Articolo metodologico

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

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DOI:

10.3791/57518

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30 aprile 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

Abstract

Si ripete regolarmente sparpagliata palindromica cluster (CRISPR) - CRISPR - associati proteina 9 (Cas9) sistema di difesa immunitario adattivo prokaryotic ha stato cooptato come un potente strumento per l'ingegneria precisa del genoma eucariotico. Qui, presentiamo un metodo rapido e semplice utilizzando RNA chimerico guida singola (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) per la generazione efficiente e precisa di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. Descriviamo una pipeline per selezione target sgRNA, disegno del modello di omologia-regia di riparazione (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione che consente l'identificazione robusto e rapido degli animali correttamente modificati. Il nostro approccio non solo consente la facile generazione e l'identificazione del punto desiderato genomico animali mutanti, ma facilita anche la rilevazione di altri alleli complessi indel in circa 4-5 giorni con alta efficienza e un carico di lavoro ridotto lo screening.

Introduzione

I recenti progressi tecnologici hanno radicalmente trasformato e accelerato la possibilità al proprio genoma di ingegnere. In particolare, il sistema CRISPR-Cas9, che si basa sull'endonucleasi di RNA-guida Cas9 per indurre una rottura del doppio filamento (DSB) vicino alla sequenza di destinazione di interesse, è stato ampiamente utilizzato per progettare accuratamente il genoma della maggior parte degli organismi di modello utilizzato in ricerca biomedica1,2,3,4. Significativamente, l'uso di CRISPR-Cas9 ha sbloccato l'editing genomico anche in specie difficili come elegans del c.5. Indipendentemente dalla specie, generando mutazioni puntiformi con il genoma di CRISPR-Cas9 basato sistema di editing si basa su tre componenti principali: 1) Cas9 endonucleasi, 2) una singola guida RNA (sgRNA) che indirizza l'endonucleasi Cas9 a una sequenza di destinazione e 3) un utente progettato modello di omologia-regia di riparazione (HDR) contenente la modifica desiderata in/he / di interesse2.

Ci sono diversi metodi che possono essere utilizzati per introdurre il targeting sgRNA e Cas9 nucleasi nelle cellule incluse plasmide e RNA virale basato consegna metodi6. Recentemente, consegna diretta di pre-complessati sgRNA-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) è emerso come uno strumento potente ed efficace nel genoma basati su CRISPR-Cas97di editing. La consegna diretta di pre-complessati CRISPR-Cas9 RNP ha diversi vantaggi distinti, vale a dire: 1) RNP ignorare la necessità di trascrizione cellulare e traduzione, 2) RNP sono rapidamente eliminato, che può aumentare la specificità riducendo il tempo disponibile per fuori bersaglio fenditura e 3) RNP non contenere nessun elementi di DNA/RNA estranei che aggira l'introduzione delle sequenze non-nativi nel genoma ospite attraverso integrazione casuale. Insieme, questi attributi probabili forniscono una breve raffica di on target CRISPR editing riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio.

Descriviamo un protocollo semplice ed efficace per introdurre cambiamenti genomici site-specific in c. elegans. Questo protocollo include destinazione sgRNA e disegno del modello HDR singolo incagliato oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione per l'identificazione inequivocabile degli animali correttamente modificati. Utilizzando questa strategia, non solo possono essere recuperate le modifiche desiderate e site-specifiche, ma altre mutazioni indel non specifici possono anche essere recuperati. Così, la nostra strategia consente la generazione di una serie allelica usando una strategia unica, dove entrambi allelica mono, bi-allelica e indel mutanti possono essere generati nella generazione1 F.

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Protocollo

Tutti cura degli animali e procedure sperimentali seguite le linee guida dal National Institutes of Health e istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università del Michigan. Utilizzare soluzioni RNasi-free e dispensare consigli in tutto il protocollo. Pulire l'area di lavoro, le pipette, tubi e centrifuga con soluzione di decontaminazione di RNAsi seguendo le linee guida del produttore (Vedi Materiali tavolo).

1. sgRNA selezione destinazione

  1. Utilizzando un browser web, aprire la pagina Web: http://crispor.tefor.net8
    1. ~ 60 paia di basi (bp) di sequenza che fiancheggia la modifica desiderata di interesse di ingresso (cioè 30 bp 5' e 3' di modifica desiderata).
    2. Dal menu a discesa, selezionare il genoma di Caenorhabditis elegans .
    3. Selezionare il motivo adiacente Protospacer (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) dal menu a discesa.
    4. Fare clic su Invia. Nella pagina dei risultati, scegliere la sequenza di destinazione n superiore più vicina per la modifica di interesse. Se esistono siti bersaglio adatto all'interno della sequenza di input bp 60 fiancheggianti, espandere la sequenza di query fino a 100 bp (cioè 50 bp entrambi i lati del desiderato modificare).
  2. Da una fonte disponibile, ad esempio synthego, ottenere un 20-mer destinazione sgRNA con le seguenti specifiche: 3 nmol; senza modifiche.
  3. Al ricevimento, centrifugare sgRNA liofilizzato contenente tubo a > 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Aggiungere 60 µ l di TE privo di nucleasi alla provetta e Risospendere delicatamente pipettando su e giù per 15 - 20 volte superiori usando una pipetta P200. La concentrazione finale è di 50 µM.

2. disegno del modello di riparazione omologia-regia

  1. Progettare un modello HDR ssODN contenente: 1) la mutazione di interesse, 2) un sito unico endonucleasi di restrizione nel telaio, 3) una mutazione silenziosa di uno o entrambi del Gs all'interno della sequenza di NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' omologia braccia che fiancheggiano la prima e l'ultima mutazione. (Figura 1) 9 , 10.
    1. Se non è possibile mutazione della sequenza NGG PAM, introdurre 5-6 mutazioni silenti all'interno della sequenza di riconoscimento di destinazione sgRNA per prevenire sgRNA-mediata scissione del modello HDR ssODN.
  2. Da una fonte disponibile, ad esempio idtdna, ottenere un "oligonucleotide Ultramer DNA" con i seguenti parametri: scala: 4 nmol; Formulazione: Nessuno; Purificazione: Standard desalificazione.
  3. Al ricevimento, centrifugare ssODN liofilizzato contenente tubo a > 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Risospendere delicatamente ssODN ad una concentrazione finale di 100 µM in ddH nucleasi-free2O pipettando su e giù per 15 - 20 volte superiori usando una pipetta P200.

3. design genotipizzazione primer

  1. Progettare un set che fiancheggiano la modificazione del genoma per generare un ~ 400-700 bp PCR amplicone11di primer.
  2. Ottimizzare le condizioni di ciclismo di PCR per produrre un singolo e specifico amplicone11.

4. preparare la miscela di iniezione

  1. Centrifugare i reagenti di tabella 1 alla massima velocità per 2 min a 4 ° C.
  2. Nell'ordine elencato, è necessario aggiungere tabella 1 reagenti ad un tubo PCR nucleasi-free.
  3. Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù 10 volte con una pipetta P20.
  4. Incubare il mix di iniezione per 10 min a temperatura ambiente.

5. iniezione protocollo

  1. Carico iniezione micropipetta con circa la metà dell'iniezione mescolare12. Salvare restanti mix di iniezione nel caso in cui l'ago per iniezione zoccoli o si rompe.
  2. Rompere una micropipetta punta affinché p.s.i. ~ 20-30 produce una graduale che scorre soluzione12.
    Nota: Più grande diametro consigli negativamente incidere sulla salute degli animali e diminuiscono il rendimento di progenie di F1 .
  3. Iniettare 10-15 giovane adulto worm in entrambi i bracci gonadici possibilmente12. In caso contrario, l'iniezione in un braccio gonadico è sufficiente.
  4. Permettono animali iniettati (P0) recuperare per 1-2 h a temperatura ambiente su un piatto di media (NGM) crescita del nematode OP50-seminato 35 mm. Successivamente, singoli animali di0 P iniettati a piastre NGM individuali OP50-seminato 35 mm utilizzando una vite senza fine del legare di platino pick12.

6. schermo P0 piastre e singolo mCherry(+) F1s

  1. Post-iniezione di due giorni, identificare piastre0 P contenente progenie di1 F esprimendo mCherry nella faringe utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 1, giorno 2 - 3). Scegliere piastre0 tre P che contengono la maggior parte degli animali1 mCherry(+) F.
  2. Da ciascuna delle tre selezionate piastre0 P, scegliere singola 8-12 mCherry(+) F1 animali per un totale di 24-36 mCherry(+) F1s utilizzando una vite senza fine (Figura 1, giorno 2 - 3).
    Nota: mCherry(-) animali possono anche essere individuati da queste piastre0 P, ma la probabilità di identificare correttamente modificato gli animali è molto più basso (Figura 2A).
  3. Consentire singoli F1s per note e deporre le uova per 1-2 giorni a temperatura ambiente.

7. singolo verme PCR e genotipizzazione

  1. Dopo 1-2 giorni di deposizione delle uova, è possibile trasferire il F1s nei tappi individuali di tubo del striscia PCR contenente 7 µ l di tampone di lisi Worm usando un plettro di vite senza fine (tabella 2, Figura 1, giorno 4-5).
  2. Provette per PCR centrifuga alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per portare gli animali alla parte inferiore del tubo e congelamento tubi a-80 ° C per 1 h.
    Nota: Vermi possono essere memorizzati a-80 ° C a tempo indeterminato.
  3. Lyse vermi congelati in un termociclatore usando il seguente programma: 60 ° C per 60 min, 95 ° C per 15 min, 4 ° C tenere.
  4. Set-up PCR mastermix come mostrato nella tabella 3.
  5. µ L 21 di PCR mastermix nelle provette PCR puliti e quindi aggiungere 4 µ l di lisi verme dal passaggio 3. Mescolare bene usando una pipetta ed eseguire il programma PCR seguendo le indicazioni del produttore (Vedi Materiali tavolo).
  6. Purificare le reazioni di PCR usando un kit DNA pulito e concentrato, seguendo le istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo). Eluire il DNA aggiungendo 10 µ l acqua nella colonna di selezione.
  7. Set-up degli enzimi di limitazione mastermix come illustrato nella tabella 4.
  8. Aggiungere 10 µ l di mastermix l'enzima di restrizione ad ogni reazione di PCR puliti e incubare per 1-2 h a 37 ° C13.
  9. Separato digerito i prodotti di PCR su un gel di agarosio 1.5% a 120 V utilizzando 1. tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) x14.

8. identificazione e verifica di sequenza degli animali modificati

  1. Esaminare campioni di enzima digerito per la presenza di bande che indicano il potenziale modificato animali14 (Figura 1, giorno 4-5).
    Nota: Caricare un controllo N2 per identificare potenziali mutazioni indel che possono essere osservate come turni in taglia e/o digestione degli enzimi di restrizione di imprevisti e complessi disegni a strisce.
  2. Dopo aver identificato potenziali animali modificati, utilizzare i rimanenti 3 µ l di lisi di vite senza fine e ripetere la reazione di PCR. Non pulire o degli enzimi di limitazione digerire la reazione di PCR dopo avere completato il programma. Caricare la reazione di PCR su un gel di agarosio all'1%, separato ed estrarre la band utilizzando un kit di estrazione gel15 (Vedi Materiali tavolo).
  3. Gel di Sanger sequenza16 estratto il DNA utilizzando il primer di F1 per identificare correttamente modificati animali (Figura 1A)
    Nota: Heterozygote letture conterrà sovrapposti picchi a causa della presenza di tipo selvatico e ingegnerizzato allele.
  4. Per ottenere animali omozigoti da verificato eterozigoti modificati animali, singoli 8-122 animali ed eseguire i passaggi 7-8.

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Risultati

Mutazioni in umano superossido dismutasi 1 (SOD1) rappresentano ~ 10-20% di sclerosi laterale amiotrofica familiare, una devastante malattia neurodegenerativa che conduce invariabilmente a paralisi e morte17. SOD-1 umana è una proteina evolutivamente conservata condivisione di somiglianza di identità e il 70% di 55% con la proteina SOD-1 c. elegans (Figura 1B). Per dimostrare la semplicità, la fattibilità e l'efficaci...

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Discussione

Il sistema di CRISPR-Cas9 è uno strumento potente ed efficace per proprio modificando il genoma degli organismi modello. Qui, dimostriamo che chimerico sgRNAs20 accoppiato con ssODN HDR modelli permettono la generazione altamente efficiente di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. D'importanza, dimostriamo che consegna RNP produce alta efficienza di editing quando fluorescenza viene utilizzato come un indicatore di co-selezione, mettendo in evidenza la facilità e l'affidabilità della...

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Dichiarazioni

Ringraziamo i membri del laboratorio Beg per la lettura critica di questo manoscritto. Ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Ricerca in laboratorio Beg è sostenuta da sovvenzioni dal NIH (R01 NS094678) e Muscular Dystrophy Association (MDA382300) a A.A.B.

Ringraziamenti

Non ci sono nessun conflitti di interesse relazionati alla presente relazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.chimerico sgRNA
Nucleasi-free TESynthego Inc.fornito con il kit sgRNA Kit EZ Acqua
senza nucleasiSynthego Inc.fornito con il kit sgRNA Kit EZ
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728Cas9 proteina
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry Marker Plasmide
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Pulito & ConcentratoreZymo ResearchD4004
Kit di recupero del DNA su gelZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start 2X Master Mix ad alta fedeltàNew England BiolabsM0494L
Proteinasi KSigmaP2308
Micropipette in vetro borosilicato di vetroSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1,0 mm. ID: 0,78 mm
Trizma cloridratoSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20 FisherScientificBP337-100
Soluzione di decontaminazione RNaseZapFisher ScientificAM9780

Riferimenti

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Editing del genoma di C elegansselezione del target per sgRNAstampo ssODN per HDRgenotipizzazione tramite enzimi di restrizionemarcatore fluorescente mCherryverifica tramite sequenziamento Sangeranimali mutanti omozigotipipeline rapida per la mutazione

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