Articolo metodologico

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

DOI:

10.3791/57577

⸱

3 agosto 2018

 ,  ,  , 
1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine, University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

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Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.

Abstract

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Plasticità fenotipica delle cellule endoteliali è alla base dello sviluppo del sistema cardiovascolare, malattie cardiovascolari e varie circostanze connesse con la fibrosi dell'organo. In queste condizioni, differenziate cellule endoteliali acquisiranno fenotipi mesenchymal-like. Questo processo è chiamato transizione endoteliali mesenchimali (EndMT) ed è caratterizzato da downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di indicatori mesenchymal e cambiamenti morfologici. EndMT è indotta da diverse vie di segnalazione, compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca e regolata da meccanismi molecolari simili a quelli di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) importante per gastrulazione, fibrosi del tessuto, e metastasi del cancro. Comprensione dei meccanismi di EndMT è importante sviluppare approcci diagnostici e terapeutici EndMT di targeting. Induzione robusto del EndMT in vitro è utile per caratterizzare comune firme di espressione di gene, identificare meccanismi molecolari trattabili e dello schermo per modulatori di EndMT. Qui, descriviamo un metodo in vitro per l'induzione di EndMT. Le cellule endoteliali microvascolari del pancreas di mouse MS-1 subiscono EndMT dopo una prolungata esposizione a TGF-β e mostrano upregulation dei marcatori mesenchimali ed i cambiamenti morfologici così come induzione di più infiammatoria chemochine e citochine. Sono inclusi anche i metodi per l'analisi dei microRNA (miRNA) modulazione. Questi metodi forniscono una piattaforma per studiare i meccanismi alla base di EndMT e il contributo di Mirna a EndMT.

Introduzione

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Transizione endothelial-mesenchimale (EndMT) è il processo mediante il quale una cellula endoteliale differenziata subisce una varietà di cambiamenti molecolari, risultante in un fibroblasto-come delle cellule mesenchimali1. EndMT è stato inizialmente descritto come una trasformazione delle cellule endoteliali durante lo sviluppo del cuore2,3. Nello sviluppo iniziale del cuore, il tubo del cuore è costituito da un endocardio interno e un esterno miocardio. Questi due strati sono separati da uno strato di matrice extracellulare chiamato la gelatina cardiaca. Le cellule embrionali endocardial, che acquisiscono gli indicatori delle cellule endoteliali, transitano in cellule mesenchimali, invadono la gelatina cardiaca sottostante e promuovano la formazione dei cuscini cardiaci, fornendo le basi per le valvole atrioventricolari e setto e le valvole semilunari. Inoltre, EndMT è stata suggerita per essere fonti di periciti e cellule muscolari lisce vascolari in altri sistemi vascolare embrionale tra cui vasi coronarici, aorta addominale e dell'arteria polmonare4,5,6. Inoltre, EndMT è implicato nella fisiologico angiogenici spuntano7.

Raccogliendo la prova ha suggerito che EndMT è anche coinvolto in molteplici malattie cardiovascolari e altre malattie1,8. EndMT-collegato condizioni includono calcificazione vascolare, aterosclerosi, ipertensione arteriosa polmonare, malformazione cavernosa, fibrosi dell'organo, che ritocca dell'innesto della vena, disfunzione dell'allotrapianto in trapianto di rene e cancro8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un recente rapporto descritto che diversi marcatori molecolari di EndMT possono essere uno strumento per la stima di diagnosi e prognosi della disfunzione renale dell'innesto nel trapianto di rene17. Modulazione delle vie di segnalazione cellulare EndMT-correlati sono stati indicati per migliorare le condizioni di malattia diversi tra cui fibrosi cardiaca e vena innesto rimodellamento in animale modelli8,15. Pertanto, la comprensione dei meccanismi sottostanti EndMT è importante sviluppare strategie diagnostiche e terapeutiche EndMT di targeting.

EndMT è caratterizzata da perdita di giunzioni della cellula-cellula, aumento potenziale migratorio, downregulation dei geni endoteliali specifici quali VE-caderina e il upregulation dei geni mesenchimali compreso actina α-liscia del muscolo (α-SMA). Inoltre, EndMT e transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), un processo simile che converte le cellule epiteliali in cellule mesenchimali, sono associati con alterata produzione di vari componenti della matrice extracellulare, che possono contribuire allo sviluppo di tessuti fibrosi8,19.

Recentemente, parecchi studi in vitro di EndMT hanno delucidato dettagli dei meccanismi molecolari di EndMT15,20. EndMT è indotta da varie vie di segnalazione compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca1. Fra loro, TGF-β svolge ruoli fondamentali nell'induzione di EMT e di EndMT. In EndMT, prolungata esposizione ai risultati di TGF-β in EndMT in varie cellule endoteliali, mentre breve esposizione sembra essere insufficiente21. Abbiamo descritto qui un semplice protocollo per induzione di EndMT, in cui miglio SVEN 1 (MS-1) cellule endoteliali microvascolari del pancreas del mouse subiscono EndMT in vitro dopo l'esposizione prolungata a TGF-β20. In questo modello, più a valle analisi possono essere eseguite per studiare le caratteristiche di marchio di garanzia di EndMT, tra cui i cambiamenti morfologici, downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di mesenchymal marcatori e geni infiammatori, del citoscheletro riorganizzazioni e contrazione del gel di collagene.

I microRNA (Mirna) sono ~ 22 nt piccoli RNA regolatori che dirigono posttranscriptional repressione di vari mRNA target22,23. Attraverso il riconoscimento di destinazione di sequenza-mediata del seme, Mirna sopprimono centinaia di geni bersaglio e modulano varie funzioni cellulari quali la motilità, proliferazione e differenziazione cellulare. Questo è anche il caso di regolamento di EMT ed EndMT, e diversi miRNA sono stati segnalati come regolatori di EMT ed EndMT24,25. Il modello EndMT presentato in questa recensione sono facilmente abbinabili con procedure di modulazione di miRNA per testare i ruoli di Mirna in EndMT. L'esame attuale riassume le nostre procedure sperimentali per studiare EndMT TGF-β-indotta in cellule MS-1 e include anche il confronto delle condizioni di induzione di EndMT di TGF-β in altre cellule endoteliali.

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Protocollo

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1. induzione di EndMT

  1. Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard ed evitare confluency. Una fonte di cellule MS-1 è descritta nella Tabella materiali. Per cellule MS-1, è possibile utilizzare Medium-α minimo essenziale (MEM-α) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina.
  2. Cellule di lavare MS-1 su 10 cm piatto con 1x tamponato fosfato salino (PBS) e aggiungono 1,0 mL di tripsina alla piastra. Incubare per 5 min a 37 ° C.
  3. Staccare le celle utilizzando 9 mL di terreno di coltura. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300-400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il surnatante delicatamente e sospendere il pellet cellulare in terreni di coltura pre-riscaldato.
  6. Conteggio di cellule vitali utilizzando soluzione di blu di Trypan e un emocitometro standard o un contatore di cellule automatico.
  7. Cellule di piastra MS-1 sui piatti di coltura standard non patinata a 0,5 x 103 cellule per cm2 per lungo termine cultura. Ad esempio, cellule3 piastra 5,0 x 10 per pozzetto in un 6 culture ben piatto. Utilizzare lo stesso supporto di cultura, tra cui la stessa concentrazione di FCS. In cellule di MS-1, TGF-β induce EndMT nella coltura a lungo termine (almeno 48-72 h) con l'uso di FCS.
  8. Stimolare le cellule endoteliali con TGF-β2 (una concentrazione finale di 1 ng/mL) dopo 24 h.
  9. Cellule di cultura in un incubatore (5% CO2, 37 ° C). Monitorare quotidianamente le cellule quando messa a fuoco sui cambiamenti morfologici.
  10. Sostituire il supporto con mezzi di coltura pre-riscaldato fresco contenente TGF-β2 dopo 48 h del trattamento con TGF-β nella coltura a lungo termine.
  11. Procedere alle analisi a valle. In genere, riorganizzazione dell'actina è osservata dopo 24 h di trattamento e di marcatori endoteliali sottoregolazione di mesenchymal marcatori sono stati osservati dopo 48-72 h del trattamento con TGF-β.

2. immunocitochimica

  1. Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard.
  2. Le cellule di piastra MS-1 sui 4 cella ben diapositive camera cultura a 1,0 x 103 cellule per pozzetto (1,7 cm2). I vetrini sono pre-rivestiti con gelatina. Uso 0,5 – 1,0 mL di terreno di coltura per pozzetto.
  3. Stimolare le cellule endoteliali con TGF-β2 (una concentrazione finale di 1 ng/mL) dopo 24 h. Quando si analizza il coinvolgimento del ROCK in EndMT, aggiungere un 1 h prima ROCK inibitore Y-27632 (10 μM) al trattamento di TGF-β. Nel valutare l'effetto di inibizione di segnalazione di TGF-β, inibitori di chinasi del recettore TGF-β possono essere utilizzati.
  4. Cellule di cultura in un incubatore (5% CO2, 37 ° C). Riorganizzazione dell'actina è osservata in MS-1 cellule dopo 24 h di trattamento con TGF-β. Altre modifiche diventano evidenti dopo 48-72 h di trattamento. Per la cultura di 72 h, sostituire il supporto con TGF-β che contenevano fresco dopo 48 h del trattamento con TGF-β.
  5. Macchiatura di F-actina
    1. Dopo 24 h di trattamento di TGF-β, rimuovere i supporti, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS 1X per 20 min a temperatura ambiente e sciacquare le cellule con PBS 1X.
    2. Incubare con 0,2% Triton X-100 per 5 min a temperatura ambiente.
    3. Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
    4. Incubare con falloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato da Amanita phalloides diluito 150-fold con tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente.
    5. Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
    6. Macchia i nuclei con associazione di acido nucleico cianina coloranti per 5 min a temperatura ambiente.
    7. Diapositive di risciacquo e lamelle di Monte a faccia in giù su una diapositiva utilizzando diapositiva supporti di montaggio.
    8. Osservare con un microscopio confocale. Utilizzare laser a 543 nm e un filtro di emissione di 560 – 615 nm per il rilevamento della fluorescenza della falloidina. Utilizzare laser a 633 nm e un filtro di emissione più di 650 nm per la macchiatura nucleare. Sul trattamento con TGF-β, formazione di fibre spesse stress sarebbe essere osservati.
  6. VE-caderina e α-SMA macchiatura
    1. Dopo 72 h del trattamento di TGF-β, rimuovere i supporti, fissare le cellule con freddo metanolo al 50% e 50% di acetone (0,5 – 1,0 mL per pozzetto) per 5 min.
    2. Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X (0,5 – 1,0 mL per pozzetto).
    3. Incubare con gli anticorpi primari in tampone bloccante durante la notte a 4 ° C al buio secondo la concentrazione consigliata dal produttore. Uso dell'anticorpo monoclonale di VE-caderina (BV13, diluizione 1: 100) e α-SMA Cy3-coniugato anticorpo monoclonale (1A4, diluizione 1: 200)20.
    4. Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
    5. Incubare le cellule con un anticorpo secondario coniugato con colorante verde VE-caderina anticorpo in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente al buio secondo la concentrazione consigliata dal produttore.
    6. Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
    7. Macchia i nuclei con associazione di acido nucleico cianina coloranti per 5 min a temperatura ambiente.
    8. Diapositive di risciacquo e lamelle di Monte a faccia in giù su una diapositiva utilizzando diapositiva supporti di montaggio.
    9. Osservare con un microscopio confocale. Utilizzare laser a 543 nm e un filtro di emissione di 560 – 615 nm per il rilevamento di α-SMA (Cy3). Utilizzare laser a 488 nm e un filtro di emissione di 505 – 550 nm per il rilevamento di VE-caderina. In genere, sul trattamento con il trattamento di TGF-β, diminuire nei segnali di VE-caderina e avrebbe osservato aumento α-SMA segnali.

3. analisi di contrazione del Gel di collagene tridimensionale

  1. Eseguire colture di cellule di MS-1 con o senza TGF-β per 72 h prima dell'analisi di contrazione del gel di collagene.
  2. Preparare il tipo I gel di collagene sul ghiaccio. Mescolare la soluzione fredda collagene, 10x concentrata MEM medie e tampone di diluizione di collagene che contiene 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3e 200 mM HEPES pH 7,4 a un 8:1:1 rapporto.
  3. Mescolare 200 mL di controllo o sospensioni di cellule endoteliali TGF-β-trattati (1.0 x 106 cellule/200 μL) e 800 μl di soluzione di gel di collagene. Per TGF-β campioni trattati, aggiungere TGF-β2 (1 ng/mL) per la sospensione delle cellule.
  4. Aggiungere 1,0 mL della miscela in ciascun pozzetto di piatti di coltura 12-pozzetti e lasciar per solidificare in incubatore a 37 ° C per 30 – 60 min.
  5. Dopo la gelatinizzazione, sovrapporre 1,0 mL di MEM-α contenente 10% FCS, 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina a galleggiare il gel. Per TGF-β campioni trattati, aggiungere TGF-β2 (1 ng/mL) per i media.
    Nota: Per i campioni trattati TGF-β, aggiungere TGF-β sia il gel e terreni di coltura.
  6. Incubare i gel galleggianti a 37 ° C per 48 h.
  7. La scansione delle immagini di gel dalla parte inferiore delle piastre utilizzando uno scanner. In alternativa, registrare le immagini di gel utilizzando una fotocamera digitale ad una distanza fissa sopra il gel.
  8. Quantificare la superficie del gel, basata sul numero di pixel usando ImageJ. Selezionare il gel utilizzando una selezione a mano libera o strumenti di selezione relative al o l'utilizzo di gel "immagine | Regolare | Soglia di colore"tool e quindi determinare l'area di utilizzo di gel" Analyze | Comando di misura".

4. inibizione di miRNA attività di Locked Nucleic Acid-base miRNA inibitori

  1. Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard.
  2. Transfect Locked Nucleic Acid (LNA) inibitori di miRNA, miRNA sintetico su due piani o siRNA (20 o 50 nM) utilizzando reagenti lipofezione secondo le istruzioni del fabbricante. Dettagli e fonti di miRNA inibitori LNA, duplex sintetici miRNA e siRNA furono descritti nel nostro precedente report26,27. In MS-1 cellule, procedure di transfezione standard basate su istruzioni del fabbricante, funzionano bene per introduzione di LNA miRNA inibitori, miRNA sintetico su due piani o siRNA.
  3. Dopo 16 – 48 h, stimolano le cellule endoteliali con TGF-β2 (una concentrazione finale di 1 ng/mL).
  4. Procedere a varie analisi a valle, tra cui analisi di espressione (RT-PCR quantitativa e analisi di sequenziamento di RNA (RNA-seq)) RNA, analisi immunocytochemical e analisi del reporter. Analisi successive sono state descritte nel nostro precedente report20,26,27.

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Risultati

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TGF-β è un potente induttore di EndMT in varie cellule endoteliali. Dopo il trattamento 24 ore con TGF-β in cellule MS-1, macchiatura per F-actina Mostra riorganizzazione dell'actina stress fibre (Figura 1A)20. Il pretrattamento con un inibitore ROCK Y-27632 inibisce l'induzione di actina riorganizzazione20. MS-1 cellule endoteliali modificare da una classica morfologia di ciottoli-come a una morfologia fusiform...

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Discussione

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È stato segnalato che attivato trattamento Ras e TGF-β per 24 h ha indotto la EndMT in cellule di MS-1, mentre TGF-β da solo non è riuscito a indurre EndMT in questo breve periodo21. Coerentemente, abbiamo osservato che TGF-β sostanzialmente indotto EndMT dopo trattamento più lungo (48-72 h) in MS-1 cellule20. EndMT è stato più volte osservato dopo il trattamento prolungato con TGF-β (2 – 6 giorni) in varie cellule endoteliali come cordone ombelicale umano cellule endotelia...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Zea Borok e Kohei Miyazono per suggerimenti in preparazione del manoscritto. H.I.S e M.H. sono supportati da Uehara Memorial Foundation Research Fellowship e H.I.S è supportato dal Osamu Hayaishi Memorial Scholarship per studiare all'estero. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione da Takeda Science Foundation (A.S.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule MS-1Collezione di colture di tipo americanoCRL-2279
MEM-alfaThermo Fisher Scientific32571036
TGF-beta2R& D302-B2-002
pozzetti Lab-Tek II Chamber SlideThermo Fisher Scientific154526
Y-27632 Sigma-AldrichY0503
Blocco di unnacalai tesque03953-95
falloidina-tetrametilrodamina B isotiocianatoSigma-AldrichP1951
TOTO-3 ioduroThermo Fisher ScientificT3604
VE caderina anticorpo monoclonale (BV13)Thermo Fisher Scientific14-1441-82
alfa-SMA Anticorpo monoclonale Cy3 (1A4)Sigma-AldrichC6198
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11001
Vetrino coprioggettoThermo Fisher Scientific174934
Soluzione di collageneNitta gelatina Inc.Cellmatrix I-P
Tampone di diluizione del collageneNitta gelatin Inc.Cellmatrix IP,
inibitore del miRNA dell'LNAEXIQON miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Controllo Negativo B e miRNA bersaglio)
miRNA sintetico duplexQiagen miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778030
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027
4

Riferimenti

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