Qui, presentiamo un protocollo per descrivere isolamento di vescicole extracellulari (SVE) nel mezzo di coltura in vitro da adulto Schistosoma japonicum.
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Articolo metodologico
Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari da adulto Schistosoma japonicum
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vescicole extracellulari (EVs) sono membranose vescicole rilasciate da una varietà di cellule nel microambiente extracellulare. SVE rappresentano una popolazione di vescicole eterogenee, cui intervallo di grandezza tra 40 e 1.000 nm. Prove accumulate indicavano che EVs svolgere ruoli importanti regolatori in interazioni ospite-patogeno. Una profonda comprensione di schistosome EVs dovrebbe fornire i meccanismi alla base di interazioni di schistosome-ospite, che permette lo sviluppo di nuove strategie contro la schistosomiasi: intuizioni. Qui, ci proponiamo di studiare ulteriormente funzioni di EVs in schistosomes presentando un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione del SVE da adulto Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE sono state isolate da in vitro mezzo di coltura mediante centrifugazione combinato con un kit di isolamento commerciale esosomi. L' isolato S. japonicum EVs (SjEVs) in genere possiedono un diametro di 100-400 nm e sono caratterizzate da microscopia elettronica di trasmissione e western blotting. L'utilizzo di PKH67 tingere-contrassegnati SjEVs ha dimostrato che SjEVs sono interiorizzati dalle cellule del destinatario. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo alternativo per isolare SVE da adulto schistosomes; il SjEVs isolato può essere adatto per l'analisi funzionale.
Introduzione
Vescicole extracellulari (EVs) sono una popolazione di piccole vescicole di membrana-limitano incapsulato con varie proteine, lipidi e acidi nucleici. Studi recenti hanno dimostrato che EVs svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione cellula-cellula e sono coinvolti nella regolazione di numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo delle cellule, regolazione immunitaria, angiogenesi e cella migrazione2, 3,4,5. Raccogliendo la prova indica che EVs, circolazione esosomi e loro carico di miRNA rappresenta potenziali biomarcatori di det....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico locale dell'Istituto di ricerca veterinaria di Shanghai, Accademia cinese delle scienze agricole (permesso numero: SHVRIAU-14-0101).
1. cultura in Vitro di Schistosomes
Nota: Schistosomes rappresentano un rischio biologico. I lavoratori devono indossare guanti in lattice a tutti volte quando correlate a handling vermi, sospensioni schistosomal o altri materiali biologici. Nuova Zelanda conigli sono stati infettati con ~ 2.000 cercarie via addominale dell'esposizione. Schistosomes nella fa....
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Risultati
Per quantificare il rendimento di SjEVs isolato utilizzando il protocollo descritto, abbiamo usato l'analisi della proteina di BCA per accedere la concentrazione nella proteina del SjEVs isolato da schistosomes adulto 28 giorni. Come illustrato nella tabella 1, la concentrazione di proteina SjEV ha variata da 208 µ g a 250 µ g / 100 mL di terreno (tabella 1). La dimensione delle particelle, come determinato mediante analisi di nanoparticelle di Malvern, i.......
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Discussione
Studi recenti su EVs hanno dimostrato quel schistosome che EVS svolgono un ruolo importante nelle interazioni ospite-patogeno3,9,12,16. Per affrontare altre loro funzioni di regolamentazione, è essenziale per isolare SVE da schistosomes. Qui, descriviamo un metodo alternativo per l'isolamento di SjEV. Questo metodo restituisce una dimensione vasta gamma di SjEVs, da 100 nm a 400 nm, in adulto <.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato, in parte o in toto, supportati da National Natural Science Foundation of China (31472187 e 31672550) e The Agricultural Science e Technology Innovation Program dell'Accademia cinese delle scienze agrarie.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (da terreni di coltura cellulare) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | Per isolare le vescicole extracellulari di S. japonicum |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | Per la marcatura Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | Per la coltura di parassiti |
| Penicillina-Streptomicina | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0,22μ m filtro per siringhe | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Tubo per dialisi | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore&commercio; Immobilon&commercio; Substrato HRP chemiluminescente occidentale (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| Kit BCA | Beyotime | P0010 | |
| CD63 anticorpi | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Acido fosfotungstico | Ted Pella | 19402 | |
| anti-topo IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| clone NCTC 1469 cellule | ATCC | ATCC® CCL-9.1&commercio; | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE sistema di imaging a chemioluminescenza | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Microscopia elettronica a trasmissione | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q acqua | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuga | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuga | Beckman | Optima L-100 XP Incubatore per ultracentrifuga | |
| ESCO | CCL-107B | ||
| Microscopio | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
Riferimenti
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to ....
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Ristampe e permessi
