Qui presentiamo un protocollo della intero-cellula elettrochimici esperimenti per studiare il contributo del trasporto di protoni per il tasso di trasporto dell'elettrone extracellulare attraverso il membrana esterna citocromi complessi di Shewanella oneidensis MR-1.
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Articolo metodologico
Elettrochimico rilevamento di deuterio isotopo effetto cinetico su extracellulare di trasporto dell'elettrone nella Shewanella oneidensis MR-1
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diretta rilevazione elettrochimica di c-tipo complessi citocromo incorporati nella membrana esterna batterica (membrana esterna c-tipo complessi citocromo; OM c- Cyts) ha recentemente è emerso come un nuovo metodo analitico della intero-cellula per caratterizzare il trasporto dell'elettrone batterico dalla catena respiratoria all'esterno delle cellule, definito come il trasporto dell'elettrone extracellulare (EET). Mentre la via e la cinetica del flusso dell'elettrone durante la reazione di EET sono stati indagati, un metodo elettrochimico di cellule intere di esaminare l'impatto del trasporto dei cationi associato EET non è ancora stato stabilito. Nello studio presente, un esempio di una tecnica biochimica per esaminare l'effetto di isotopo cinetico di deuterio (KIE) su EET attraverso OM c- Cyts utilizzando un microbo modello, Shewanella oneidensis MR-1, è descritto. KIE sul processo EET può essere ottenuto se la EET attraverso OM c- Cyts agisce come la tappa limitante nella produzione corrente microbica. A tal fine, prima dell'aggiunta di D2O, il supernatante è stato sostituito con fresco che contenevano una quantità sufficiente del donatore dell'elettrone per sostenere il tasso di reazioni metaboliche a Monte e per rimuovere le cellule planctoniche da un'uniforme monostrato biofilm sull'elettrodo di lavoro. Metodi alternativi per confermare il tasso-di limitazione passo nella produzione corrente microbica come EET attraverso OM c- Cyts inoltre sono descritti. La nostra tecnica di analisi elettrochimica della intero-cellula per studiare la cinetica del trasporto di protoni può essere applicato ad altri ceppi microbici elettroattivi.
Introduzione
Tecniche elettrochimiche direttamente caratterizzare una proteina redox in una cellula batterica intatta sono recentemente emersi dalla scoperta del metallo-riducentesi di ceppi microbici, quali S. oneidensis MR-1 o Geobacter sulfurreducens PCA, che hanno complessi di citocromo c-tipo di membrana esterna (OM c-Cyts) esposti al cellulare esterna1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts mediano il trasporto di elettroni dalla catena respiratoria a substrati solidi trova extracellularly. Questo trasp....
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Protocollo
1. formazione di un Biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 su un elettrodo ITO (Figura 1)
Nota: Per evitare la contaminazione del reattore elettrochimico con altri microbi, tutti i media, implementa e componenti del reattore elettrochimico dovrebbero essere sterilizzati in anticipo. Quando usando le cellule di S. oneidensis MR-1 e costruire i reattori elettrochimici, tutte le procedure devono essere effettuate su un banco pulito.
- Coltura di cellule di S. oneidensis MR-1
Nota: Un biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 è stato formato su un ITO elettrodo seguen....
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Risultati
Dopo 25 h di potenziale applicazione a + 0,4 V (contro di lei), si formò un biofilm monostrato sull'elettrodo di lavoro di vetro di ITO, che precedentemente è stato confermato da una microscopia elettronica di esame o un microscopio confocale4. Il corso di tempo rappresentativo della produzione corrente dal S. oneidensis MR-1 durante la formazione di un biofilm monostrato è illustrato nella Figura 2. Anche se la corrente varia.......
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Discussione
Nostra analisi elettrochimica della intero-cellula ha diversi vantaggi tecnici rispetto con elettrochimica della proteina. Mentre la purificazione della proteina richiede lunghe procedure multifase, il nostro metodo di cellule intere prende un giorno di formazione di biofilm auto-organizzata dopo coltura cellulare. Per ottenere una stabile interazione tra OM c- Cyts e l'elettrodo, abbiamo bisogno solo la sterilizzazione e la pulizia della superficie dell'elettrodo; non richiede modifiche di elettrodo per organiz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione per appositamente ricerca promossa dalla società Giappone per numero di promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant 24000010, 17H 04969 e JP17J02602, il noi Office del Naval Research globali (N62909-17-1-2038). Y.T. è un ricercatore di JSP e supportato da JSP attraverso il programma per scuole laureato leader (MERIT).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cilindro di vetro | N/A | N/A | Realizzato su misura, utilizzato come |
| coperchio e base in PTFE | elettrochimico N/A | N/A | Realizzato su misura, utilizzato come copertura e fondazione del reattore elettrochimico |
| Gomma butilica | N/A | N/A | Realizzato su misura, inserito tra ogni componente del reattore elettrochimico |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Utilizzato come porta di iniezione del reattore elettrochimico |
| Elettrodo di ossido drogato con stagno di indio (ITO) | GEOMATEC | No.0001 | Utilizzato come elettrodo di lavoro, elettrodo saturo 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Utilizzato come elettrodo di riferimento, Φ Filo di platino da 0,30 mm |
| Il Nilaco Cooporation | PT-351325 | Utilizzato come controelettrodo | |
| Luria-Bertani (LB) Brodo, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Mezzo per la precoltivazione di S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Antrachinone-1-solfonato (&alfa;-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavina mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Utilizzato per il mezzo definito (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Utilizzato per DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Utilizzato per DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Utilizzato per DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Utilizzato per DM |
| 2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil] acido etansolfonico (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Utilizzato per DM |
| Soluzione di lattato di sodio | Wako | 195-02305 | |
| Estratto di lievito Bacto | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Ossido di deuterio (D, 99,9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additivo per esperimenti sull'effetto isotopico cinetico |
| Incubatore | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Utilizzato per agitatore di pre-coltivazione |
| TAITEC | NR-3 | Utilizzato per la pre-coltivazione | |
| Macchina per autoclave | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Utilizzato per la sterilizzazione del reattore elettrochimico e del fluido |
| Banco pulito | SANYO | MCV-91BNF | Utilizzato per prevenire la contaminazione del reattore elettrochimico e del mezzo con altri microbi Separatore |
| centrifuga | Eppendorf | 5430R | Velocità di rotazione fino a 6000&volte; g è necessario |
| Generatore di azoto gassoso | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | La bombola di azoto può essere utilizzata anche al posto del generatore di gas |
| Spettrometro UV-VIS | SHIMADZU | UV-1800 | Utilizzato per l'ottimizzazione della densità cellulare |
| Potenziostato | BioLogic | VMP3 | Utilizzato per la formazione di biofilm e gli esperimenti sull'effetto isotopico cinetico |
| Circolatore d'acqua termico | AS ONE | TR-1A | Utilizzato per il mantenimento della temperatura del reattore elettrochimico |
| Gabbia di Faraday | HOKUTO DENKO | HS-201S | Utilizzata per esperimenti elettrochimici |
Riferimenti
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al.
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Ristampe e permessi
