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Articolo metodologico

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

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⸱

DOI:

10.3791/57569

⸱

6 ottobre 2018

 , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, Department of Physiology and Pharmacology, Chang Gung University, 2Healthy Aging Research Center, Chang Gung University, 3Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital

In questo articolo

Sommario

Colture primarie di radice dorsale (DRG) i gangli sono frequentemente utilizzati per studiare funzioni fisiologiche o eventi relativi alla patologia nei neuroni sensoriali. Qui, noi dimostrare l'uso di colture di DRG lombare per rilevare il rilascio dei neurotrasmettitori dopo tipo del ricevitore di neuropeptide FF 2 stimolazione con un agonista selettivo.

Abstract

Gangli delle radici dorsali (DRG) contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali. Questo tipo di neurone è pseudo-unipolare, con due assoni che innervano tessuti periferici, quali pelle, muscolo e organi viscerali, come pure il corno dorsale spinale del sistema nervoso centrale. Neuroni sensoriali trasmettono sensazione somatica, tra cui touch, dolore, sensazioni termiche e propriocettivi. Di conseguenza, colture primarie di DRG sono ampiamente usati per studiare i meccanismi cellulari della nocicezione, funzioni fisiologiche dei neuroni sensoriali e lo sviluppo neurale. I neuroni in coltura possono essere applicati negli studi di elettrofisiologia, trasduzione del segnale, rilascio di neurotrasmettitori o l'imaging del calcio. Con colture primarie di DRG, gli scienziati possono coltura neuroni DRG dissociati per monitorare i cambiamenti biochimici nella singola o più celle, superando molti dei limiti connessi con esperimenti in vivo . Rispetto al commercialmente disponibili linee di cellule di ibridoma DRG o immortalizzate linee neuronali DRG, composizione e le proprietà delle cellule primarie sono molto più simili ai neuroni sensoriali nel tessuto. Tuttavia, a causa del numero limitato di cellule coltivate primarie DRG che possono essere isolate da un singolo animale, è difficile effettuare gli schermi ad alta produttività per droga studi di targeting. Nell'articolo attuale, sono descritte le procedure per la raccolta di DRG e cultura. Inoltre, dimostriamo che il trattamento delle cellule coltivate di DRG con un agonista del recettore di neuropeptide FF tipo 2 (NPFFR2) per indurre il rilascio di neurotrasmettitori del peptide (peptide correlato al gene della calcitonina (CRGP) e sostanza P (SP)).

Introduzione

I corpi cellulari dei neuroni sensoriali sono contenuti all'interno di DRG. Questi neuroni sono pseudo-unipolari e innervano sia tessuti periferici e del sistema nervoso centrale. Le terminazioni del nervo periferico dei neuroni sensoriali si trovano nel muscolo, pelle, organi viscerali e osso, tra altri tessuti. Trasmettono segnali periferici sensazione al nervo terminazioni nel corno dorsale spinale e i segnali vengono poi trasmessi al cervello attraverso differenti vie ascendenti di sensazione somatica1,2. Sensazione somatica permette al corpo di sentire (cioè, touch, dolore e sensazioni termiche) e percepire il movimento e orientamento spaziale (sensazioni propriocettive)1,3. Ci sono quattro sottoclassi degli assoni afferenti primari, tra cui gruppo I (Aα) fibre che rispondono a propriocezione dei muscoli scheletrici, le fibre di gruppo II (Aβ) che rispondono a meccanorecettori della pelle, e gruppo III (Aδ) e le fibre di gruppo V (C) rispondere al dolore e temperatura. Solo le fibre C sono unmyelinated, mentre il resto sono myelinated ai gradi differenti.

Nocicettori sono neuroni sensitivi primari, che vengono attivati da stimoli nocivi (stimolazione meccanica, termica e chimica) che portano il potenziale di danno tissutale. Questi neuroni sono composti da fibre Aδ myelinated e1,unmyelinated fibre di C4. Le fibre Aδ esprimono i recettori per il fattore di crescita nervoso (NGF, recettore trkA), CGRP e SP. Le fibre C sono classificate come peptidergic sia non-peptidergic fibre C. D'altra parte, le fibre C non peptidergic esprimono i recettori per il fattore neurotrophic glial-derivato (recettori GDNF, RET e GFR), isolectin IB4 e ionici ATP canale sottotipo (P2X3)5,6,7. Nocicettori possono essere distinto dall'espressione di canali ionici e attivati da fattori neurotrofici, citochine, neuropeptidi, ATP o altro prodotto chimico composti8. Stimolazione, neurotrasmettitori, tra cui CGRP, SP e glutammato possono essere liberati dai terminali di neurone sensoriale nel corno dorsale spinale per trasmettere segnali nocicettivi2. DRG non solo sono composti da neuroni, ma contengono anche cellule gliali satellitare. Le cellule satelliti circondano i neuroni sensoriali e forniscono supporto meccanico e metabolico9,10. Interessante, ci è un corpo crescente di prova che indica che cellule glial satelliti in DRG possono essere coinvolto nella regolazione della sensazione di dolore11.

I neuroni sensoriali sono stati segnalati per essere il più frequentemente usato cellule neuronali primarie12 e è stato utilizzato per elettrofisiologia, trasduzione del segnale e gli studi di rilascio di neurotrasmettitore. Essi sono anche comunemente utilizzati per esplorare i meccanismi cellulari di sviluppo neuronale, dolore infiammatorio, dolore neuropatico, sensazione di pelle (come prurito) e assone escrescenza12,13,14,15. Colture primarie di DRG possono essere coltivati come neuroni dissociati per valutare i cambiamenti biochimici nella singola o più celle, permettendo agli scienziati di eseguire studi che non possono essere eseguiti in soggetti sperimentali. Recentemente, DRG sono state coltivate con successo dai donatori di organo umano che potrebbero beneficiare notevolmente ricerca traslazionale16. D'altra parte, i neuroni sensoriali possono essere coltivati anche come DRG espianti. Gli espianti DRG preservano l'architettura originale del tessuto dei neuroni, tra cui le cellule di Schwann e cellule gliali satellitare e sono particolarmente utili per studiare le interazioni tra cellule neuronali e non neuronali17. Colture primarie di DRG possono essere facilmente preparati all'interno di 2,5 h. La composizione delle cellule e le proprietà sono altamente riflettente dell'origine DRG, e come tale, DRG specifici (DRG lombare o toracica) possono essere raccolti secondo esigenze sperimentali. Colture di neuroni DRG embrionali e neonatali richiedono NGF sopravvivere e per indurre la crescita assonale, ma colture di neuroni adulti non richiedono l'aggiunta di fattori neurotrofici al media12,17. Ci sono anche linee di cellulari DRG-ibridoma commercialmente disponibili come CD7/23 e F11, che non richiedono l'uso di animali da esperimento. Tuttavia, la mancanza del catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 1 (TRPV1) espressione (un indicatore importante per piccoli neuroni sensoriali nocicettivi) e profili di espressione genica incongruenti limitano loro applicazioni18. Recentemente, cellulare di un neurone di DRG immortalata linee sono state derivate dal ratto (50B11)19 e del mouse (MED17.11)20, che sono adatti per uso in schermi di alto-rendimento per droga studi di targeting. Tuttavia, profili di espressione genica per queste linee cellulari ha ancora da eseguire. Così, gli esperimenti di convalida confrontando queste cellule immortalizzate ai neuroni sensoriali sono ancora in corso.

NPFFR2 viene sintetizzata in DRG e traslocata ai terminali del nervo sensoriale nel corno dorsale spinale21. In questo articolo, forniamo un protocollo per la coltura delle cellule DRG lombare e trattarli con un agonista di NPFFR2 per indurre il rilascio di neurotrasmettitori, CGRP e SP. La dipendenza da NPFFR2 è ulteriormente testato utilizzando NPFFR2 Short interfering RNA (siRNA), che può essere transfected nelle cellule coltivate del DRG.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti nel presente documento che utilizzano animali da esperimento sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e utilizzare Committee (IACUC) di Chang Gung University (CGU 13-014).

1. raccogliere lombare DRG da ratti sperimentali

  1. Utilizzare 2 a ratti Sprague-Dawley (deviazione standard) di 3 settimane per lombare DRG insieme.
    Nota: I neuroni DRG raccolti da ratti di età superiore a 4 settimane non si sviluppano bene sotto le condizioni della coltura descritte nel presente documento.
  2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave.
  3. Anestetizzare il topo con una miscela 1:1 di tiletamina e zolazepam (20 mg/kg; iniezione intraperitoneale (IP)) e attendere finché l'animale non indica nessuna risposta di piede-ritiro in una prova di punta-pizzico.
    Nota: Anestesia diverse strategie possono essere usate con successo in questo protocollo.
  4. Sacrificare il ratto per decapitazione con una ghigliottina commerciale.
  5. Utilizzare la ghigliottina per isolare il tronco del corpo del ratto tra la zampa anteriore e del femore. Vedere Figura 1A per un diagramma della regione ad essere raccolti.
    Nota: La linea di taglio caudale deve essere solo rostral al femore. Se il sito di taglio è troppo alto della colonna vertebrale sarà escisse lombare DRG L6.
  6. Tagliare lungo lo sterno e rimuovere tutti gli organi/tessuti con le forbici di dissezione (Figura 2A-un).
  7. Tagliare lungo il lato del tronco per raccogliere la parte dorsale del ratto e rimuovere la pelle. Vedere Figura 1B per una fotografia del tronco dorsale dissecata.
  8. Preparare il tessuto sul ghiaccio prima di raccogliere DRG. Pulire il pelo e il sangue dai guanti e sterilizzarli con etanolo 75% prima di procedere al passaggio successivo.
  9. Rimuovere i muscoli che coprono il rachide lombare. In primo luogo, fare due tagli lungo i lati della colonna vertebrale (sinistra e destra) e un taglio laterale per contrassegnare l'estensione rostrale del rachide lombare. Quindi, rimuovere la muscolatura dorsale della spina dorsale con tagliaosso (Figura 2A-b).
  10. Rimuovere la porzione dorsale delle vertebre con tagliaosso ed esporre il midollo spinale.
  11. Rimuovere la colonna vertebrale con forbici per dissezione (Figura 2A-c) e forcipe (Figura 2A-d).
  12. Identificare il DRG lombare contando vertebre dall'ultima costola (13 Vertebra toracica). Vedere Figura 1 per un diagramma delle posizioni vertebre.
  13. Raccogliere il DRG lombare bilaterale (L1-L6) con micro-forbici (Figura 2A-f) in una piastra di coltura di 35mm con 2 mL di terreno ghiacciato di privo di siero. Rimuovere le fibre neuronali (come indicato in Figura 1) dal collegamento di DRG, quindi trasferirlo nella piastra di coltura per migliorare la purezza delle culture.
    Nota: Il DRG raccolti può essere mantenuto in mezzo sul ghiaccio per circa 1 h. Nel frattempo, più ratti possono essere euthanized per creare un bacino più ampio di DRG.

2. primaria cultura di ratto legname DRG

Nota: La procedura seguente deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare.

  1. Preparare il terreno di coltura contenente 10% siero bovino fetale, piruvato di sodio 100 mM e 1 x penicillina/streptomicina in 1 x DMEM-F12.
  2. Cappotto della coltura delle cellule trattate piastra a 24 pozzetti con 200 µ g/mL poli-L-lisina per 2 h quindi lavare con acqua sterilizzata.
  3. Pre-Incubare la piastra di coltura con 1 mL di coltura in incubatore a 37 ° C CO2 prima dell'uso per almeno 30 min.
  4. Trasferire il piatto di 35mm DRG-contenenti in una cappa laminare e lavare il DRG con medium senza siero 3 volte dalla pipetta.
    Nota: L'esterno del piatto dovrebbe essere pulito con etanolo al 75% prima del trasferimento nel cofano. Il piatto di 35mm può contenere DRG da un numero di ratti (questo dipenderà sulle esigenze del disegno sperimentale).
  5. Spostare il DRG (da un ratto singolo o combinato dai ratti più) per una nuova piastra di coltura di 35 mm, che contiene 2 mL di collagenasi tipo IA (1 mg/mL in medium senza siero) con pinzette sterili (Figura 2A-e).
    Nota: La soluzione di collagenasi deve essere sterilizzata facendolo passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm.
  6. Digerire il DRG nella soluzione della collagenosi in incubatore a 37 ° C CO2 per 30 min.
  7. Rimuovere la soluzione di collagenasi e lavare il DRG 3 volte in 2 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS).
    Nota: Ci possono essere fibre residue o tessuti che si staccano il DRG nella soluzione. Rimuoverli dalla pipetta con la soluzione di lavaggio.
  8. Aggiungere 2 mL pre-riscaldati 0.05% tripsina-EDTA nel DRG-contenente 35 mm piatto e digerire il DRG in incubatore a 37 ° C CO2 per 30 min.
  9. Trasferimento da 2 mL di soluzione contenente DRG a una provetta da centrifuga da 15 mL in vetro pipetta.
    Nota: Il DRG potrebbe attenersi alla pipetta di vetro così questo passaggio deve essere eseguito con cautela. Perdita DRG può essere evitata mantenendo la soluzione contenente DRG nell'estremità conica di una pipetta di vetro (circa 0,5 mL) e trasferire la soluzione nella provetta della centrifuga lentamente ma senza sosta.
  10. Centrifughi la soluzione a 290 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e aggiungere un altro 2 mL medium senza siero per risospendere il DRG.
  11. Ripetere il passo 2.10 2 volte ma cambiamento medio privo di siero e terreno di coltura pre-riscaldato l'ultima volta.
  12. Triturare manualmente il DRG circa 60 volte usando una pipetta di Pasteur lucidato a fiamma (lunghezza 230 mm e punta testa diametro interno 1 mm). Vedere Figura 2B per una fotografia confrontando l'orifizio di una pipetta di Pasteur fiamma-lucidato per una pipetta non-lucido.
    Nota: All'interno diametro della pipetta Pasteur lucidato a fiamma è circa il 10% più piccolo della pipetta di controllo e all'interno dell'estremità conica dovrebbe essere più agevole. Fare attenzione a non creare bolle quando le cellule di triturazione.
  13. Rimuovere il piatto di poli-L-lisina-rivestito dall'incubatrice di CO2 . Aspirare il terreno di coltura incubato dal piatto e le cellule dissociate sul piatto da portata rivestito di semi.
  14. Le cellule DRG da un ratto (collezione bilaterali da L1-L6, per 12 totale DRG) del seme in quattro pozzetti di una piastra a 24 pozzetti; Ci sono circa 5 x 104 cellule in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
    Nota: Questa densità è adatto per la rilevazione del CGRP rilasciato o SP e anche adatto per immunostaining. Western blot o estrazione del RNA, seme le cellule DRG da un ratto (bilaterali L1-L6) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
  15. Sostituire il terreno di coltura il giorno seguente con l'aggiunta di 10 µM citarabina (Ara-C) e 100 ng/mL NGF e aggiornare il mezzo ogni due giorni da allora in poi.
    Nota: Il DRG toracica inoltre possono anche essere coltivate dal presente protocollo, se sono stati raccolti da spina dorsale toracica.

3. la transfezione di siRNA NPFFR2 in cellule di DRG

  1. Eseguire la transfezione di siRNA NPFFR2 e controllo siRNA secondo il protocollo del produttore.
    Nota: Il protocollo dovrà essere adattata se il reagente di transfezione selezionate è diverso da quello che abbiamo usato (Vedi la Tabella materiali).
  2. Il giorno 3 dopo il placcaggio di cella, modificare il mezzo in medium senza siero pre-calda in 0,5 mL e incubare il DRG in incubatore a 37 ° C CO2 per 1 h.
  3. Aggiungere 50 nM di siRNA (in acqua di RNAsi-libera 1 µ l) in 12,5 µ l medium privo di siero.
  4. Aggiungere 2,5 µ l di reagente di transfezione in medium senza siero di 10 µ l.
  5. Miscelare la soluzione dalla soluzione di punti 3.3 e 3.4 di pipettare ed incubare la transfezione mista per 10 min a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere la soluzione di transfezione in una piastra di 24 pozzetti contenenti DRG e mescolare la soluzione con il mezzo di agitazione delicata.
    Nota: Soluzioni di transfezione Multiple devono essere distribuite allo stesso tempo se pozzi multipli devono essere transfected.
  7. Incubare il DRG in incubatore a 37 ° C CO2 per 6 h.
  8. Aggiungere 0,5 mL/bene di terreno di coltura contenente 20% siero bovino fetale, piruvato di sodio 100 mM e 1 x penicillina/streptomicina in 1 x DMEM-F12, con l'aggiunta di 10 µM Ara-C e 100 ng/mL di NGF, nella piastra a 24 pozzetti.
  9. Incubare il DRG in incubatore a 37 ° C CO2 per altri 66 h (Aggiorna il mezzo a 48 h).

4. rilascio di neurotrasmettitori dalle cellule primarie di DRG

  1. Il giorno 6 dopo che le cellule erano cromate (72 ore dopo la trasfezione di siRNA), cambiare il mezzo di coltura privo di siero medio di 200 µ l e incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C CO2 per 30 min.
  2. Aggiungere 1 µ l stimolazione pompati e mescolare delicatamente il supporto di pipettaggio. Incubare il piatto in un incubatore a 37 ° C CO2 per il tempo designato.
    Nota: In questo articolo, le cellule coltivate sono state stimolate con l'agonista NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), per 1 h.
  3. Raccogliere il terreno di coltura dalla piastra di coltura e centrifugare a 5.000 x g per 5 min a 4 ° C per rimuovere eventuali impurità sospesa.
  4. Raccogliere il surnatante dalla centrifugazione e diluire i campioni con tampone fosfato salino (PBS), come necessario. Analisi dei livelli di neurotrasmettitori con kit di enzima immunoassay (via).
    Nota: Qui, i surnatanti sono stati diluiti 1: 100 prima di analizzare il livello di CGRP. Il surnatante è non stato diluito prima di analizzare il livello di SP.

5. CGRP e SP EIA

  1. Analizzare i campioni immediatamente secondo protocollo CGRP o SP EIA kit del produttore.
    Nota: Il protocollo variano a seconda del kit utilizzato.
  2. Lavare i pozzetti di CGRP EIA 5 volte con tampone di lavaggio fornito all'interno del kit.
  3. Aggiungere 100 µ l campioni con tracciante dell'acetilcolinesterasi (AChE) di 100 µ l anti-CGRP nei pozzetti CGRP EIA e aggiungere 50 campioni di µ l, 50 µ l anti-SP AChE tracer e antisiero di anti-SP 50 µ l nei pozzetti SP EIA.
  4. Sigillare i pozzetti CGRP e SP con film plastico che viene fornito all'interno del kit.
  5. Incubare i pozzetti durante la notte a 4 ° C.
  6. Lavare i pozzetti 5 volte con CGRP o SP tampone di lavaggio e rimuovere tutta la soluzione residua dai pozzi.
  7. Aggiungere il reagente di Ellman 200 µ l nei pozzetti CGRP o SP che viene fornito all'interno del corrispondente kit EIA.
  8. Incubare per 30 min a temperatura ambiente CGRP e SP Incubare per 90 min a temperatura ambiente. Proteggere i pozzi dalla luce per entrambe le analisi.
  9. Leggere le piastre a nm di lunghezza d'onda 414 e calcolare i risultati secondo il corrispondente strumento EIA.
    Nota: Evitare di toccare il fondo dei pozzetti a mano tutto il tempo e pulire le macchie di acqua dalla parte inferiore ben da lente salviettine prima di aggiungere il reagente di Ellman.

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Risultati

Neuroni DRG lombari del ratto, coltivati in una piastra a 24 pozzetti, sono stati coltivati in terreno di coltura con ulteriori Ara-C per inibire la proliferazione delle cellule gliali e NGF per sostenere la crescita neuronale. La morfologia di vivere cellule DRG è stata osservata. Come mostrato nella Figura 3, il corpo cellulare di un singolo neurone era attaccato sul fondo di un piatto al giorno 1 e selezionato per l'osservazione. Crescita dell'assone è sta...

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Discussione

Nel presente articolo, dimostriamo la collezione, enzima-dissociazione e la cultura di lombare ratto DRG. Con il supporto di neurotrophic da NGF, gli assoni dei neuroni DRG esteso entro 3 giorni dopo la semina delle cellule. Gli assoni estesi erano chiaramente osservabili dopo che le cellule sono state macchiate per proteina CGRP, che è sintetizzata nel soma cellulare e trasportata lungo le fibre dell'assone. I processi delle cellule satelliti anche estese, permettendo queste cellule gliale divisione a circondare i neuro...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. M. Calkins per l'editing di inglese. Questo lavoro è stato supportato da Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) e Ministero della scienza e tecnologia (105-2320-B-182-012-MY2).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Miscela di tiletamina e zolazepam (Zoletil)VirbacZoletil 50anestetico
Siero fetale bovinoBiological Industries04-001-1Coltura Medio
piruvato di sodioSigmaS8636Coltura Media
penicillina/streptomicinaBiological Industries03-033-1Terreno di coltura
DMEM-F12Terrenodi coltura Invitrogen 12400024
Poli-l-lisinaSigmaP9011Piatto di rivestimento
Collagenasi IASigma9001-12-1Digestione enzimatica
Soluzione salina bilanciata di HankInvitrogen14170-112Terreno di coltura
Tripsina EDTABiological Industries03-051-5Digestione enzimatica
Pasteur pipettaHilgenberg3150102Triturazione cellulare
Citarabina (Ara-C)SigmaC6645Terreno di coltura
NGFMilliporeNC011Terreno di coltura
NPFFR2 siRNADharmaconL-099691-02-0005Trasfezione
SiRNA non miratoDharmaconL-001810-10-05Trasfezione
NeuroPORTER ReagenteGenlantisT400150Reagente di trasfezione
dNPAGenemed SynthesisN/AAgonista NPFFR2
CGRP ELISACayman589001EIA
SP ELISACayman583751EIA
CGRP AnticorpoCalbiochemPC205LIHC
DAPIRoche10236276001IHC

Riferimenti

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