio e 24,6 g MgSO4. 7H2O, quindi aggiungere dH2O ad un volume finale di 100 mL. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C fino a 6 mesi.
  4. Inoculare il mezzo liquido con diverse colonie dalla piastra batterica striatura utilizzando una sterile inoculando ciclo56.
  5. Incubare la coltura liquida pernottamento in a 30 ° C in agitazione incubatrice con agitazione vigorosa (250 – 300 giri/min).
  6. Il giorno di placcatura, centrifugare la provetta conica contenente la coltura liquida di G1250 a 1.500 x g per 10 min a RT per agglomerare le cellule batteriche.
  7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 10 mM MgSO4.
  8. Misurare l'assorbanza di una 01:10 diluizione della sospensione delle cellule a lunghezza d'onda 600 nm utilizzando un UV-Vis spettrofotometro (ad es., 100 µ l cella sospensione + 900 µ l 10 mM MgSO4)56.
  9. Diluire la sospensione cellulare a un finale OD600 di 0,5 con 10mm MgSO4. La soluzione ricostituita di G1250 e. coli con OD600 = 0,5 è indicato come 'la cultura di placcatura di G1250'.
  10. Conservare la cultura di placcatura di G1250 sul ghiaccio e usare entro 1-2 h.

4. i campioni di DNA confezionati di placcatura

  1. Per un pacchetto campione di DNA, preparare sedici sterile 14 x 100 mm2 turno-fondo tubi e piastre di agar sedici TB1. Dieci da ogni set servirà per lo screening e sei per titolazione (tre per titolo 20) e tre per titolo 100.
    1. Preparare piatti di agar TB1 come segue. Mix 5.0 g NaCl, peptone di caseina g 10,0 e 12,0 g Agar, quindi aggiungere 800 mL dH2O e 1 mL 0,1% Tiamina cloridrato. Regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl e aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 L.
    2. Mescolare bene e autoclave per 30 min. lasciar raffreddare a 55 ° C, poi versarlo in capsule di Petri sterili 100 mm (20 – 25 mL per ogni piatto). Conservare le piastre a 4 ° C fino a due settimane.
      Nota: Piastre di agar TB1 dovrebbero essere preparate almeno 24 ore prima dell'uso.
  2. Aliquotare e 200 µ l della cultura di placcatura di G1250 in ogni provetta di turno-fondo.
  3. Per titolazione, fare una diluizione 1: 100 del campione del DNA confezionato e mescolare bene nel Vortex (vale a dire, 10 µ l confezionato DNA campione + 990 µ l di tampone di SM).
  4. Aggiungere 20 µ l della diluizione 1: 100 per ciascuna delle tre titolo 20 provette.
  5. Aggiungere 100 µ l della diluizione 1: 100 per ciascuna delle tre titolo 100 provette.
  6. Per lo screening, aggiungere 100 µ l dei 'non diluito ' confezionati campione di DNA per ciascuna delle dieci screening provette.
  7. Elaborare tutte le titolazione e screening tubi (tubi di 2 x 3 + 10 = 16), come segue: mescolare bene su vortex per circa 10 s e poi incubare a temperatura ambiente per 30 min consentire all'host di e. coli di adsorbire i fagi.
  8. Aggiungere 2,5 mL scaldati TB1 fuso top agar (raffreddato a 55 ° C) ad ogni titolo o tubo, schermante mescolare immediatamente nel Vortex (delicatamente), e riversando il titolo appropriato o piastre di agar TB1 di screening.
    1. Preparare TB1 top agar come segue. Mix 5.0 g NaCl, peptone di caseina 10,0 g e 7,0 g Agar, quindi aggiungere il cloridrato della tiamina di 800ml dH2O. aggiungere 1 mL 0,1%, quindi regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl. Infine, aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 litro.
    2. Mescolare bene e autoclave per 20 – 25 min. Store a temperatura ambiente fino a tre mesi.
    3. Prima dell'uso, sciogliere l'agar di top TB1 preparato in un forno a microonde, mescolare bene e lasciare per raffreddare a 55 ° C in un bagno d'acqua.
      Nota: Parte superiore di TB1 fuso e raffreddato viene aggiunto al contenuto di ogni titolo o tubo schermante e dopo la miscelazione, viene versato nel titolo appropriato o piastre di agar di screening TB1.
  9. Lasciate le piastre a riposare per 15-30 min a temperatura ambiente, con il coperchio socchiuso per evitare la condensazione.
  10. Invertire le piastre e posizionare le piastre di dieci schermatura in un incubatore stazionario 24 ° C e incubare per 46 – 48 h (cioè, condizioni selettive) e le sei piastre di titolo in un incubatore stazionario 37 ° C ed incubare per 24 h/pernottamento (vale a dire, condizioni di non-selettivi).
    Nota: Per garanzia della qualità e la standardizzazione dei risultati, controllo disponibile sul mercato dei fagi soluzioni contenenti una miscela di wildtype e mutante cII con frequenza mutante nota sono placcate al fianco di campioni del DNA confezionati e incluso in tutti i l'analisi viene eseguito56.

5. esaminare il titolo e piastre di Screening per determinare la cII frequenza mutante

  1. Dopo l'incubazione 24 h/notte a 37 ° C, il numero delle placche formate in ciascuna delle tre titolo 20 piastre e titolo 100 piastre. Per identificare più facilmente le placche, tenere la piastra accanto a una finestra di luce bianca e su uno sfondo scuro con il coperchio rimosso (Vedi Figura 2).
  2. Fare una media (media) del numero delle placche conteggiata in ogni set di piastre 20 titolo e titolo 100 (in triplice copia, ciascuno).
  3. Scegliere il numero medio dal set di piastre di titolo che cade più vicino alla gamma di placche di 50 – 200 per piastra insieme.
  4. Calcolare il numero totale delle placche proiettato nelle piastre di dieci screening come segue:
    Totale targhe proiettati = (numero medio di placche nel set selezionato di titolo piastre ÷ numero di µ l della diluizione utilizzato per ogni piastra selezionate) x fattore di diluizione x numero di µ l di campione di DNA confezionato per lo screening di piastra [100 µ l/piastra] x numero di piastre [10] di screening.
    Nota: ad esempio, se il numero medio delle placche per piastra nel set di titolo 20 piastre è 128 e il numero corrispondente nel set di titolo 100 piastre è 478, numero 128 verrà essere utilizzato per il calcolo del numero totale delle placche proiettato , come segue:
    (128 ÷ 20) x 100 [fattore di diluizione] x 100 [µ l/piastra] x 10 [piastre] = 640.000
    Questa operazione equivale a moltiplicare il numero medio delle placche di 5.000 o 1.000, se il numero medio è basato su conti dal titolo 20 piastre o titolo 100 piastre, rispettivamente.
  5. 46 – 48 ore di incubazione a 24 ° C, a seguito di contare il numero totale delle placche formate nelle piastre di dieci screening (seguire le istruzioni fornite nel paragrafo 5.1).
    Nota: La frequenza mutante cII è calcolata dividendo il numero totale delle placche formate nelle piastre di screening per il numero totale delle placche proiettato. Utilizzando l'esempio precedente, se il numero totale delle placche contato nelle piastre di dieci screening è 112, la frequenza dei mutanti cII per questo campione di DNA sarebbe 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5.

6. Verifica dei putativi λ cII mutanti, l'amplificazione di PCR e sequenziamento del DNA

  1. La placca in questione con una punta di pipetta sterile, wide-bore di base ed espellerla (pipettando su e giù) in una provetta da microcentrifuga sterile contenente 500 µ l di tampone sterile SM.
  2. Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte, per consentire le particelle dei fagi eluire da agar spina.
  3. In un tubo di turno-fondo sterile 14 x 100 mm2 , mescolare 200 µ l della cultura di placcatura di G1250 con 1 µ l della soluzione dei fagi animato e incubare per 30 minuti a TA.
  4. Piastra campione con 2,5 mL di 55 ° C fuso TB1 top agar e incubare la piastra a 24 ° C per 46 – 48 h (condizioni selettive), come descritto nelle sezioni 4.8 – 4,10.
  5. Una volta che hanno formato le placche secondarie, è possibile utilizzare un puntale per scegliere attentamente un singolo ben isolato verificato λ cII-placca mutante (evitare di toccare l'agar inferiore).
    Nota: Ricromatura le placche mutante presunto cII serve a due scopi: (i) placcatura manufatti può a volte sbagliarsi le placche di piccole dimensioni; e (ii) un nucleo di agarosio prelevato da una piastra di screening può contenere non mutante phage(s) insieme a un mutante dei fagi. Le piastre secondarie da una bassa densità ricromatura fornirà un modello mutante incontaminato per successiva analisi di sequenza del DNA e di PCR.
  6. Trasferire la placca a un tubo del microcentrifuge contenente acqua bidistillata di 25 µ l pipettando su e giù.
  7. Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 min.
  8. Centrifugare a massima velocità (18.000 x g) per 3 minuti a TA.
  9. Trasferire 10 µ l del surnatante immediatamente ad un nuovo tubo del microcentrifuge contenente 40 µ l di una PCR mastermix in cui le concentrazioni finali dei reagenti sono tampone PCR Taq 1x, 10 pmol ogni dei primer forward e reverse, 12,5 nmol di ogni dNTP e 2,5 U di Taq DNA polimerasi.
    Nota: Il primer forward e reverse sono come segue: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posizioni -68 a -50 rispetto al cII avviare codone) e 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (posizioni + 345 a 365 rispetto il codone di inizio cII ), rispettivamente.
  10. Amplificare il modello utilizzando i seguenti parametri in bicicletta: una denaturazione di 3 min a 95 ° C, seguita da 30 cicli di 30 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C e 1 min a 72 ° C, con un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.
  11. Purificare il prodotto di PCR di bp 432 contenente il gene cII e fiancheggianti regioni utilizzando kit di purificazione di PCR commercialmente disponibili, secondo le istruzioni del produttore.
  12. Eseguire il sequenziamento del DNA utilizzando una piattaforma di sequenziamento appropriato e analizzare le sequenze di DNA risultanti per rilevare le mutazioni nel transgene cII (vedere la nota qui sotto).
    Nota: Ciò si ottiene tramite l'allineamento con la sequenza di cII di riferimento utilizzando il software, ad esempio il basati su web server allineamento di sequenza T-caffè. Per istruzioni su come utilizzare il programma, visitare: http://tcoffee.crg.cat/

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A seconda della distribuzione dei dati, parametrici o non parametrici test vengono utilizzati per determinare il significato di differenza nella frequenza mutante cII tra gruppi di controllo e trattamento (cioè, indotta contro frequenze mutante spontanee) . Confronto delle frequenze mutante indotto cII attraverso diversi gruppi di trattamento è fatto da varie (pairwise) test statistici, come applicabile. La prova di ipergeometrica di Adams e Skopek comunemente v...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il dosaggio di Select cII λ viene utilizzato per il rilevamento delle mutazioni nel transgene cII recuperato dal DNA genomico delle cellule derivate da organi/tessuti di BB roditori3. Il genoma di questi animali transgenici contiene più tandem copie del vettore navetta cromosomicamente integrato λLIZ, che trasporta il cII (294 bp) e lacI (1.080 bp) transgeni, come il reporter mutazionale di geni1, 2

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo riconoscere i contributi di tutti i colleghi e collaboratori per i nostri studi originali, i cui risultati sono stati denominati in questo manoscritto (a scopo esemplificativo). Lavoro degli autori è sostenuto da borse di studio dal National Institute of Dental e Craniofacial Research del National Institutes of Health (1R01DE026043) di AB e dall'Università di programma di ricerca di malattia di California Tobacco-Related a (AB TRDRP-26IR-0015) e ST (TRDRP-25IP-0001). Gli sponsor dello studio non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati, analisi dei dati, interpretazione dei dati, scrittura della relazione, o nella decisione di presentare per la pubblicazione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarMO Bio Laboratories, Inc.12112-05
Kit di sequenziamento del ciclo BigDye Terminator v3.1Thermo Fisher Scientific4337455Nessuno
Caseina PeptoneAlfa AesarH26557Nessuno
GelatinaJ. T. Baker2124-01
Polvere GliceroloFisher ScientificBP 229-1 / M-13750Nessuno
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500Nessuno
Kit di purificazione PCR QIAquickQiagen810450 Reazioni di purificazione PCR
Acetato di sodio triidratoFisher ScientificM-15756Nessuno
Taq5000 DNA polimerasi Qiagen201207Nessuno
Tiamina cloridratoMacron Fine Chemicals2722-57Nessuno
Transpack Imballaggio EstrattoStratagene Corp., acquisito da BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.20022350 reazioni di imballaggio
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4Nessuno
TryptonBiosciencesRC-110Nessuno
di grado batteriologico

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828(2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116(2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Saggio di mutazione Lambda Select cIIisolamento del DNA genomicorecupero del vettore shuttle Lambdaimpacchettamento del batteriofagoinfezione di batteri ospiticoltura selettivascoring dei mutanti cIIanalisi della sequenza del DNAtest di mutagenicitcellule di roditori transgenici

Articoli correlati