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Articolo metodologico

Identificare i siti di fattore di trascrizione Olig2 associazione genomico in acutamente purificato PDGFRα + cellule di immunoprecipitazione della cromatina Low-cella ordinamento dell'analisi

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DOI:

10.3791/57547

⸱

16 aprile 2018

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che è stato progettato per analizzare l'associazione genoma del fattore di trascrizione del oligodendrocyte 2 (Olig2) in cellule del precursore del oligodendrocyte cervello acutamente purificato (OPCs) eseguendo immunoprecipitazione della cromatina basso-cella (ChIP) , libreria preparazione, high throughput sequenziamento e analisi bioinformatica dei dati.

Abstract

In cellule di mammifero, trascrizione genica è disciplinata in modo specifico di cella tipo le interazioni dei fattori trascrizionali con DNA genomico. Fattori di trascrizione Lineage-specifici sono considerati svolgono un ruolo essenziale nella specifica delle cellule e differenziazione durante lo sviluppo. ChIP accoppiato con sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) è ampiamente usato per analizzare i siti di legame del genoma di fattori di trascrizione (o suo complesso associato) di DNA genomico. Tuttavia, un numero elevato di celle è necessario per una reazione di ChIP standard, che lo rende difficile da studiare il numero limitato di cellule primarie isolate o popolazioni di cellule rare. Al fine di comprendere il meccanismo di regolazione di trascrizione lineage-specifici del oligodendrocyte fattore Olig2 nel topo acutamente purificata OPCs, un metodo dettagliato utilizzando ChIP-seq per identificare i siti di legame del genoma di Olig2 (o Olig2 complesso) viene visualizzato. In primo luogo, il protocollo spiega come purificare l'alfa del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) positivo OPCs da cervelli di topo. Successivamente, Olig2 anticorpo mediato ChIP e la costruzione della libreria vengono eseguite. L'ultima parte viene descritto il software bioinformatico e procedure utilizzate per l'analisi di Olig2 ChIP-seq. In sintesi, questa carta segnala un metodo per analizzare le associazioni di genoma del fattore trascrizionale Olig2 nel cervello acutamente purificato OPCs.

Introduzione

È importante studiare la proteina (o complesso proteico) DNA binding e i segni epigenetici per costruire reti di regolazione trascrizionale coinvolti nei vari processi biologici. In particolare, le associazioni di fattori di trascrizione da DNA genomic possono giocare un ruolo importante nella regolazione genica, la differenziazione cellulare e lo sviluppo del tessuto. Un potente strumento per lo studio della regolazione trascrizionale e meccanismi epigenetici è immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). A causa dei rapidi progressi nella tecnologia di sequenziamento di nuova generazione, ChIP accoppiato con sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) viene utilizzato per le analisi di binding proteina-DNA e segni epigenetici1. Tuttavia, un protocollo standard di ChIP-seq richiede circa 20 milioni di cellule per reazione, il che rende difficile l'applicazione di questa tecnica quando il numero di cellulare è limitato, come cellule primarie isolate e popolazioni di cellule rare.

Del oligodendrocyte lignaggio cellule compreso le cellule del precursore del oligodendrocyte (OPCs) ed i oligodendrocytes sono ampiamente distribuite in tutto il cervello e sono essenziali per lo sviluppo e la funzione del cervello. Come un tipo delle cellule del precursore, OPCs sono capaci di auto-rinnovamento e di differenziazione. Gli OPC non solo servono come progenitori per gli oligodendrociti ma anche svolgono un ruolo importante nella propagazione della segnalazione di un neurone comunicando con altri tipi di cellule di cervello2. Studi precedenti hanno suggerito che lo sviluppo del oligodendrocyte è regolato da fattori di trascrizione lineage-specifici come Olig2 e Sox103,4. Questi fattori di trascrizione sono stati trovati da associare alle regioni promotore o enhancer di alcuni geni cruciali per influenzare la loro espressione durante del oligodendrocyte specificazione e differenziamento. Tuttavia, è difficile da identificare il grippaggio del DNA della proteina (o complesso proteico) di interesse in OPCs acutamente purificata primario con un numero molto limitato di cellule.

Questo protocollo viene descritto come analizzare sistematicamente l'immunoprecipitato DNA genomico di Olig2 in OPCs purificata del mouse a scala di genoma utilizzando la tecnica di ChIP-seq. OPCs da cervelli di topo erano acutamente purificato mediante immunopanning e utilizzati in un esperimento di ChIP senza proliferazione in vitro. Un numero limitato di OPCs può essere ottenuto da immunopanning e non è sufficiente per gli esperimenti di ChIP-seq standard. Nel presente accordo, un protocollo di ChIP-seq cella di basso con basso quanto 20 mila cellule per reazione di ChIP per fattori di trascrizione è descritto. In breve, reticolate cellule sono state lisate e sonicate da un dispositivo di sonicazione per tosare la cromatina. La cromatina tosata è stata incubata con Olig2 anticorpo come pure proteina perline rivestite con A per precipitare il DNA genomic di Olig2 anticorpo associato. Dopo eluizione da proteina A-rivestito perline e cross-linking inversa, DNA genomic precipitato da Olig2 anticorpo è stato purificato mediante estrazione con fenolo-cloroformio. Il prodotto risultante è stato quantificato e sottoposti a T-tailing, primer modello di commutazione e di estensione, l'aggiunta di schede e amplificazione, selezione dimensione raccolta e purificazione di ricottura passi per la costruzione della libreria ChIP-seq.

Dopo la sequenziazione, è stata analizzata la qualità del crudi si legge da sia il campione preparato con anticorpo di fattore di trascrizione Olig2 e il campione di controllo. Coppie di basi di bassa qualità e adattatore contenente leggere frammenti sono stati tagliati. Successiva, profilate letture sono state allineate al genoma di riferimento del mouse. Le regioni genomiche che significativamente sono state arricchite per letture di ChIP, rispetto al campione di controllo, sono state rilevate come picchi. Picchi significativi, che rappresentano potenziali siti di legame del fattore di trascrizione, sono stati filtrati e visualizzati in un browser del genoma.

In particolare, il metodo descritto in questo protocollo può essere utilizzato ampiamente per ChIP-seq di altri fattori di trascrizione con qualsiasi tipo di cellula di un numero limitato.

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Protocollo

Tutti i uso animale e protocolli sperimentali erano eseguiti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dal Comitato istituzionale biosicurezza e Animal Welfare Committee presso la University of Texas Health Science Center at Houston.

1. purificazione di cellule Lineage Oligodendrocyte PDGFRα Positive dal cervello di topo (modificato dal immunopanning precedentemente descritti protocolli5,6,7)

  1. Preparazione di un piatto di immunopanning per la selezione positiva delle cellule PDGFRα e 2 piastre per lo svuotamento delle cellule endoteliali e microglia.
    Nota: Si prega di notare che di Petri ma piastre di coltura delle cellule non funzionano per l'esperimento di immunopanning; Se le cellule purificate verranno utilizzate per la coltura, immunopanning passi da effettuarsi nella biosicurezza
    1. Veste un 10 cm piastra di Petri con 30 µ l capra anti-ratto IgG in 10 mL di pH 9.5, 50 mM Tris-HCl durante la notte a 4 ° C. Agitare la piastra per assicurarsi che le superfici delle piastre sono uniformemente e completamente coperti dalla soluzione di rivestimento.
    2. Preparare la soluzione di anticorpo PDGFRα diluendo 40 µ l di anticorpo di topo anti-PDGFRα con 12 mL di soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) contenente 0,2% di BSA.
    3. Dopo 3 lavaggi della piastra IgG rivestito con 10 mL 1 x DPBS ciascuno, incubare piastra IgG-rivestito con soluzione di anticorpo PDGFRα a temperatura ambiente per 4 h.
    4. Lavare la piastra di anticorpo di topo anti-PDGFRα 3 volte con 10 mL 1 x DPBS ogni. Aggiungere delicatamente DPBS soluzione lungo la parete laterale della piastra e non disturbare le superfici rivestite.
    5. Cappotto 2 nuove piastre di Petri di 15 cm per lo svuotamento delle cellule endoteliali e microglia con 20 mL di DPBS contenente 2,3 µ g/mL di Banderiaea simplicifolia lectina 1 (BSL-1) per 2 h.
    6. Lavare che il BSL-1 rivestito piastre 3 volte con 20 mL di 1 x DPBS. Aggiungere delicatamente DPBS soluzione lungo la parete laterale delle piastre e non disturbare le superfici rivestite.
  2. Purificazione di PDGFRα cellule di lignaggio del oligodendrocyte positivo viene modificato da metodi precedentemente pubblicati6 , 7 , 8.
    1. Sezionare i tessuti corticali da 2 postnatale giorno 7 (P7) del mouse cervelli secondo precedentemente protocolli pubblicati5,6.
    2. Dissociare i tessuti per generare una sospensione unicellulare con dissociazione di tessuto neurale Kit (P) secondo le istruzioni del produttore dettagliate.
    3. Brevemente, i tessuti corticali dissecati tagliate a pezzi con un bisturi e sottoporli a digestione enzimatica a 37 ° C. Dopo la digestione, manualmente dissociare i pezzi con vetro lucidati a fuoco che pipette Pasteur in sospensione unicellulare.
    4. Centrifugare la sospensione unicellulare a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente e sospendere il pellet cellulare utilizzando 15 mL di buffer di immunopanning (immunopanning buffer è DPBS con 5 µ g/mL dell'insulina e 0,02% BSA).
    5. Incubare la sospensione unicellulare da 2 cervelli di topo in sequenza su 2 piatti di BSL-1 rivestito per 15 min a temperatura ambiente con agitazione delicata della piastra ogni 5 min per garantire un migliore svuotamento di microglia e cellule endoteliali.
    6. Agitare delicatamente la piastra per raccogliere le cellule non-aderenti in una sospensione cellulare e incubare li sul piatto di anticorpo-rivestite di ratto-PDGFRα per 45 min a temperatura ambiente.
    7. Dopo l'incubazione della sospensione delle cellule sulla piastra di anticorpo-rivestite di ratto-PDGFRα, delicatamente la piastra per raccogliere la sospensione cellulare di turbinio e risciacquare la piastra 8 volte con DPBS sbarazzarsi di cellule non aderenti. Delicatamente, aggiungere la soluzione di lavaggio lungo la parete laterale della piastra e agitare la piastra più volte per liberarsi di cellule non aderenti.
    8. Staccare le cellule dalla piastra di anticorpo di topo-PDGFRα utilizzando un 4 mL di trattamento con cellule distacco soluzione per 10 min a 37 ° C. Agitare la piastra per sloggiare le cellule aderenti.
    9. Raccogliere il OPCs purificata mediante centrifugazione a 300 x g e a temperatura ambiente, sospendere il pellet cellulare con mezzo di coltura cellulare di 2 mL OPC e contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro (500 mL medium della coltura cellulare è mezzo DMEM/F12 contenente 5 mL soluzione di penicillina-streptomicina (P/S), 5 mL N2, 10ml B27, 5 µ g/mL insulina, 0.1% BSA, bFGF di 20 ng/mL e 10 ng/mL PDGFRα).
  3. Convalida della purezza di OPCs dopo immunopanning.
    1. Al fine di valutare l'arricchimento di OPCs dopo immunopanning, utilizzare alcune del OPCs purificato per estrazione di RNA con un'estrazione di tiocianato basato guanidium secondo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire qRT-PCR utilizzando mix master colorante verde fluorescente per controllare per l'arricchimento dell'espressione di PDGFRα in OPCs purificato rispetto alle cellule di cervello dissociata secondo i materiali pubblicati in precedenza4.
    3. Inoltre, seme alcune OPCs purificata in poli-D-lisina rivestita 24 pozzetti per immunostaining con l'anticorpo anti-NG2 Condroitin solfato proteoglicano (NG2) come precedentemente pubblicati materiali9.

2. preparazione Low-cella ChIP e ChIP costruzione della libreria per il sequenziamento High-Throughput

  1. Preparazione di basso-cella ChIP Olig2 con un sistema di sonicazione commercialmente disponibili e un numero di cellulare basso commercialmente disponibili ChIP kit (Vedi tabella materiali) seguendo le procedure standard da istruzioni del produttore.
    1. Dopo la disconnessione dal ratto anti-PDGFRα piastra di anticorpo-rivestite e la cella contando con trypan blue e un emocitometro mettere 20.000 OPCs purificato nel mezzo di coltura cellulare OPC 1 mL per ogni reazione di ChIP.
    2. 27 µ l di formaldeide 36,5% per Difficoltà sospensione cellulare per 10 min a temperatura ambiente.
      Attenzione: Si prega di notare che la formaldeide deve essere utilizzato nella cappa chimica per motivi di sicurezza.
    3. Fermata della DNA-proteina cross-linking con glicina di 2,5 M 50 µ l per 5 min a temperatura ambiente.
      Nota: Tutti i passaggi devono essere effettuati su ghiaccio o nella cella frigorifera a 4 ° C da questo punto.
    4. Lavare il pellet cellulare reticolato con 1 mL di gelida Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) con l'inibitore della proteasi cocktail e ottenere cellule pellettate tramite una centrifuga pre-raffreddata a 300 x g a 4 ° C.
    5. Lisare il pellet cellulare in 25 µ l completa di tampone di lisi per 5 min sul ghiaccio.
      Nota: Agitare la provetta per sospendere le cellule in tampone di lisi.
    6. Supplemento alla cella lysata con 75 µ l ghiacciata HBSS contenente shear e inibitore della proteasi cocktail la cromatina di lisato di cellulare pre-raffreddato sistema sonicazione con 5 cicli di 30 s ON e 30 s OFF programma. Sempre trattare con ultrasuoni 6 tubi insieme e assicurarsi che i tubi di equilibrio contengono 100 µ l acqua.
    7. Dopo la tosatura, centrifugare a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in una nuova provetta dopo la centrifugazione.
    8. Diluire 100 µ l di cromatina tranciata con il volume uguale di gelida Buffer completo di ChIP con l'inibitore della proteasi.
    9. Salvare 20 µ l della cromatina tranciata diluita come campione di controllo di Input.
      Nota: Esempio di controllo di Input è anche richiesto come confronto al Olig2 immunoprecipitati campione per identificare Olig2 anticorpo immunoprecipitati DNA.
    10. Aggiungere 1 µ l di anticorpo di coniglio anti-olig2 a 180 µ l della diluito Tosato della cromatina e incubare la provetta di reazione su un disco rotante a 40 giri per 16 h a 4 ° C.
      Nota: Eseguire questo passaggio in una stanza fredda.
    11. Per ogni reazione di ChIP, lavare 11 µ l proteina magnetiche rivestite con A perline con 55 µ l tampone di lavaggio di perline e mettere il tallone pallina in 11 µ l di tampone di lavaggio perlina dopo 2 lavaggi.
      Nota: Eseguire questo passaggio in una stanza fredda.
    12. Per ogni reazione di ChIP, aggiungere 10 µ l di pre-lavati perline rivestite con A di proteina al tubo di reazione di ChIP. Eseguire questo passaggio in una stanza fredda.
    13. Incubare la provetta di reazione di ChIP a 4 ° C per un altro 2 h su una ruota in movimento.
    14. Collocare la provetta di reazione di ChIP sulla griglia magnetica per 1 min.
      Nota: Eseguire questo passaggio in una stanza fredda.
    15. Rimuovere il supernatante e non sloggiare il pellet perlina.
    16. Lavare il pellet perlina con 100 µ l per ciascuno dei 4 wash buffer rispettivamente per 4 min su una ruota rotante a 4 ° C.
    17. Dopo lavaggi, aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione al pellet perlina e incubare la provetta di reazione di ChIP a 65 ° C per 4 h invertire legame incrociato della proteina-DNA.
    18. Inoltre, aggiungere 180 µ l di tampone di eluizione per esempio di controllo di Input di 20 µ l e incubare a 65 ° C per 4 h invertire legame incrociato della proteina-DNA pure.
    19. Aggiungere miscela di 25:24:1 (v/v) 200 µ l di fenolo, cloroformio e isoamil alcool a ciascuna provetta di reazione di ChIP.
    20. Vortexare vigorosamente per 1 min e centrifugare a 13.000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire la fase superiore in una nuova provetta.
    21. Aggiungere la soluzione di acetato di sodio di 3m 40 µ l, 1000 µ l di etanolo al 100% e 2 µ l di glicogeno precipitante covalentemente ad un colorante blu per ciascuna provetta di reazione ChIP durante la notte a-20 ° C.
    22. Centrifuga a 13.000 x g per 20 min a 4 ° C.
    23. Eliminare il supernatante, lavare con etanolo al 70% freddo 500 µ l e centrifugare a 13.000 x g per 20 min a 4 ° C.
    24. Scartare il surnatante, mantenere l'aria di pellet asciutto per 10 min e sciogliere il precipitato con acqua di 50 µ l.
  2. Costruzione della libreria chIP per il sequenziamento ad alta produttività
    1. Pulire e concentrare il DNA ChIP con un kit di pulizia secondo le istruzioni dei fabbricanti.
    2. Quantificare il campione di ChIP da un pico-verde secondo le istruzioni del produttore.
    3. Utilizzare un kit di ChIP-seq per T-tailing, replica e tailing, cambio di modelli ed estensione, l'aggiunta di schede e amplificazione, selezione dimensione biblioteca e purificazione secondo le istruzioni del produttore.
      1. Dopo denaturazione di dsDNA, dephosphorylate estremità 3' di ssDNA di fosfatasi alcalina del gambero e aggiungere una coda di poli (T) l'anti-ssDNA transferasi terminale di deoxynucleotidyl.
      2. Temprare il Primer di DNA Poly (dA) per il modello di ssDNA per la replicazione del DNA e il cambio di modelli.
      3. Dopo il modello di commutazione, amplificare la biblioteca di ChIP-seq mediante PCR con primer forward e reverse per l'indicizzazione.
      4. Selezionare la PCR amplificato ChIP-seq libreria con frammenti che vanno da 250 a 500 bp da perline paramagnetici di opzione 2 per la selezione di dimensione doppia.
      5. Esaminare la qualità della libreria ChIP-seq selezionata utilizzando un dispositivo di elettroforesi capillare chip microfluidici.

3. analisi dei dati

  1. Preparare la struttura di directory.
    1. Creare una directory per eseguire l'analisi di dati di ChIP-seq. All'interno della directory appena creata, creare le sei sottodirectory con i seguenti nomi: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis e report.
  2. Preparare i dati ed effettuare analisi di controllo di qualità dei dati di sequenza crudo.
    1. Spostarsi nella directory "raw.files" e scaricare i file di dati di ChIP-seq.
    2. Verificare i nomi dei file. Se il sequenziamento è stato accoppiato-fine, ci saranno 4 file (due per il trattamento) e due per l'input con nomi di base simili: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq e PDGFRα_input.read2.fastq. Se i nomi dei file sono diversi, è possibile rinominarli utilizzando il comando "mv".
    3. Spostarsi nella directory "fastqc.output".
    4. Ottenere le metriche di controllo di qualità dal crude letture utilizzando un del software di controllo di qualità dei file fastq10. Utilizzare il comando in Figura S1A per eseguire il processo di controllo qualità separatamente per ogni file fastq. Il software mostrerà diverse metriche di controllo di qualità in un file html.
    5. Aprire il file di controllo di qualità di html e verificare il numero di letture, leggere la lunghezza, per qualità di sequenze di base, per punteggi di qualità di sequenza, sequenza GC contenuti contenuti, livelli di duplicazione di sequenza, adattatore e i kmer contenuti.
  3. Trim letture finali di bassa qualità e contenuto di adattatore.
    1. Osservare "Per qualità di sequenze di base" e "Adattatore contenuto" trame. Determinare la lunghezza di taglio per la testa e la coda di ogni lettura. Una lunghezza adeguata per la rifilatura è dove la qualità di base è inferiore a 30 e c'è prova del contenuto di adattatore.
    2. Spostarsi nella directory "raw.files".
    3. Scaricare e installare un software per la rimozione della legge11. Utilizzare il comando in Figura S1B per rifilatura sia nel trattamento che l'input separatamente. Parametro 'CROP' indica la lunghezza di lettura rimanente dopo la rifilatura basi dalla fine e 'HEADCROP' specifica il numero di basi per essere eliminati dall'inizio della lettura.
    4. Il comando ritaglio include anche la minima lunghezza per essere accettato dopo il filtraggio nel parametro 'MINLEN' di leggere. Se le letture sono almeno 50 bp, bp uso 35 come la soglia di lettura lunghezza.
    5. Spostarsi nella directory "fastqc.output".
    6. Eseguire l'analisi di controllo di qualità del file fastq dopo le letture di cantu. Verificare che sono stati risolti i problemi di controllo di qualità. Utilizzare il comando in Figura S1C per ottenere le metriche di controllo di qualità.
  4. Allineare le letture di ChIP-seq monolato o accoppiato-fine al genoma di riferimento del mouse.
    1. Passare alla directory "bowtie.output" per la mappatura.
    2. Scarica il genoma di riferimento GENCODE mm10 topo. Rinominare il genoma di riferimento del mouse mm10 come "mm10.fa".
    3. Scarica una lettura mapper12 e installarlo nel sistema.
    4. Creare un file di indice del genoma di riferimento scaricato utilizzando il comando in Figura S2A. Sei file vengono creati automaticamente: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 e mm10.rev.2.bt2.
    5. Utilizzare il comando in Figura S2B per eseguire l'allineamento e regolare il parametro "-p" al numero di core di elaborazione in base alle impostazioni di sistema. Se accoppiato-fine modalità di esecuzione, i parametri "-1" e "-2" indicano i nomi dei file fastq profilati.
      Nota: Mapping viene eseguita separatamente per gli esempi di trattamento e ingresso e uscita metrica log file vengono creati per ogni campione.
    6. Scaricare un software per manipolare i file in formato di SAM13 e installarlo nel sistema. Convertire il file SAM allineato in un file BAM utilizzando il comando in Figura S2C.
  5. Ottenere le metriche di controllo di qualità di letture mappate prima vetta chiamata per entrambi esempi di trattamento e controllo di fine accoppiato.
    1. Uno dei parametri più importanti di controllo di qualità all'indirizzo è la profondità di sequenziamento. Aprire il file "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" e "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" nella directory bowtie.output e verificare che il numero di coppie di lettura in modo univoco mappate in ogni campione è maggiore di 10 milioni.
    2. Spostarsi nella directory "homer.output".
    3. Scaricare un software per l'individuazione di motivi e di analisi di sequenziamento di nuova generazione14 e installarlo nel sistema.
    4. Creare una directory denominata "tagDir".
    5. Per verificare la clonalità di tag, utilizzare il comando raffigurato in Figura S3A. Il comando "makeTagDirectory" genererà quattro qualità controllo uscita files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt e tagLengthDistribution.txt.
    6. Spostarsi nella directory "tagDir".
    7. Copiare il file "tagCountDistribution.txt" nella directory "report".
    8. Spostare la directory "reports".
    9. Aprire il file tagCountDistribution.txt utilizzando un programma di foglio di calcolo e creare una barra di trama del numero di tag per ogni posizione genomica. Memorizzare il file di istogramma con il nome "tag.clonality.xlsx".
    10. Installare nel sistema di programmazione lingua15 R.
    11. Nel terminale, digitare 'R' e premere INVIO per accedere all'ambiente di programmazione R.
    12. Scaricare un pacchetto di R per l'elaborazione di dati ChIP-seq16 e installarlo utilizzando il comando raffigurato in Figura S3B.
    13. Utilizzare lo script di R in Figura S3C per tracciare la cross-correlazione di strand.
  6. Rilevazione dei picchi utilizzando un'utilità di mapping di picco.
    1. Spostarsi nella directory "macs2.output". Scaricare e installare un picco mapper17 nel vostro sistema.
    2. Utilizzare la funzione "callpeak" con il trattamento e controllare i file di BAM generati nel passaggio 3.4.6.
      Nota: Altri parametri includono "-f" per il formato di file di input, "-g" per la dimensione del genoma, "-nome" per indicare il nome di base di tutti i file di output, e "-B" per memorizzare il pile-up frammento in formato bedgraph. Il picco completo comando è incluso nel Figura S4A. Utilizzare BEDPE per campioni accoppiato-fine.
    3. Verificare che il mapper di picco generato sei file: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg e PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. Aprire il file PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls per visualizzare i picchi chiamati, posizione, lunghezza, posizione di vertice, pile-up e le metriche di arricchimento di picco:-log10(pvalue), piegare arricchimento e - log10(q-value).
  7. Filtrare e annotare chiamati cime.
    1. Utilizzando il file aperto nel passaggio precedente, con conseguente filtro picchi secondo l'arricchimento di piega, il p-value e/o il valore di q. Per decidere adeguate soglie di filtraggio, fare una trama di istogramma per determinare la densità di ogni metrica. Filtrare i valori sotto una soglia selezionata per ottenere picchi significativi.
    2. Scarica la lista nera mm10 (regioni sono noti per avere segnale artificialmente alto) e filtro fuori il ChIP-seq picchi che sono all'interno di qualsiasi di quelle regioni di artefatto.
    3. Creare un file di letto con le cime filtrate contenente le colonne seguenti: cromosoma, inizio, fine, peakID, derisione e strand. Riempire la colonna finta con un punto "." poiché non viene utilizzato. Nella colonna strand, di tutti i valori "+". Salvare il file letto come "filtered.peakData2.bed".
    4. Copiare il file "filtered.peakData2.bed" nella directory "report".
    5. Spostare la directory "reports".
    6. Per annotare il filtrato picchi ad una regione del gene specifico, utilizzare la funzione "annotatePeaks" con il file letto creato nel passaggio precedente. Il comando utilizzato è mostrato in Figura S5A.
    7. Aprire il file "filtered.annotatedPeaks.txt" utilizzando un software statistico.
    8. Filtro risultante picchi che si trova in una regione intergenica ad una distanza maggiore di 5 kb da un TSS con annotazioni. Utilizzare la colonna "Distanza di TSS" nel file come la distanza per il filtraggio. Conservare le cime filtrate in un file di excel denominato "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. Archivio risultante filtrata picchi in un file bedGraph con colonne: cromosoma, inizio, fine e - log10(q-value). Nome del file "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. Generare file di Parruccone per la visualizzazione del browser.
    1. Scaricare e installare un software per genoma aritmetica18.
    2. Uno strumento per la conversione bedgraph parruccone di scaricare e installare nel sistema. Scaricare il file 'mm10.chrom.sizes'.
    3. Utilizzare il comando in Figura S6A per generare un file di Parruccone.
    4. Scaricare e installare un browser di genoma19 nel sistema.
    5. Aprire il browser del genoma e caricare il file "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" per visualizzare i filtrato picchi significativi e la loro posizione nei confronti di geni noti.
  9. Ricerca di motivi.
    1. Spostarsi nella directory "motif.analysis".
    2. Scarica un motif de novo di scansione e il programma di arricchimento di motivo e installare nel tuo sistema20.
    3. Scaricare un database di motivo completa che comprende motivi di Olig2.
    4. Ottenere le sequenze genomiche di 500 regioni bp centrate in occasione dei vertici picco significativo. Memorizzare le sequenze come peak.sequences.txt. Utilizzare il comando in Figura S7 per la ricerca di motivi di Olig2 all'interno di ciascuna delle regioni di picco bp 500.
    5. Filtrare i motivi risultanti utilizzando un adeguato valore di E (predefinito = 0,05).

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Risultati

Basso-cella ChIP-seq è stata effettuata e analisi bioinformatiche sono stati fatti per studiare le interazioni potenziali del fattore trascrizionale Olig2 con DNA genomico in cervello acutamente purificato OPCs. La figura 1 Mostra un flusso di lavoro generale sia sperimentale che le procedure di analisi dei dati. In questo protocollo, cervelli di topi postnatali fossero dissociati in sospensione unicellulare. Dopo dissociazione del tessuto, immunopanning è st...

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Discussione

Reti di regolazione genica dei mammiferi sono molto complesse. ChIP-seq è un potente metodo per indagare le interazioni proteina-DNA del genoma. Questo protocollo comprende come eseguire Olig2 ChIP-seq utilizzando un basso numero di OPCs purificato da cervelli di topo (bassi quanto 20 mila cellule per reazione). Il primo passo fondamentale per questo protocollo è la purificazione di OPCs da cervelli di topo di immunopanning con l'anticorpo PDGFRα. Per la selezione positiva di OPCs con piastre PDGFRα rivestito, OPCs spess...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

JQW, XD, RCDD e YY sono stati supportati da concessioni dagli istituti nazionali di salute R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; Irene Ogilvie fondo-Memorial Hermann Fondazione; l'iniziativa di cervello di UTHealth e CTSA UL1 TR000371; e una borsa di studio presso la University of Texas sistema di Neuroscienze e Neurotecnologie Research Institute (Grant n. 362469).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagent/ Equipment
Banderiaea simplicifolia lectina 1Vector Laboratories# L-1100
Rat anti-PDGFRa antibodyBD Bioscience# 558774
Kit di dissociazione del tessuto neurale (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
AccutaseSTEMCELL technologies# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Anti-NG2 Condroitin Solfato ProteoglicanoAnticorpo Milliporo# AB5320
Bioruptor Pico dispositivo di sonicazioneDiagenode# B01060001
True MicroChIP kitDiagenode# C01010130
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v)Thermo Fisher# 15593031
Kit per la pulizia di gel e PCR NucleoSpinMACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seq kitClontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
pico-verdeThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR Miscela master verdeBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Penicillina-streptomicina (P/S)Fisher Scientific# 15140122
Integratore N-2Fisher Scientific# 17502048
Integratore B-27Fisher Scientific# 17504044
insulinaSigma# I6634Preparare 0,5 mg/ml di soluzione di insulina sciogliendo 5 mg di insulina in 10 ml di acqua e 50 μ l di 1 N HCl.
Albumina sierica bovina, adatta per colture cellulari (BSA)Sigma# A4161Preparare una soluzione BSA al 4% sciogliendo 4 g di BSA in 100 ml di D-PBS e regolare il pH a 7,4 Proteina
di base del fattore di crescita dei fibroblasti, ricombinante umano (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
poli-D-lisinaVWR# IC15017510Preparare 1 mg/ml di soluzione di poli-D-lisina sciogliendo 10 mg di poli-D-lisina in 10 ml di acqua e diluire 100 volte durante l'uso.
Piastre di Petri monouso Falcon, sterili, Corning, 100x15mmVWR# 25373-100
Piastre di Petri monouso Falcon, sterili, Corning, 150x15mmVWR# 25373-187
HBSS, 10X, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo RedFisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
cocktail di inibitori della proteasiSigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Ottenere metriche di controllo qualità delle letture grezze e rifilate
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticTagliare e filtrare le
letture grezzeGENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzGenoma di riferimento del topo
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlAllineamento delle letture a un genoma di riferimento
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/Conversione del file SAM in formato BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/Creazione di una directory di tag e annotazione di regioni genomiche arricchite con simboli genici
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/Programmazione di script e funzioni di esecuzione
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppCreazione di un grafico di correlazione incrociata dei filamenti
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSTrovare regioni di arricchimento ChIP su controllo
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Aritmetica del genoma
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/Conversione del file bedGraph in bigwig
IGV browser 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/Visualizzazione e navigazione di Picchi ChIP-seq significativi
ExcelSpreasheet program
ENCODE blacklisthttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsFiltrando i picchi
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.Conversione del file bedGraph nel
database dei motivi di bigwig ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/Database completo dei motivi richiesto per l'arricchimento dei motivi
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlAnalisi dell'arricchimento dei motivi e scoperta dei motivi
Nomi dei primer utilizzati per qPCRSequenze di primer utilizzate per qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
Microsoft

Riferimenti

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ChIP-seq per Olig2cellule PDGFR-alfa positivecellule precursori degli oligodendrocitiprocedura di immunopanningframmentazione della cromatinaanalisi bioinformaticasiti di legame a livello dell'intero genomaanalisi dei fattori di trascrizionepurificazione di cellule primarie
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