Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.
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Articolo metodologico
Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Si ripete regolarmente sparpagliata palindromica cluster (CRISPR) - CRISPR - associati proteina 9 (Cas9) sistema di difesa immunitario adattivo prokaryotic ha stato cooptato come un potente strumento per l'ingegneria precisa del genoma eucariotico. Qui, presentiamo un metodo rapido e semplice utilizzando RNA chimerico guida singola (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) per la generazione efficiente e precisa di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. Descriviamo una pipeline per selezione target sgRNA, disegno del modello di omologia-regia di riparazione (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione che consente l'identificazione robusto e rapido degli animali correttamente modificati. Il nostro approccio non solo consente la facile generazione e l'identificazione del punto desiderato genomico animali mutanti, ma facilita anche la rilevazione di altri alleli complessi indel in circa 4-5 giorni con alta efficienza e un carico di lavoro ridotto lo screening.
Introduzione
I recenti progressi tecnologici hanno radicalmente trasformato e accelerato la possibilità al proprio genoma di ingegnere. In particolare, il sistema CRISPR-Cas9, che si basa sull'endonucleasi di RNA-guida Cas9 per indurre una rottura del doppio filamento (DSB) vicino alla sequenza di destinazione di interesse, è stato ampiamente utilizzato per progettare accuratamente il genoma della maggior parte degli organismi di modello utilizzato in ricerca biomedica1,2,3,4. Significativamente, l'uso di CRISPR-Cas9 ha sbloccato l'editing genomico anche....
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Protocollo
Tutti cura degli animali e procedure sperimentali seguite le linee guida dal National Institutes of Health e istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università del Michigan. Utilizzare soluzioni RNasi-free e dispensare consigli in tutto il protocollo. Pulire l'area di lavoro, le pipette, tubi e centrifuga con soluzione di decontaminazione di RNAsi seguendo le linee guida del produttore (Vedi Materiali tavolo).
1. sgRNA selezione destinazione
- Utilizzando un browser web, aprire la pagina Web: http://crispor.tefor.net8
- ~ 60 paia di basi (bp) di sequenza che fianchegg....
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Risultati
Mutazioni in umano superossido dismutasi 1 (SOD1) rappresentano ~ 10-20% di sclerosi laterale amiotrofica familiare, una devastante malattia neurodegenerativa che conduce invariabilmente a paralisi e morte17. SOD-1 umana è una proteina evolutivamente conservata condivisione di somiglianza di identità e il 70% di 55% con la proteina SOD-1 c. elegans (Figura 1B). Per dimostrare la semplicità, la fattibilità e l'efficaci.......
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Discussione
Il sistema di CRISPR-Cas9 è uno strumento potente ed efficace per proprio modificando il genoma degli organismi modello. Qui, dimostriamo che chimerico sgRNAs20 accoppiato con ssODN HDR modelli permettono la generazione altamente efficiente di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. D'importanza, dimostriamo che consegna RNP produce alta efficienza di editing quando fluorescenza viene utilizzato come un indicatore di co-selezione, mettendo in evidenza la facilità e l'affidabilità della.......
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Dichiarazioni
Ringraziamo i membri del laboratorio Beg per la lettura critica di questo manoscritto. Ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Ricerca in laboratorio Beg è sostenuta da sovvenzioni dal NIH (R01 NS094678) e Muscular Dystrophy Association (MDA382300) a A.A.B.
Ringraziamenti
Non ci sono nessun conflitti di interesse relazionati alla presente relazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimerico sgRNA | |
| Nucleasi-free TE | Synthego Inc. | fornito con il kit sgRNA Kit EZ Acqua | |
| senza nucleasi | Synthego Inc. | fornito con il kit sgRNA Kit EZ | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 proteina |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmide |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Pulito & Concentratore | Zymo Research | D4004 | |
| Kit di recupero del DNA su gel | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start 2X Master Mix ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinasi K | Sigma | P2308 | |
| Micropipette in vetro borosilicato di vetro | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1,0 mm. ID: 0,78 mm |
| Trizma cloridrato | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 Fisher | Scientific | BP337-100 | |
| Soluzione di decontaminazione RNaseZap | Fisher Scientific | AM9780 |
Riferimenti
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
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Ristampe e permessi
