Articolo metodologico

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

DOI:

10.3791/57615

⸱

15 luglio 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contaminazione durante il sequenziamento genomico di organismi microscopici rimane un grande problema. Qui, vi mostriamo un metodo per sequenziare il genoma di un Tardigrada da un singolo esemplare con appena 50 pg di DNA genomic senza amplificazione intero genoma per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.

Abstract

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I tardigradi sono animali microscopici che entri in uno stato di ametabola anhydrobiosis chiamato fronte di essiccazione e può tornare al loro stato originale quando l'acqua è fornita. Il sequenziamento genomico di microscopici animali come i tardigradi rischi la contaminazione batterica che a volte porta a interpretazioni errate, ad esempio, per quanto riguarda il limite di trasferimento genico orizzontale in questi animali. Qui, forniamo un metodo di input ultrabasso per sequenziare il genoma di Tardigrada, Hypsibius dujardini, da un singolo esemplare. Impiegando rigorosa esclusione di lavaggio e contaminante insieme ad un'efficiente estrazione del 50 ~ 200 pg DNA genomico da un singolo individuo, abbiamo costruito una biblioteca sequenziata con uno strumento di sequenziamento del DNA. Queste librerie sono state altamente riproducibile e imparziale, e un'analisi informatica della sequenza si legge con altri genomi di H. dujardini ha mostrato una quantità minima di contaminazione. Questo metodo può essere applicato per i tardigradi saggiati che potrebbero non essere sequenziati utilizzando metodi precedenti.

Introduzione

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I tardigradi sono animali microscopici che possono entrare in uno stato di ametabola chiamato anhydrobiosis quando essiccazione di fronte. Recuperano dall'assorbimento di acqua1,2. Nello stato ametabola, i tardigradi sono in grado di tollerare i vari ambienti estremi, quali temperature estreme pressioni e3 4,5, un alto dosaggio di luce ultravioletta6, raggi x e raggi gamma 7 , 8e9di spazio cosmico. Dati genomici sono un fondamento indispensabile per lo studio dei meccanismi molecolari della anhydrobiosis.

Precedenti tentativi di sequenziare il genoma di tardigradi hanno mostrato segni di contaminazione batterica10,11,12,13,14. Sequenziamento genomico da tali piccoli organismi richiede un gran numero di animali ed è soggetto a contaminazione batterica; di conseguenza, abbiamo precedentemente stabilito un protocollo di sequenziamento utilizzando un metodo di input ultrabasso a partire da un singolo esemplare di Tardigrada, per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni15. Utilizzando questi dati, abbiamo condotto ulteriormente una nuova sequenza di alta qualità e riassemblaggio del genoma di H. dujardini16,17. Qui descriviamo in dettaglio questo metodo di sequenziamento genomico da un singolo individuo tardigrade (nella figura 1). La convalida di questo metodo di sequenziamento è oltre il focus di questo lavoro e già è stata accuratamente esaminata nella nostra precedente relazione16.

Questo metodo è composto di due parti: l'isolamento di un singolo Tardigrada con il più basso possibile di contaminazione, l'estrazione di alta qualità dei livelli di pittogramma del DNA. Il Tardigrada è affamato e sciacquare accuratamente con acqua, così come gli antibiotici e osservato sotto un microscopio con ingrandimento X 500 per garantire la rimozione di qualsiasi contaminazione batterica. Misurazioni e stime precedenti indicano che un singolo individuo di Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16, che viene estratta per cracking l'esoscheletro di chitina dai cicli di gelo-disgelo o di omogeneizzazione manuale. Il DNA di genomic è presentato alla costruzione della libreria e sequenziato su uno strumento di sequenziamento del DNA. Un'analisi informatica ulteriori Mostra sequenziamento di alta qualità, così come i bassi livelli di contaminazione rispetto ai precedenti progetti di sequenziamento tardigrade.

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Protocollo

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1. preparazione

  1. Preparare il gel di agarosio al 2% utilizzando acqua distillata (DW) come il solvente contenuto in una piastra di coltura plastica 90 mm e 10 mL di una cocktail con DW penicillina/streptomicina 1%. Il gel può essere conservato per 2-3 settimane in un incubatore a 18 ° C.
    Nota: Evitare qualsiasi deposito del gel sotto i 10 ° C, per la bassa temperatura si ridurrà il gel di agarosio, risultante in un minuscolo gap tra il gel e la parete del piatto di cultura in cui i tardigradi possono essere intrappolati.

2. campione preparazione ed esclusione delle sostanze contaminanti

  1. Raccogliere un singolo Tardigrada, posizionarlo sulla piastra agar preparata e lavarlo 2x - 3x con DW per rimuovere eventuali particelle rimanenti.
  2. Incubare il Tardigrada a 18-22 ° C per 24 h per rimuovere qualsiasi cibo in eccesso dagli intestini.
  3. Posizionare il Tardigrada affamato in antibiotici penicillina/streptomicina per 2-6 h rimuovere qualsiasi contaminazione batterica e mettere l'animale decontaminato in un bicchiere pulito diapositiva utilizzando una pipetta P10.
  4. Osservare il Tardigrada sotto un microscopio a 500 ingrandimenti e confermare che non esistono nessun batteri rimanente.
    Nota: L'alto ingrandimento con un microscopio stereoscopico è ottima, ma un microscopio ottico può essere utilizzato in alternativa senza applicare un vetrino coprioggetti.
  5. Raccogliere l'individuo utilizzando una pipetta P10 con un massimo di 5 µ l di liquido, metterlo in una provetta di reazione a catena (PCR) di basso-associazione della polimerasi e rimuovere come liquido molto in eccesso possibile.
    Nota: Le microprovette, provette per PCR e puntali per pipette dovrebbero tutti essere obbligatoria bassa per minimizzare la perdita di DNA.
    Nota: Condurre un'omogeneizzazione più presto, per la rapida essiccazione o morte dell'animale in modo significativo possa danneggiare il DNA genomico.

3. omogeneizzazione ed estrazione del DNA

  1. Omogeneizzare l'animale per ottenere il suo DNA genomico (gDNA) con uno dei seguenti metodi.
    Nota: È fondamentale usare il kit specificato mostrato in Tabella materiali nelle seguenti operazioni di estrazione del DNA, per altri kit (colonna e perlina basata) non sono efficaci a questo ingresso estremamente basso. Il buffer di lisi genomico è stato fornito con 0,5% beta-mercaptoetanolo prima dell'uso.
    1. Omogeneizzare l'animale con cicli di gelo e disgelo18.
      1. Subito dopo passo 2.5, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi nella provetta di PCR contenente il Tardigrada.
      2. Collocare la provetta PCR in azoto liquido per 10 minuti e, per 10 min, spostarlo in un blocco di calore riscaldato a 37 ° C. Ripetere questo passaggio x 2.
        Nota: Questo passaggio può essere ripetuto quando l'omogeneizzazione non è sufficiente o può essere eseguita dopo la pigiatura manuale.
    2. Manualmente e schiacciare l'animale.
      1. Subito dopo passo 2.5, sotto un microscopio stereoscopico, schiacciare l'individuo con la punta di P10 della pipetta premendo l'animale contro la parete del tubo PCR e immediatamente aggiungere 100 µ l di tampone di lisi.
        Nota: È fondamentale osservare questa procedura sotto un microscopio stereoscopico, perchè il Tardigrada può facilmente scivolare via e frantumazione inefficiente si tradurrà in un errore per estrarre gDNA. Assicurarsi che la cuticola tardigrade è rotta in modo che il buffer di lisi possa infiltrare l'organismo.
  2. Incubare la provetta per 30 min a temperatura ambiente per lisi si verifichi.
    Nota: Un minimo di 30 minuti è necessario per un efficiente Lisi, ma l'incubazione può essere più lunga.
  3. Trasferire il volume completo (100 µ l) della miscela Lisi ad una pulito 1,5 mL basso-associazione microprovetta.
  4. Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi per il tubo PCR di basso-associazione che è stato utilizzato per l'omogeneizzazione e ora è vuoto e dopo la miscela di pipettaggio, trasferirlo nella microprovetta basso-associazione 1,5 mL utilizzato al punto 3.3. Ripetere questo passaggio x 2.
  5. Come descritto al punto 3.4, aggiungere 300 µ l di tampone di lisi per la provetta PCR bassa-associazione e, dopo il pipettaggio, spostare la miscela nella microprovetta 1,5 mL basso-associazione. I conetti di basso-associazione di 1,5 mL dovrebbero contenere 600 µ l della miscela dopo questo passaggio.
    Nota: Questi passaggi sono per minimizzare la perdita di gDNA vincolato alla parete del tubo PCR, il campione di lavaggio più volte.
  6. Aggiungere il totale di 600 µ l di miscela di Lisi a colonna spin inserito in un tubo di raccolta e centrifugare esso a 10.000 x g per 1 min.
  7. Applicare nuovamente il flusso attraverso la colonna ed e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
    Nota: Questo passaggio è fondamentale per garantire che la maggior parte del gDNA è associato alla colonna.
  8. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin e centrifugare a 10.000 x g per 1 min. trasferimento della colonna di spin ad una microprovetta 1,5 mL pulito.
  9. Applicare 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, alla colonna di spin, attendere 5 min a temperatura ambiente e centrifugare esso a 10.000 x g per 1 min.
    Nota: Il tampone di eluizione non deve contenere EDTA, perché interferisce con gli enzimi di preparazione di biblioteca.
  10. Applicare nuovamente il flusso attraverso la colonna di spin e dopo 5 min di incubazione a temperatura ambiente, e centrifugare per 1 min a 10.000 x g.
    Nota: Questo passaggio è fondamentale per garantire la massima eluizione di gDNA associato alla colonna.

4. sequenza di costruzione biblioteca

  1. Frammentazione del DNA
    1. Trasferire 15 µ l di eluente il gDNA una microprovetta 15-µ l per frammentazione del DNA e centrifugare la provetta per 1 min utilizzando una microcentrifuga da tavolo.
      Nota: Nella microprovetta specificata mostrata in Tabella materiali è ottima per un basso input. La frammentazione con basso volume sonicazione è fondamentale, e questo non può essere sostituito con frammentazione enzimatica a causa della bassissima concentrazione di DNA.
    2. Frammentare il gDNA a 550 bp.
      Nota: Le impostazioni di bp 550 abbiamo usato sono come segue: potenza incidente picco = 30 W, fattore di utilizzo = 20%, cicli al burst = 50, tempo di trattamento = 23 s.
    3. Dopo un'approfondita di pipettaggio, trasferire 10 µ l di miscela di DNA frammentata in una provetta PCR di pulito basso-associazione.
      Nota: L'esperimento può essere fermato qui. Conservare il DNA a 4 ° C o -20 ° C.
  2. Sequenza di costruzione di libreria
    Nota: È assolutamente fondamentale per utilizzare il kit specificato nella Tabella materiali nelle procedure seguenti, a causa della quantità bassa di ingresso del DNA.
    1. Aggiungere 2 µ l di tampone di preparazione del modello e 1 µ l di enzima di preparazione del modello e mescolare accuratamente con una pipetta.
    2. Eseguire la reazione di preparazione del modello in un termociclatore con le seguenti condizioni: 22 ° C per 25 min, 55 ° C per 20 min, presa a 4 ° C e un coperchio riscaldato a 101-105 ° C. Una volta completata la reazione, procedere al passaggio successivo.
    3. Aggiungere 1 µ l di buffer sintesi libreria e 1 µ l di enzima di sintesi la libreria per il prodotto di reazione di preparazione di modello e incubare la miscela a 22 ° C per 40 min (con una tenuta di 4 ° C). Una volta completata la reazione, procedere al passaggio successivo.
    4. Aggiungere 30 µ l di mix master biblioteca amplificazione (25 µ l di tampone di amplificazione la biblioteca, 1 µ l di enzima amplificazione libreria e 4 µ l di acqua priva di nucleasi) e 5 µ l di reagente di indicizzazione.
    5. Mescolare il tutto accuratamente con una pipetta e centrifugare la miscela con una centrifuga da tavolo.
    6. Eseguire una PCR con le condizioni presentate nella tabella 1.
TemperaturaTempoCicli
72 ˚ c3 minuti
85 ˚ c2 minuti
98 ° C2 minuti
98 ° C20 secondi4 cicli
67 ˚ c20 secondi
72 ˚ c40 secondi
98 ° C20 secondi16 cicli
72 ˚ c50 secondi
4 ˚ cTenere premuto

Tabella 1: Condizioni di PCR.

  1. Purificazione dei prodotti di PCR
    Nota: Questo passaggio può essere sostituito con altri metodi di purificazione. Se viene utilizzato un metodo alternativo, assicuratevi di controllare per la purezza di DNA risultante utilizzando uno spettrofotometro. Rapporti di assorbanza 260/280 e 260/230 devono essere entrambi sopra 1.8.
    1. Aggiungere 50 µ l di biglie magnetiche, dispensare la soluzione 10 x e centrifugare con una microcentrifuga da tavolo.
    2. Incubare la soluzione per 2 min a temperatura ambiente.
    3. Incubare su un supporto magnetico per 5 minuti o fino a quando la soluzione diventa completamente cancellare e rimuovere il surnatante.
    4. Aggiungere 200 µ l di etanolo di 80% preparati al momento nella provetta PCR di basso-associazione su un supporto magnetico, attendere per 30 s e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio x 2. Non disturbare le perline.
    5. Brevemente, centrifugare la provetta PCR bassa-associazione con una centrifuga da tavolo e rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso sul supporto magnetico. Asciugare le perline, ma evitare di seccare.
    6. Risospendere le perline con 15 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, accuratamente Pipettare la soluzione in modo che i branelli magnetici sono distribuiti in modo omogeneo, incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e dopo una breve centrifugazione, incubare su un supporto magnetico per 2 min fino a quando la soluzione è limpida.
      Nota: Il tampone di eluizione non deve contenere EDTA, perché interferisce con la chimica di sequenziamento.
    7. Trasferire il surnatante, senza disturbare il pellet, ad un nuovo tubo PCR di basso-associazione.
      Nota: L'esperimento può essere fermato qui. Conservare il DNA a 4 ° C o a-20 ° C per lo stoccaggio di lunga data.

5. qualità di controllo, la quantificazione e la sequenza del DNA

Nota: Un controllo di qualità non viene eseguito prima che questo passo a causa della bassa quantità di DNA.

  1. Convalida della distribuzione di dimensione di biblioteca del DNA
    Nota: Altri sistemi di elettroforesi ad alta sensibilità con una segnalazione digitale di distribuzione delle dimensioni possono essere utilizzati.
    1. Restituire il reagente tampone di elettroforesi e gel cartuccia (25-1.000 bp nella gamma) a temperatura ambiente.
    2. Aggiungere 3 µ l di reagente tampone di elettroforesi con 1 µ l della libreria di sequenziamento e mescolare accuratamente per 1 min con un vortice e li Centrifugare brevemente con una centrifuga da tavolo.
    3. Condurre l'elettroforesi e convalidare la distribuzione di dimensione di biblioteca con il software associato. Il picco di frammento principale dovrebbe essere largamente vanno da circa 300 a 1.000 bp.
  2. Quantificazione del DNA
    Nota: Altri metodi basati sulla fluorescenza o PCR quantitativa può anche essere utilizzato, ma spettrofotometria dovrebbe essere evitato, in quanto non è sufficientemente accurata per quantificare le librerie di sequenziamento.
    1. Aggiungere 796 µ l di soluzione tampone e 4 µ l di reagente fluorescente e mescolare accuratamente. Erogare 190 µ l di soluzione di lavoro di due provette e 197 µ l in una provetta di analisi.
    2. Aggiungere 10 µ l di standard con concentrazioni note di DNA a ciascuna provetta di analisi contenente 190 µ l di soluzione di lavoro e 3 µ l della biblioteca preparata nella provetta di analisi contenente 197 µ l di soluzione di lavoro.
    3. Vortex le provette brevemente e centrifugare li su una centrifuga da tavolo. Quantificare il DNA utilizza un fluorometro con impostazioni 3-µ l.
  3. Sequenza di DNA biblioteca
    Nota: La piattaforma di sequenziamento deve essere compatibile con il kit di costruzione libreria specificata.
    1. Preparare la libreria di sequenziamento basata sul protocollo del produttore.
    2. Impostare la cella di cassette e flusso di reagente nello strumento sequenziamento e immettere la sequenza di esecuzione informazioni seguendo il protocollo del produttore.
    3. Eseguire il sequenziamento.
      Nota: Abbiamo condotto due esecuzioni di sequenziamento: un esempio di esecuzione, come pure quattro campioni multiplexati in una corsa.

6. analisi computazionale

  1. Chiamata di base e, se necessario, demultiplex le letture.
  2. Convalidare la qualità dei dati di sequenza con FastQC19.
    Nota: Per una convalida più approfondita dei dati ottenuti, Vedi il nostro precedente rapporto16.

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Risultati

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Esclusione delle sostanze contaminanti:

Questo protocollo prevede un lavaggio accurato del Tardigrada e una sterilizzazione con antibiotici cura per minimizzare la contaminazione. Implica anche un processo di verifica visivo per assicurare la completezza di questi processi. Un'immagine del microscopio fatta durante la convalida (punto 2.4 del protocollo) è illustrata nella Figura 2....

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Discussione

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Contaminazione batterica rappresenta una minaccia per il sequenziamento genomico di organismi microscopici. Mentre gli studi precedenti sul sequenziamento del genoma tardigrade hanno filtrato contaminazione utilizzando metodi informatica vasto12,20, abbiamo sequenziato il genoma da un singolo individuo per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni. Poiché un singolo Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16 ed è racchius...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii per il loro supporto tecnico nel sequenziamento genomico. Quest'opera è stata sostenuta di sovvenzione per la società del Giappone per la promozione della scienza (JSPS) Research Fellow, sovvenzione dai KAKENHI per giovani scienziati (No.22681029) e KAKENHI sovvenzione per la ricerca scientifica (B), no. 17 H 03620 da JSP, da un Sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base da The Sumitomo Foundation (No.140340) e in parte da fondi di ricerca dal governo della Prefettura di Yamagata e città di Tsuruoka, Giappone. Chlorella vulgaris utilizzata per alimentare i tardigradi è stato fornito per gentile concessione di clorella Industry Co. Ltd.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio SZ61OLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
Penicillina Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 SistemaKeyence
0,2mL Tubo con rivestimento in siliconeBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Kit MicroprepZYMO ResearchD3021L'uso di questo kit è assolutamente fondamentale; vedere il passaggio 3.1
Microprovetta da 1,5 mLgreiner bio-one616-201Vedere 4.1.1
Microcentrifuga refrigerata ad alta velocitàTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
Kit ThruPLEX DNA-SeqRubicon Genomics CAT. NO. R400406L'uso di questo kit è assolutamente fondamentale; vedere il passaggio 4.2
TermociclatoreBioer TechnologyTC-96GHbC
Reagente AMPure XPBECKMAN COULTER Life ScienceA63881
EtanoloWako054-027335
EB tamponeQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 ReagentiAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Tampone/ReagenteThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrifugeRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 ciclo v3Illumina Inc.MS-102-3003
Sequenziatore MiSeqIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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