Qui, presentiamo un protocollo per produrre un bispecifico GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Purificata GPC3-S-Fab ha potente citotossicità contro le cellule di cancro del fegato positivo GPC3.
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Articolo metodologico
Un targeting GPC3 bispecifico, GPC3-S-Fab, con potente citotossicità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive la costruzione e gli studi funzionali di un bispecifico (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs in grado di riconoscere due epitopi diversi attraverso le due armi diverse. bsAbs sono stati attivamente studiati per la loro capacità di reclutare direttamente le cellule immunitarie per uccidere le cellule del tumore. Attualmente, la maggior parte dei bsAbs è prodotte in forma di proteine ricombinanti, come Fc-contenenti bsAbs o come più piccolo bsAb derivati senza regione Fc. In questo studio, è stato progettato GPC3-S-Fab, un anticorpo frammento (Fab) base bispecifico, collegando il Fab dell'anticorpo anti-GPC3 GC33 con un anticorpo anti-CD16 di singolo dominio. Il GPC3-S-Fab può essere espressa in Escherichia coli e purificato da due cromatografie di affinità. Purificata GPC3-S-Fab in particolare può associare a e uccidere le cellule di cancro del fegato positivo GPC3 reclutando cellule natural killer, suggerendo una potenziale applicazione di GPC3-S-Fab nella terapia del cancro del fegato.
Introduzione
Gli anticorpi monoclonali sono ora ampiamente utilizzati per cancro trattamento1. Grazie alla flessibilità degli anticorpi, vari formati basati su anticorpi sono stati esplorati attivamente. Rispetto agli anticorpi monoclonali, bsAbs hanno due moduli di associazione differenti dell'antigene, consentendo loro di riconoscere due bersagli contemporaneamente e in modo efficiente innescano il reclutamento di cellule immunitarie effettrici per colpire e uccidere le cellule di tumore2.
Formati attuali bsAb ricombinante possono essere generalmente assegnati a due classi: Fc-contenente bsAbs e bsAbs se....
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Protocollo
Tutte le procedure, compresa la raccolta di sangue umano sono state approvate dal comitato etico di Sun Yat-Sen University.
1. strategia di progettazione GPC3-S-Fab
- Progettare GPC3-S-Fab collegando un Fab di anti-GPC3 (umanizzato GC3313) con un anti-CD16 VHH14 (Figura 1).
- Sintetizzare e clonare il VH-CH1-CD16-VHH e VL-CL nei vettori pET26b e pET21a come precedentemente segnalati12.
2. trasformazione e cultura
- Aggiungere 100 ng di pET26b contenenti VH-CH1-CD16 (
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Risultati
Purificazione di GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab è stato purificato da e. coli mediante una purificazione di affinità in due fasi, prima con Ni-NTA-agarosio, seguita da purificazione di affinità di IgG-CH1. Dopo la purificazione di affinità in due fasi, GPC3-S-Fab è stato purificato per omogeneità con le due catene vicino a 1:1 (Figura 2A). La presenza di polipeptidi sia VHH VH-CH1-C.......
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Discussione
In questo studio, presentiamo una strategia per costruire un nuovo formato di bsAbs, GPC3-S-Fab, che possono reclutare cellule NK mirare alle cellule del tumore positivo GPC3. La S-Fab è basato sul Fab naturale formato con l'aggiunta di un anti-CD16 VHH11,12. Confrontato con la regione di Fc contenente bsAbs, GPC3-S-Fab possono essere prodotte facilmente nel Periplasma dei batteri su larga scala.
Utilizzando la strategia di espressione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal R & D piano della provincia di Guangdong (Cina) (2016A050503028).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Incubatore a scuotimento | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Incubatore a tregua | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuga | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuga | Coltro Beckman | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuga | eppendorf | 5810R | |
| Spettrofotometro a raggi ultravioletti | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Apparecchio analitico per elettroforesi su gel di poliacrilammide | Mini-PROTEAN® Apparato Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot | Criterion | Bio-rad | |
| Sistema di imaging | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Cromatogramma liquido a proteine veloci | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF colonna | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Citometro a flusso | Coltro | BeckmanFC500 | |
| Centrifuga | eppendorf | 5702R | |
| Envision lettore di piastre | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-umano(H& L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anticorpo anti-topo IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 resina di affinità | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Kit di arricchimento cellulare NK | Stemcell | 19055 | |
| Magnete | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Tripsina | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122 | Coltura cellulare |
| Marcatore standard | Sigma Aldrich | MWGF200 | Filtrazione su gel |
| Isopropil-b-D-tio-galattopiranoside (IPTG) | Prodotti chimici VWR | VWRC0487-100G | |
| Tubi per dialisi | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillina | VWR | VWRC0339-100G | |
| Triptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Estratto di lievito | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| glicina | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Fosfato di potassio, monobasico anidro (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Fosfato di sodio, bibasico, anidro (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoetanolo | VWR | 60-24-2 | |
| Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lisozima | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Blu brillante R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Blu di bromofenolo | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glicerolo | Sigma Aldrich | V900122 | |
| piatto di plastica da 100 mm x 20 mm | Fiaschetta Corning | 430167 | |
| 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| cluster di coltura cellulare a 96 pozzetti | Corning | 3599 | |
| Saccarosio | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze | SCSP-528 | |
| HepG2 | la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze | TCHu 72 | |
| Huh7 | la collezione di cultura del tipo dell'Accademia cinese delle scienze | TCHu182 | |
| Hep3B | la collezione Type Culture dell'Accademia cinese delle scienze | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Riferimenti
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....
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Ristampe e permessi
