Articolo metodologico

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

DOI:

10.3791/57577

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3 agosto 2018

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1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine, University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

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Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.

Abstract

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Plasticità fenotipica delle cellule endoteliali è alla base dello sviluppo del sistema cardiovascolare, malattie cardiovascolari e varie circostanze connesse con la fibrosi dell'organo. In queste condizioni, differenziate cellule endoteliali acquisiranno fenotipi mesenchymal-like. Questo processo è chiamato transizione endoteliali mesenchimali (EndMT) ed è caratterizzato da downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di indicatori mesenchymal e cambiamenti morfologici. EndMT è indotta da diverse vie di segnalazione, compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca e regolata da meccanismi molecolari simili a quelli di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) importante per gastrulazione, fibrosi del tessuto, e metastasi del cancro. Comprensione dei meccanismi di EndMT è importante sviluppare approcci diagnostici e terapeutici EndMT di targeting. Induzione robusto del EndMT in vitro è utile per caratterizzare comune firme di espressione di gene, identificare meccanismi molecolari trattabili e dello schermo per modulatori di EndMT. Qui, descriviamo un metodo in vitro per l'induzione di EndMT. Le cellule endoteliali microvascolari del pancreas di mouse MS-1 subiscono EndMT dopo una prolungata esposizione a TGF-β e mostrano upregulation dei marcatori mesenchimali ed i cambiamenti morfologici così come induzione di più infiammatoria chemochine e citochine. Sono inclusi anche i metodi per l'analisi dei microRNA (miRNA) modulazione. Questi metodi forniscono una piattaforma per studiare i meccanismi alla base di EndMT e il contributo di Mirna a EndMT.

Introduzione

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Transizione endothelial-mesenchimale (EndMT) è il processo mediante il quale una cellula endoteliale differenziata subisce una varietà di cambiamenti molecolari, risultante in un fibroblasto-come delle cellule mesenchimali1. EndMT è stato inizialmente descritto come una trasformazione delle cellule endoteliali durante lo sviluppo del cuore2,3. Nello sviluppo iniziale del cuore, il tubo del cuore è costituito da un endocardio interno e un esterno miocardio. Questi due strati sono separati da uno strato di matrice extracellulare chiamato la gelatina cardiaca. Le cellule embrionali endocar....

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Protocollo

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1. induzione di EndMT

  1. Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard ed evitare confluency. Una fonte di cellule MS-1 è descritta nella Tabella materiali. Per cellule MS-1, è possibile utilizzare Medium-α minimo essenziale (MEM-α) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina.
  2. Cellule di lavare MS-1 su 10 cm piatto con 1x tamponato fosfato salino (PBS) e aggiungono 1,0 mL di tripsina alla piastra. Incubare per 5 min a 37 ° C.
  3. Staccare le celle utilizzando 9 mL di terreno di coltura. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
  4. Centrifugare l....

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Risultati

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TGF-β è un potente induttore di EndMT in varie cellule endoteliali. Dopo il trattamento 24 ore con TGF-β in cellule MS-1, macchiatura per F-actina Mostra riorganizzazione dell'actina stress fibre (Figura 1A)20. Il pretrattamento con un inibitore ROCK Y-27632 inibisce l'induzione di actina riorganizzazione20. MS-1 cellule endoteliali modificare da una classica morfologia di ciottoli-come a una morfologia fusiform.......

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Discussione

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È stato segnalato che attivato trattamento Ras e TGF-β per 24 h ha indotto la EndMT in cellule di MS-1, mentre TGF-β da solo non è riuscito a indurre EndMT in questo breve periodo21. Coerentemente, abbiamo osservato che TGF-β sostanzialmente indotto EndMT dopo trattamento più lungo (48-72 h) in MS-1 cellule20. EndMT è stato più volte osservato dopo il trattamento prolungato con TGF-β (2 – 6 giorni) in varie cellule endoteliali come cordone ombelicale umano cellule endotelia.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Zea Borok e Kohei Miyazono per suggerimenti in preparazione del manoscritto. H.I.S e M.H. sono supportati da Uehara Memorial Foundation Research Fellowship e H.I.S è supportato dal Osamu Hayaishi Memorial Scholarship per studiare all'estero. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione da Takeda Science Foundation (A.S.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule MS-1Collezione di colture di tipo americanoCRL-2279
MEM-alfaThermo Fisher Scientific32571036
TGF-beta2R& D302-B2-002
pozzetti Lab-Tek II Chamber SlideThermo Fisher Scientific154526
Y-27632 Sigma-AldrichY0503
Blocco di unnacalai tesque03953-95
falloidina-tetrametilrodamina B isotiocianatoSigma-AldrichP1951
TOTO-3 ioduroThermo Fisher ScientificT3604
VE caderina anticorpo monoclonale (BV13)Thermo Fisher Scientific14-1441-82
alfa-SMA Anticorpo monoclonale Cy3 (1A4)Sigma-AldrichC6198
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11001
Vetrino coprioggettoThermo Fisher Scientific174934
Soluzione di collageneNitta gelatina Inc.Cellmatrix I-P
Tampone di diluizione del collageneNitta gelatin Inc.Cellmatrix IP,
inibitore del miRNA dell'LNAEXIQON miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Controllo Negativo B e miRNA bersaglio)
miRNA sintetico duplexQiagen miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778030
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027
4

Riferimenti

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  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology

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Segnalazione del TGF Betacellule endoteliali MS 1contrazione del gel di collagenemicroscopia confocaleactina muscolare lisciaespressione della VE caderinamodulazione dei microRNAanalisi dell espressione genicaplasticit fenotipica

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