Qui presentiamo un protocollo che è stato progettato per analizzare l'associazione genoma del fattore di trascrizione del oligodendrocyte 2 (Olig2) in cellule del precursore del oligodendrocyte cervello acutamente purificato (OPCs) eseguendo immunoprecipitazione della cromatina basso-cella (ChIP) , libreria preparazione, high throughput sequenziamento e analisi bioinformatica dei dati.
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Articolo metodologico
Identificare i siti di fattore di trascrizione Olig2 associazione genomico in acutamente purificato PDGFRα + cellule di immunoprecipitazione della cromatina Low-cella ordinamento dell'analisi
In questo articolo
Sommario
Abstract
In cellule di mammifero, trascrizione genica è disciplinata in modo specifico di cella tipo le interazioni dei fattori trascrizionali con DNA genomico. Fattori di trascrizione Lineage-specifici sono considerati svolgono un ruolo essenziale nella specifica delle cellule e differenziazione durante lo sviluppo. ChIP accoppiato con sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) è ampiamente usato per analizzare i siti di legame del genoma di fattori di trascrizione (o suo complesso associato) di DNA genomico. Tuttavia, un numero elevato di celle è necessario per una reazione di ChIP standard, che lo rende difficile da studiare il numero limitato di cellule primarie isolate o popolazioni di cellule rare. Al fine di comprendere il meccanismo di regolazione di trascrizione lineage-specifici del oligodendrocyte fattore Olig2 nel topo acutamente purificata OPCs, un metodo dettagliato utilizzando ChIP-seq per identificare i siti di legame del genoma di Olig2 (o Olig2 complesso) viene visualizzato. In primo luogo, il protocollo spiega come purificare l'alfa del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) positivo OPCs da cervelli di topo. Successivamente, Olig2 anticorpo mediato ChIP e la costruzione della libreria vengono eseguite. L'ultima parte viene descritto il software bioinformatico e procedure utilizzate per l'analisi di Olig2 ChIP-seq. In sintesi, questa carta segnala un metodo per analizzare le associazioni di genoma del fattore trascrizionale Olig2 nel cervello acutamente purificato OPCs.
Introduzione
È importante studiare la proteina (o complesso proteico) DNA binding e i segni epigenetici per costruire reti di regolazione trascrizionale coinvolti nei vari processi biologici. In particolare, le associazioni di fattori di trascrizione da DNA genomic possono giocare un ruolo importante nella regolazione genica, la differenziazione cellulare e lo sviluppo del tessuto. Un potente strumento per lo studio della regolazione trascrizionale e meccanismi epigenetici è immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). A causa dei rapidi progressi nella tecnologia di sequenziamento di nuova generazione, ChIP accoppiato con sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) viene....
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Protocollo
Tutti i uso animale e protocolli sperimentali erano eseguiti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dal Comitato istituzionale biosicurezza e Animal Welfare Committee presso la University of Texas Health Science Center at Houston.
1. purificazione di cellule Lineage Oligodendrocyte PDGFRα Positive dal cervello di topo (modificato dal immunopanning precedentemente descritti protocolli5,6,7)
- Preparazione di un piatto di immunopanning per la selezione positiva delle cellule PDGFRα e 2 pi....
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Risultati
Basso-cella ChIP-seq è stata effettuata e analisi bioinformatiche sono stati fatti per studiare le interazioni potenziali del fattore trascrizionale Olig2 con DNA genomico in cervello acutamente purificato OPCs. La figura 1 Mostra un flusso di lavoro generale sia sperimentale che le procedure di analisi dei dati. In questo protocollo, cervelli di topi postnatali fossero dissociati in sospensione unicellulare. Dopo dissociazione del tessuto, immunopanning è st.......
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Discussione
Reti di regolazione genica dei mammiferi sono molto complesse. ChIP-seq è un potente metodo per indagare le interazioni proteina-DNA del genoma. Questo protocollo comprende come eseguire Olig2 ChIP-seq utilizzando un basso numero di OPCs purificato da cervelli di topo (bassi quanto 20 mila cellule per reazione). Il primo passo fondamentale per questo protocollo è la purificazione di OPCs da cervelli di topo di immunopanning con l'anticorpo PDGFRα. Per la selezione positiva di OPCs con piastre PDGFRα rivestito, OPCs spess.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
JQW, XD, RCDD e YY sono stati supportati da concessioni dagli istituti nazionali di salute R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; Irene Ogilvie fondo-Memorial Hermann Fondazione; l'iniziativa di cervello di UTHealth e CTSA UL1 TR000371; e una borsa di studio presso la University of Texas sistema di Neuroscienze e Neurotecnologie Research Institute (Grant n. 362469).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectina 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Kit di dissociazione del tessuto neurale (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Condroitin Solfato Proteoglicano | Anticorpo Milliporo | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico dispositivo di sonicazione | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| Kit per la pulizia di gel e PCR NucleoSpin | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-verde | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Miscela master verde | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillina-streptomicina (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| Integratore N-2 | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| Integratore B-27 | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulina | Sigma | # I6634 | Preparare 0,5 mg/ml di soluzione di insulina sciogliendo 5 mg di insulina in 10 ml di acqua e 50 μ l di 1 N HCl. |
| Albumina sierica bovina, adatta per colture cellulari (BSA) | Sigma | # A4161 | Preparare una soluzione BSA al 4% sciogliendo 4 g di BSA in 100 ml di D-PBS e regolare il pH a 7,4 Proteina |
| di base del fattore di crescita dei fibroblasti, ricombinante umano (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poli-D-lisina | VWR | # IC15017510 | Preparare 1 mg/ml di soluzione di poli-D-lisina sciogliendo 10 mg di poli-D-lisina in 10 ml di acqua e diluire 100 volte durante l'uso. |
| Piastre di Petri monouso Falcon, sterili, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Piastre di Petri monouso Falcon, sterili, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| cocktail di inibitori della proteasi | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Ottenere metriche di controllo qualità delle letture grezze e rifilate | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Tagliare e filtrare le | |
| letture grezzeGENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Genoma di riferimento del topo | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Allineamento delle letture a un genoma di riferimento | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Conversione del file SAM in formato BAM | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creazione di una directory di tag e annotazione di regioni genomiche arricchite con simboli genici | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programmazione di script e funzioni di esecuzione | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creazione di un grafico di correlazione incrociata dei filamenti | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Trovare regioni di arricchimento ChIP su controllo | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Aritmetica del genoma | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Conversione del file bedGraph in bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualizzazione e navigazione di Picchi ChIP-seq significativi | |
| Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtrando i picchi | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Conversione del file bedGraph nel | |
| database dei motivi di bigwig ENCODE | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Database completo dei motivi richiesto per l'arricchimento dei motivi | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Analisi dell'arricchimento dei motivi e scoperta dei motivi | |
| Nomi dei primer utilizzati per qPCR | Sequenze di primer utilizzate per qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
Riferimenti
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsi....
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Ristampe e permessi
