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Articolo metodologico

Elettrochimico rilevamento di deuterio isotopo effetto cinetico su extracellulare di trasporto dell'elettrone nella Shewanella oneidensis MR-1

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DOI:

10.3791/57584

⸱

16 aprile 2018

 ,  , 
1Department of Applied Chemistry, University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science, National Institute for Materials Science

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo della intero-cellula elettrochimici esperimenti per studiare il contributo del trasporto di protoni per il tasso di trasporto dell'elettrone extracellulare attraverso il membrana esterna citocromi complessi di Shewanella oneidensis MR-1.

Abstract

Diretta rilevazione elettrochimica di c-tipo complessi citocromo incorporati nella membrana esterna batterica (membrana esterna c-tipo complessi citocromo; OM c- Cyts) ha recentemente è emerso come un nuovo metodo analitico della intero-cellula per caratterizzare il trasporto dell'elettrone batterico dalla catena respiratoria all'esterno delle cellule, definito come il trasporto dell'elettrone extracellulare (EET). Mentre la via e la cinetica del flusso dell'elettrone durante la reazione di EET sono stati indagati, un metodo elettrochimico di cellule intere di esaminare l'impatto del trasporto dei cationi associato EET non è ancora stato stabilito. Nello studio presente, un esempio di una tecnica biochimica per esaminare l'effetto di isotopo cinetico di deuterio (KIE) su EET attraverso OM c- Cyts utilizzando un microbo modello, Shewanella oneidensis MR-1, è descritto. KIE sul processo EET può essere ottenuto se la EET attraverso OM c- Cyts agisce come la tappa limitante nella produzione corrente microbica. A tal fine, prima dell'aggiunta di D2O, il supernatante è stato sostituito con fresco che contenevano una quantità sufficiente del donatore dell'elettrone per sostenere il tasso di reazioni metaboliche a Monte e per rimuovere le cellule planctoniche da un'uniforme monostrato biofilm sull'elettrodo di lavoro. Metodi alternativi per confermare il tasso-di limitazione passo nella produzione corrente microbica come EET attraverso OM c- Cyts inoltre sono descritti. La nostra tecnica di analisi elettrochimica della intero-cellula per studiare la cinetica del trasporto di protoni può essere applicato ad altri ceppi microbici elettroattivi.

Introduzione

Tecniche elettrochimiche direttamente caratterizzare una proteina redox in una cellula batterica intatta sono recentemente emersi dalla scoperta del metallo-riducentesi di ceppi microbici, quali S. oneidensis MR-1 o Geobacter sulfurreducens PCA, che hanno complessi di citocromo c-tipo di membrana esterna (OM c-Cyts) esposti al cellulare esterna1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts mediano il trasporto di elettroni dalla catena respiratoria a substrati solidi trova extracellularly. Questo trasporto è indicato come extracellulare trasporto dell'elettrone (EET)1,6 ed è un processo critico per le biotecnologie emergenti, ad esempio celle a combustibile microbico6. Di conseguenza, per comprendere la cinetica EET sottostante e meccanismi e relativo collegamento alla fisiologia microbica, OM c -Cyts sono stati studiati usando della intero-cellula elettrochimica4,7, combinato con la microscopia 8 , 9, spettroscopia10,11e biologia molecolare2,4. Al contrario, metodi per studiare l'impatto EET-collegata del trasporto dei cationi, ad esempio, protoni, sulla cinetica EET in cellule viventi sono stati stabiliti a malapena nonostante trasporto di protoni attraverso le membrane batteriche, avendo un ruolo critico nel segnalazione, omeostasi ed energia produzione12,13,14. Nello studio presente, descriviamo una tecnica per esaminare l'impatto del trasporto protone sulla cinetica EET in S. oneidensis MR-1 cellula usando cellule intere misure elettrochimiche, che richiede l'individuazione del passaggio limitante microbica attuale produzione15.

Un modo diretto per valutare il contributo del trasporto di protoni sulla EET associato è l'effetto isotopico cinetico di deuterio (KIE). Il KIE è osservabile come il cambiamento nella cinetica di trasferimento di elettroni sulla sostituzione di protoni con ioni di deuterio, che rappresenta l'impatto del trasporto di protoni su elettrone trasferimento cinetica16. La teoria di KIE stessa è stata stabilita in bene utilizzando misure elettrochimiche con enzimi purificati17. Tuttavia, poiché la produzione corrente in S. oneidensis MR-1 deriva da multiple, processi diversi e fluttuante18, uno non può identificare semplicemente EET come il processo di limitazione della velocità. Per osservare il KIE il protone processi di trasporto accoppiato con EET, abbiamo bisogno di confermare che l'attuale produzione microbica è limitata dal trasporto di elettroni tramite OM c- Cyts all'elettrodo. Per questo scopo, abbiamo sostituito il supernatante con medium fresco contenente un'alta concentrazione di lattato come un donatore di elettroni ai pH ottimale e le condizioni di temperatura prima misurazione KIE; Questa sostituzione servito due ruoli: (1) ha migliorato il tasso dei processi metabolici a monte rispetto alla EET e (2) le cellule di nuoto nel surnatante rilasciato dal biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 su elettrodo di lavoro (omesso elettrodo di Indio ossido drogato con stagno (ITO)). Il protocollo dettagliato presentato è destinato per mantenere e confermare che il processo EET è il punto tasso-determinazione nuovi praticanti.

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Protocollo

1. formazione di un Biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 su un elettrodo ITO (Figura 1)

Nota: Per evitare la contaminazione del reattore elettrochimico con altri microbi, tutti i media, implementa e componenti del reattore elettrochimico dovrebbero essere sterilizzati in anticipo. Quando usando le cellule di S. oneidensis MR-1 e costruire i reattori elettrochimici, tutte le procedure devono essere effettuate su un banco pulito.

  1. Coltura di cellule di S. oneidensis MR-1
    Nota: Un biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 è stato formato su un ITO elettrodo seguendo le condizioni segnalate precedentemente4.
    1. Per far crescere le cellule di S. oneidensis MR-1, aggiungere una colonia di S. oneidensis MR-1 cresciuta su una piastra di agar composto da Luria-Bertani (LB) (20 g/L) e agar di bacto (15 g/L) in 15 mL di LB medium (20 g/L) a 30 ° C per 24 h in condizioni aerobiche con agitazione a 160 giri/min.
    2. Centrifugare la sospensione cellulare a 6.000 × g per 10 min e risospendere il pellet cellulare risultante in 15 mL di medium definito (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] e 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] acido etansolfonico [HEPES; 7,2 g/L]), supplementato con lattato di 10 mM e 0,5 g/L estratto di lievito come fonte di carbonio e oligoelementi per S. oneidensis MR-1 , rispettivamente.
    3. Coltivare la sospensione cellulare aerobicamente a 30 ° C per 12 ore con agitazione a 160 giri/min e centrifugare nuovamente a 6.000 × g per 10 min. lavare il pellet cellulare risultante due volte con il mezzo di DM mediante centrifugazione per 10 min a 6.000 × g prima l'elettrochimica ulteriormente esperimento.
  2. Costruzione di un reattore elettrochimico di tre elettrodi (Figura 1)
    1. Mettere un substrato di ITO come l'elettrodo di lavoro nella parte inferiore del reattore.
    2. Successivamente, inserire un cilindro di vetro (diametro di 2 cm) e una cover di politetrafluoroetilene (PTFE). Quindi inserire Ag/AgCl (KCl saturata) e un filo di platino nel reattore come gli elettrodi di riferimento e contatore, rispettivamente.
      Nota: Per evitare la fuoriuscita di aria e soluzione, inserire un foglio di gomma butilica tra ogni componente.
    3. Aggiungere 4,0 mL di DM completati con lattato di 10mm ed Estratto di lievito 0,5 g/L nel reattore elettrochimico.
    4. Dopo aver confermato che non ci siano perdite dal reattore elettrochimico, flusso del gas di azoto nel reattore elettrochimico oltre 20 min per mantenere condizioni anaerobiche all'interno del reattore elettrochimico.
      Nota: Per evitare la contaminazione con altri microbi, il gas deve essere filtrato prima che fluisce nel reattore elettrochimico.
    5. Collegare il reattore elettrochimico per un potenziostato e applicare + 0,4 V (contro elettrodo standard a idrogeno, lei) all'elettrodo ITO, mantenendo la temperatura del reattore elettrochimico a 30 ° C, utilizzando un sistema di circolazione dell'acqua esterna.
      Nota: Per evitare l'effetto di un campo elettrico esterno, il reattore elettrochimico deve essere messi in una gabbia di Faraday.
  3. Elettrochimico coltivazione delle cellule di S. oneidensis MR-1 (Figura 1 e Figura 2)
    1. Regolare la densità delle cellule della sospensione ottenuta nel passaggio 1.1 per una densità ottica di 1,43 a 600 nm (OD600) con DM completati da lievito di lattato e 0,5 g/L di 10 mM estrarre.
      Nota: Per ottenere il corretto OD600, applicare la sospensione cellulare OD600 ≤ 0,8 ad uno spettrometro UV-vis prima di regolare il OD600 alla 1.43.
    2. Aggiungere 0,3 mL della sospensione delle cellule nel reattore elettrochimico attraverso la porta di iniezione con una siringa: la OD600 nel reattore cambia a 0.1.
      Nota: L'aggiunta di 0,3 mL di sospensione cellulare con OD600 = 1,43 nel reattore elettrochimico contenente 4,0 mL risultati medi in 4,3 mL della soluzione con un OD600 = 0.1. Quando si utilizzano altri reattori con volumi diversi, il calcolo della densità delle cellule è richiesto.
    3. Continuare l'applicazione potenziale a + 0,4 V (contro lei) all'elettrodo ITO per 25 h.
      Nota: Per la formazione di un biofilm monostrato su un elettrodo ITO, accertarsi che la corrente prodotta esibisce una deviazione inferiore al 50% dalla Figura 2.

2. sostituzione del surnatante con Medium fresco DM con 10 mM di lattato (Figura 3)

  1. Arrestare l'applicazione potenziale e staccare il reattore elettrochimico il potenziostato e il sistema di circolazione dell'acqua.
  2. Sostituzione del surnatante con medium fresco DM con 10 mM di lattato
    1. Flusso del gas di azoto in una bottiglia contenente DM con 10 mM di lattato oltre 20 minuti per rimuovere l'ossigeno dal mezzo.
    2. Rimuovere lentamente tutto il supernatante all'interno del reattore elettrochimico, utilizzando una siringa, sotto che scorre gas azoto (Figura 3a, b).
      Nota: Per evitare di rompere il biofilm sull'elettrodo ITO di gas dell'azoto, il gas dovrebbe scorrere sopra la superficie del liquido.
    3. Aggiungere 4,0 mL di fresco DM contenenti lattato 10 mM utilizzando una siringa (Figura 3C).
      Nota: Per evitare di rompere il biofilm sull'elettrodo ITO, iniettare lentamente il mezzo lungo la parete del reattore elettrochimico. Per mantenere il biofilm bagnato, il mezzo deve essere aggiunto subito dopo la rimozione del surnatante. Iniezione della media fino a 1 min dopo la rimozione del surnatante non influisce la produzione attuale dal biofilm di S. oneidensis MR-1.
    4. Inclinano il reattore elettrochimico per rimuovere tutti del surnatante attaccato al muro del reattore elettrochimico.
    5. Ripetere i passaggi 2.2.2-2.2.4 tre volte in totale.
  3. Interrompere il flusso di gas e collegare il reattore elettrochimico per il potenziostato ancora una volta, l'applicazione + 0,4 V (contro lei) all'elettrodo ITO k. 303

3. aggiunta di acqua di deuterio per misurare il KIE sul processo EET (Figura 4)

  1. Confermare che la produzione attuale da un monostrato di biofilm di S. oneidensis MR-1 è stabile e non aumenta rapidamente. Se la corrente aumenta ripidamente, attendere fino a quando la corrente si stabilizza all'interno di un aumento del 5% su 10 min.
    Nota: La formazione di un biofilm monostrato su un elettrodo ITO senza contaminazione di altri ceppi microbici è stata confermata da sequenze di rDNA e una scansione immagine microscopica dell'elettrone del biofilm su un elettrodo ITO, come riferito precedentemente4. Per la conferma della limitazione tasso dal processo EET, monitorare l'effetto dell'aggiunta di spola elettrone mediatori quali 100 µM antrachinone-1-solfonato (α-AQS). Vedere la sezione di Risultati rappresentante e fare riferimento a15 per ulteriori dettagli.
  2. Aggiungere 40 µ l di anossico 50% (v/v) D2O nel reattore elettrochimico usando una siringa, tale che la concentrazione è 0.5% (v/v) D2O nel reattore.
    Nota: Per evitare danni al biofilm da aggiunta2O D, iniettare la D2O drop-wise.
  3. Attendere che la corrente stabilizzare e successivamente aggiungere la D2O fino a 4,0% (v/v).
    Nota: Per ottenere il valore KIE (il rapporto di produzione corrente in presenza D2O e H2O), verificare l'effetto dello stesso volume di aggiunta di2O H sulla produzione attuale.

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Risultati

Dopo 25 h di potenziale applicazione a + 0,4 V (contro di lei), si formò un biofilm monostrato sull'elettrodo di lavoro di vetro di ITO, che precedentemente è stato confermato da una microscopia elettronica di esame o un microscopio confocale4. Il corso di tempo rappresentativo della produzione corrente dal S. oneidensis MR-1 durante la formazione di un biofilm monostrato è illustrato nella Figura 2. Anche se la corrente varia...

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Discussione

Nostra analisi elettrochimica della intero-cellula ha diversi vantaggi tecnici rispetto con elettrochimica della proteina. Mentre la purificazione della proteina richiede lunghe procedure multifase, il nostro metodo di cellule intere prende un giorno di formazione di biofilm auto-organizzata dopo coltura cellulare. Per ottenere una stabile interazione tra OM c- Cyts e l'elettrodo, abbiamo bisogno solo la sterilizzazione e la pulizia della superficie dell'elettrodo; non richiede modifiche di elettrodo per organiz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione per appositamente ricerca promossa dalla società Giappone per numero di promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant 24000010, 17H 04969 e JP17J02602, il noi Office del Naval Research globali (N62909-17-1-2038). Y.T. è un ricercatore di JSP e supportato da JSP attraverso il programma per scuole laureato leader (MERIT).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cilindro di vetroN/AN/ARealizzato su misura, utilizzato come
coperchio e base in PTFEelettrochimico N/AN/ARealizzato su misura, utilizzato come copertura e fondazione del reattore elettrochimico
Gomma butilicaN/AN/ARealizzato su misura, inserito tra ogni componente del reattore elettrochimico
SeptaGL Science3007-16101Utilizzato come porta di iniezione del reattore elettrochimico
Elettrodo di ossido drogato con stagno di indio (ITO)GEOMATECNo.0001Utilizzato come elettrodo di lavoro, elettrodo saturo 5Ω/sq
Ag/AgCl KClHOKUTO DENKOHX-R5Utilizzato come elettrodo di riferimento, Φ Filo di platino da 0,30 mm
Il Nilaco CooporationPT-351325Utilizzato come controelettrodo
Luria-Bertani (LB) Brodo, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Mezzo per la precoltivazione di S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Antrachinone-1-solfonato (&alfa;-AQS)TCIA1428
Flavina mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Utilizzato per il mezzo definito (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Utilizzato per DM
NH4ClWako011-03015Utilizzato per DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Utilizzato per DM
NaClWako191-01665Utilizzato per DM
2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil] acido etansolfonico (HEPES)DOJINDO346-08235Utilizzato per DM
Soluzione di lattato di sodioWako195-02305
Estratto di lievito BactoBecton, Dichkinson and Company212750
Ossido di deuterio (D, 99,9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditivo per esperimenti sull'effetto isotopico cinetico
IncubatoreTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUtilizzato per agitatore di pre-coltivazione
TAITECNR-3Utilizzato per la pre-coltivazione
Macchina per autoclaveTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Utilizzato per la sterilizzazione del reattore elettrochimico e del fluido
Banco pulitoSANYOMCV-91BNFUtilizzato per prevenire la contaminazione del reattore elettrochimico e del mezzo con altri microbi Separatore
centrifugaEppendorf5430RVelocità di rotazione fino a 6000&volte; g è necessario
Generatore di azoto gassosoPuequ CO. LTD.PNTN-2La bombola di azoto può essere utilizzata anche al posto del generatore di gas
Spettrometro UV-VISSHIMADZUUV-1800Utilizzato per l'ottimizzazione della densità cellulare
PotenziostatoBioLogicVMP3Utilizzato per la formazione di biofilm e gli esperimenti sull'effetto isotopico cinetico
Circolatore d'acqua termicoAS ONETR-1AUtilizzato per il mantenimento della temperatura del reattore elettrochimico
Gabbia di FaradayHOKUTO DENKOHS-201SUtilizzata per esperimenti elettrochimici
del reattore a

Riferimenti

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