La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

Summary

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di mutazione di Lambda selezionare cII in cellule coltivate di roditori transgenici o corrispondenti animali trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero.

Abstract

Una serie di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione è stata sviluppata per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici e la Lambda (λ) Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per il Lambda selezionare cII test di mutazione, che può essere applicato alle cellule coltivate di topi/ratti transgenici o gli animali corrispondenti trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Il protocollo prevede i passaggi seguenti: (1) isolamento di DNA genomic dalle cellule o tessuti o organi di animali transgenici trattati in vitro o in vivo, rispettivamente, con un composto in esame; (2) il recupero del vettore navetta lambda portatrice di un gene reporter mutazionale (cioè, cII transgene) dal DNA genomico; (3) imballaggio dei vettori hanno salvati in infettivi batteriofagi; (4) che infetta un batterio ospite e coltura in condizioni selettive per consentire la propagazione delle mutazioni indotte cII ; e (5) segnando il cII-analisi per determinare la frequenza dei mutanti cII e spettro di mutazione, rispettivamente di sequenza del DNA e mutanti.

Introduction

Una vasta gamma di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione sono stati sviluppati per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici Big Blue (di seguito chiamato BB) e λ Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da questo gruppo e molti altri ricerca gruppi in tutto il mondo^{1,2, 3,4,5,6,7,....}

Protocol

1. isolamento genomic del DNA da fibroblasti embrionali del Mouse

Nota: Fibroblasti embrionali del mouse primario sono isolate da embrioni ottenuti da topi transgenici BB con background genetico C57BL/6, secondo il protocollo pubblicato⁵³. Il materiale di partenza per questo protocollo è costituito da 1 x 10⁶ a 1 x 10⁷ embrionali del fibroblasto cellule trattate con un test composto rispetto al controllo. La raccolta e il conteggio di queste cellule, utilizzando metodi standard sono descritti in riferimenti^10,54,

Results

A seconda della distribuzione dei dati, parametrici o non parametrici test vengono utilizzati per determinare il significato di differenza nella frequenza mutante cII tra gruppi di controllo e trattamento (cioè, indotta contro frequenze mutante spontanee) . Confronto delle frequenze mutante indotto cII attraverso diversi gruppi di trattamento è fatto da varie (pairwise) test statistici, come applicabile. La prova di ipergeometrica di Adams e Skopek comunemente v.......

Discussion

Il dosaggio di Select cII λ viene utilizzato per il rilevamento delle mutazioni nel transgene cII recuperato dal DNA genomico delle cellule derivate da organi/tessuti di BB roditori³. Il genoma di questi animali transgenici contiene più tandem copie del vettore navetta cromosomicamente integrato λLIZ, che trasporta il cII (294 bp) e lacI (1.080 bp) transgeni, come il reporter mutazionale di geni^{1, 2}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	MO Bio Laboratories, Inc.	12112-05
Kit di sequenziamento del ciclo BigDye Terminator v3.1	Thermo Fisher Scientific	4337455	Nessuno
Caseina Peptone	Alfa Aesar	H26557	Nessuno
Gelatina	J. T. Baker	2124-01
Polvere Glicerolo	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	Nessuno
LB Agar	Fisher Scientific	BP 9724-500	Nessuno
Kit di purificazione PCR QIAquick	Qiagen	8104	50 Reazioni di purificazione PCR
Acetato di sodio triidrato	Fisher Scientific	M-15756	Nessuno
Taq5000 DNA polimerasi	Qiagen	201207	Nessuno
Tiamina cloridrato	Macron Fine Chemicals	2722-57	Nessuno
Transpack Imballaggio Estratto	Stratagene Corp., acquisito da BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 reazioni di imballaggio
Tris Base	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	Nessuno
Trypton	Biosciences	RC-110	Nessuno