Descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di mutazione di Lambda selezionare cII in cellule coltivate di roditori transgenici o corrispondenti animali trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero.
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Articolo metodologico
La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una serie di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione è stata sviluppata per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici e la Lambda (λ) Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per il Lambda selezionare cII test di mutazione, che può essere applicato alle cellule coltivate di topi/ratti transgenici o gli animali corrispondenti trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Il protocollo prevede i passaggi seguenti: (1) isolamento di DNA genomic dalle cellule o tessuti o organi di animali transgenici trattati in vitro o in vivo, rispettivamente, con un composto in esame; (2) il recupero del vettore navetta lambda portatrice di un gene reporter mutazionale (cioè, cII transgene) dal DNA genomico; (3) imballaggio dei vettori hanno salvati in infettivi batteriofagi; (4) che infetta un batterio ospite e coltura in condizioni selettive per consentire la propagazione delle mutazioni indotte cII ; e (5) segnando il cII-analisi per determinare la frequenza dei mutanti cII e spettro di mutazione, rispettivamente di sequenza del DNA e mutanti.
Introduzione
Una vasta gamma di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione sono stati sviluppati per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici Big Blue (di seguito chiamato BB) e λ Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da questo gruppo e molti altri ricerca gruppi in tutto il mondo1,2, 3,4,5,6,7,....
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Protocollo
1. isolamento genomic del DNA da fibroblasti embrionali del Mouse
Nota: Fibroblasti embrionali del mouse primario sono isolate da embrioni ottenuti da topi transgenici BB con background genetico C57BL/6, secondo il protocollo pubblicato53. Il materiale di partenza per questo protocollo è costituito da 1 x 106 a 1 x 107 embrionali del fibroblasto cellule trattate con un test composto rispetto al controllo. La raccolta e il conteggio di queste cellule, utilizzando metodi standard sono descritti in riferimenti10,54,
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Risultati
A seconda della distribuzione dei dati, parametrici o non parametrici test vengono utilizzati per determinare il significato di differenza nella frequenza mutante cII tra gruppi di controllo e trattamento (cioè, indotta contro frequenze mutante spontanee) . Confronto delle frequenze mutante indotto cII attraverso diversi gruppi di trattamento è fatto da varie (pairwise) test statistici, come applicabile. La prova di ipergeometrica di Adams e Skopek comunemente v.......
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Discussione
Il dosaggio di Select cII λ viene utilizzato per il rilevamento delle mutazioni nel transgene cII recuperato dal DNA genomico delle cellule derivate da organi/tessuti di BB roditori3. Il genoma di questi animali transgenici contiene più tandem copie del vettore navetta cromosomicamente integrato λLIZ, che trasporta il cII (294 bp) e lacI (1.080 bp) transgeni, come il reporter mutazionale di geni1, 2
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere i contributi di tutti i colleghi e collaboratori per i nostri studi originali, i cui risultati sono stati denominati in questo manoscritto (a scopo esemplificativo). Lavoro degli autori è sostenuto da borse di studio dal National Institute of Dental e Craniofacial Research del National Institutes of Health (1R01DE026043) di AB e dall'Università di programma di ricerca di malattia di California Tobacco-Related a (AB TRDRP-26IR-0015) e ST (TRDRP-25IP-0001). Gli sponsor dello studio non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati, analisi dei dati, interpretazione dei dati, scrittura della relazione, o nella decisione di presentare pe....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | |
| Kit di sequenziamento del ciclo BigDye Terminator v3.1 | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | Nessuno |
| Caseina Peptone | Alfa Aesar | H26557 | Nessuno |
| Gelatina | J. T. Baker | 2124-01 | |
| Polvere Glicerolo | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | Nessuno |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | Nessuno |
| Kit di purificazione PCR QIAquick | Qiagen | 8104 | 50 Reazioni di purificazione PCR |
| Acetato di sodio triidrato | Fisher Scientific | M-15756 | Nessuno |
| Taq5000 DNA polimerasi | Qiagen | 201207 | Nessuno |
| Tiamina cloridrato | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | Nessuno |
| Transpack Imballaggio Estratto | Stratagene Corp., acquisito da BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 reazioni di imballaggio |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | Nessuno |
| Trypton | Biosciences | RC-110 | Nessuno |
Riferimenti
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.
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Ristampe e permessi
