Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e accampamento dinamica utilizzando un'installazione di Langendorff ex vivo .
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Articolo metodologico
Impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di Langendorff Ex Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sin dalla sua invenzione nel tardo 19° secolo, il sistema di perfusione Langendorff ex vivo cuore continua ad essere uno strumento rilevante per lo studio di un ampio spettro di parametri fisiologici, biochimici, morfologici e farmacologici in cuore centrale denervato. Qui, descriviamo una configurazione per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e le dinamiche dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP). Il sistema nervoso autonomo intracardiaco è modulato da dissezione meccanica di grasso atriale pastiglie-in cui gangli murini si trovano principalmente — o dall'utilizzo degli interventi farmacologici globali, nonché mirati. Un catetere elettrofisiologici di octapolar è stato introdotto in atrio destro e ventricolo destro, e dell'epicardio-disposto multi-elettrodo matrici (MEA) per la mappatura ad alta risoluzione vengono utilizzate per determinare aritmogenesi ed elettrofisiologia cardiaca. Trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) imaging viene eseguito per il monitoraggio in tempo reale dei livelli di cAMP in diverse regioni cardiache. Neuromorphology è studiato per mezzo di anticorpo-basato colorazione dei cuori interi usando marcatori neuronali per guidare l'identificazione e la modulazione degli obiettivi specifici del sistema nervoso autonomo intracardiaco negli studi eseguiti. L'impostazione di Langendorff ex vivo permette per un elevato numero di esperimenti riproducibili in breve tempo. Tuttavia, la natura in parte aperta del setup (ad es., durante le misurazioni MEA) rende difficile il controllo costante della temperatura e deve essere mantenuto al minimo. Questo metodo descritto rende possibile analizzare e modulano il sistema nervoso autonomo intracardiaco nei cuori decentralizzati.
Introduzione
Il sistema di perfusione Langendorff ex vivo cuore continua ad essere uno strumento rilevante per l'esecuzione di un ampio spettro di fisiologici, biochimici, morfologici e studi farmacologici in centrale denervato cuori1,2 ,3,4,5 sin dalla sua invenzione nel tardo 19th secolo6. Ad oggi, questo sistema è ancora ampiamente usato per vari argomenti (ad es., ischemia riperfusione) o per lo studio cardiaco farmacologico effetti7,....
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dalle autorità locali, di stato di Amburgo, la cura degli animali Università di Amburgo e comitati di uso.
1. preparazione dell'apparato di Langendorff
Nota: Viene utilizzato un sistema di perfusione di Langendorff commercialmente disponibile.
- Preparare una soluzione modificata di Krebs-Henseleit (119 mM di cloruro di sodio, 25mm di bicarbonato di sodio, 4,6 mM di cloruro di potassio, 1,2 millimetri di fosfato di potassio monobasico, 1,1 mM di solfato di magnesio, 2,5 mM di cloruro di calcio, 8,3 di glucosio e 2 mM di sodio piruvato). A....
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Risultati
La figura 1 Mostra un'immagine dell'installazione Langendorff comprese 2 matrici multi-elettrodo (MEA). Prima dell'esperimento, il catetere intracardiaco è posizionato vicino la cannula per facilitare una rapida e facile inserimento nel ventricolo di destra atrio/destra e garantire un breve periodo di tempo fino a quando l'equilibrazione può iniziare. La parte inferiore della camera può essere intensificata (vedere le frecce nella Figura .......
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Discussione
In questo manoscritto, sistema di perfusione la Langendorff ben noto ex vivo cuore è presentato come uno strumento per studiare l'impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi utilizzando mapping diverso e tecniche di stimolazione inclusi gli approcci endocardial e dell'epicardio.
Parecchie parti del protocollo sono cruciali per l'installazione. In primo luogo, è importante utilizzare una tecnica di preparazione in cui i cuscinetti adiposi atriali rimango.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Hartwig Wieboldt per la sua ottima assistenza tecnica e l'UKE microscopia Imaging Facility (Umif) della University Medical Center Hamburg-Eppendorf per fornire supporto e microscopi. Questa ricerca è stata finanziata bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. e di DZHK (centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) [FKZ 81Z4710141].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S3014 | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Idrogenocarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | 401676 | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P5405 | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich | P5655 | Krebs-Henleit modificato soluzione |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | M1880 | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma-Aldrich | C7902 | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G5767 | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Piruvato di sodio bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Krebs-Henleit modificato soluzione |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germania | Soluzione Krebs-Henleit | |
| Filtro sterile steritop-GP 0,22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Soluzione di Krebs-Henleit modificata |
| Atropina solfato | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulazione |
| Cloruro di esametonio | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulazione |
| Base senza nicotina 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulazione |
| Soluzione di formalina tamponata neutra 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Colorazione a montaggio intero |
| Tris(idrossimetil)amminometano | Sigma-Aldrich | 252859 | Colorazione a montaggio intero |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 34860 | Colorazione a montatura intera |
| Soluzione di perossido di idrogeno al 30% (p/p) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germania | H1009 | Colorazione a montatura intera |
| Dimetil solfossido | Merck, KGA, Darmstadt, Germania | D8418 | Colorazione a montatura intera |
| Compresse saline tamponate con fosfato | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Colorazione a montatura intera |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Colorazione a montatura intera |
| Albumina frazione bovina V | Biomol, Amburgo, Germania | 11924.03 | Colorazione a montatura intera |
| Pollo anti neurofilamento | EMD Millipore | AB5539 | Colorazione a montatura intera |
| Coniglio anti tirosina idrossilasi | EMD Millipore | AB152 | Colorazione a montatura intera |
| Capra anti colina acetiltransferasi | EMD Millipore | AP144P | Colorazione a montatura intera |
| Asino e alfa coniglio IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Colorazione a montatura intera |
| Asino e alfa; capra IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Colorazione a montatura intera |
| Asino e pollo IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germania | AP194SA6 | intera colorazione per montatura |
| Asino e alfa coniugati con biotina igG | R& D Systems | AP182B | Colorazione a montatura intera |
| IgG d'asino e capra coniugati con biotina | D Systems | AP192P | Colorazione a montaggio intero Biotina |
| coniugata capra e pollo igY | R& D Systems | BAD010 | Colorazione a montaggio intero |
| Mezzo di montaggio Vectashield | Laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunoistochimica |
| Kit Vectastain ABC | Laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunoistochimica |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, Regno Unito | ab103723 | Colorazione a montaggio intero |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germania | HS2002 | Immunoistochimica |
| BisBenzimide H33342 tricloridrato (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunoistochimica |
| Vectashield HardSet terreno di montaggio | Laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunoistochimica |
| Sistema di perfusione | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germania | 73-4343 | Apparecchio Langendorff |
| Sistema di acquisizione dati e software corrispondente per catetere e parametri fisiologici | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nuova Zelanda | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff |
| setup Catetere ottagopolare | CIB' ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | personalizzata | Langendorff |
| generatore di stimolo | STG4002, sistemi multicanale, Reutlingen, Germania | STG4002-160µ A | Configurazione della stimolazione |
| Software di stimolazione | Sistemi multicanale, Reutlingen, Germania | MC_Stimulus II | Configurazione della stimolazione |
| Sistema di acquisizione dati e software corrispondente per elettrogrammi epicardici | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germania | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-Electrode | Array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germania | EcoFlexMEA36 | Configurazione MEA |
| Software di registrazione di array multi-elettrodo | Sistemi multicanale, Reutlingen, Germania | MC_Rack | Configurazione MEA |
| Forbici a molla | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 15003-08 | per la preparazione del cuore |
| Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 14575-09 | la preparazione del cuore | |
| Forbici | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 14110-15 | Preparazione del cuore |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11203-25 | Preparazione del cuore |
| London Forceps Fine | Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11080-02 | Preparazione del cuore |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11003-13 | Preparazione del cuore |
| Involucro di plastica | Parafilm M, Bemis NA, con sede a Neenah, WI, Stati | Materiali di consumo | |
| Stereomicroscopio | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, Regno Unito< | em>pE-100 | FRET |
| DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET | |
| Set di filtri DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS fotocamera CMOS scientifica | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | Software di imaging FRET |
| Micro-Manager; Vale Lab, Università della California San Francisco, CA, USA | FRET | ||
| Software Image J; Pubblico dominio, NIH, USA | FRET |
Riferimenti
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isola....
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