Infarto miocardico acuto in topi induce cambiamenti acuti ma in modo incompleto caratterizzati in funzione ventricolare di sinistra (LV). Cateterizzazione di LV in topi sottoposti a occlusione dell'arteria coronaria serve come un nuovo metodo per una valutazione in tempo reale della funzione di LV.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi in tempo reale pressione-volume di infarto miocardico acuto nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Infarto miocardico acuto può portare a insufficienza cardiaca acuta e shock cardiogeno. La valutazione dell'emodinamica è critica per la valutazione di qualsiasi potenziale approccio terapeutico diretto contro la disfunzione ventricolare sinistra acuta (LV). Attuali modalità di formazione immagine (ad es., l'ecocardiografia e la risonanza magnetica) hanno diverse limitazioni, poiché i dati sulla pressione di LV non possono essere misurati direttamente. Cateterizzazione di LV in topi sottoposti a occlusione dell'arteria coronaria potrebbe servire come un nuovo metodo per una valutazione in tempo reale della funzione di LV.
All'inizio della procedura, i topi sono stati anestetizzati seguita da intubazione endotracheale. Per cateterizzazione LV, arteria carotica di destra era esposta tramite incisione medio-collo. Il catetere è stato introdotto e inserito nella cavità LV. È stato condotto il thoracotomy di sinistra e l'arteria coronaria principale sinistra (LCA) è stata legata. Per indurre la riperfusione, la sutura è stata rilasciata dopo 45 min. pressione-volume dei dati è stati registrati in ogni momento.
Legatura della LCA ha provocato una diminuzione nella funzione sistolica del ventricolo come evidenziato da una riduzione del 30% nel volume sistolico, frazione di espulsione di LV (EF) e gittata cardiaca. DP/dt massimo come parametro per la contrattilità di LV è stato anche significativamente ridotto e funzione diastolica è stata alterata severamente (minimo dP/dt-40%). Riperfusione in un periodo di 20 min non ha condotto ad un recupero completo della funzione di LV.
Analisi in tempo reale pressione-volume servito come una valida procedura di monitoraggio della funzione cardiaca durante infarto miocardico acuto in topi. Mantenere l'anestesia stabile e un approccio chirurgico standardizzato era cruciale per garantire risultati validi. Come la fase iniziale di infarto miocardico acuto è critica per la morbosità e la mortalità, il metodo delineato potrebbe essere utile per la valutazione preclinica di nuove strategie per la cardioprotezione.
Introduzione
La malattia cardiovascolare è la causa più comune di morte nella civiltà occidentale1. Infarto miocardico acuto è un evento critico, che è associato con alta mortalità acuta e cronica2. Anche se la rivascolarizzazione è raggiunto tramite emergenza intervento coronarico percutaneo (PCI), la mortalità rimane alta, specialmente entro le prime 48 h dopo l'inizio dei sintomi in pazienti con infarto miocardico acuto3. Shock cardiogeno causato da acuta riduzione della funzione ventricolare di sinistra (LV) è delle principali cause di mortalità in ospedale in questi pazienti3. Questa riduzione iniziale in funzione di LV è causata da danno del miocardio dopo ischemia e riperfusione. Questa cosiddetta ischemia/riperfusione (I / R) lesione è mediato dai cambiamenti nel metaboloma cellulare come eccessiva generazione di specie reattive dell'ossigeno4,5.
Per esplorare possibili meccanismi protettivi che conduce ad una diminuzione in danno del miocardio in un ambiente preclinico, modelli murini affidabili sono essenziali inclusi metodi per la valutazione dell'alberino-I/R LV funzione6. In questa impostazione, l'ecocardiografia transthoracic7 e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)6 sono ampiamente usati per fenotipizzazione funzionale8,9. Tuttavia, questi metodi non sono adatti per la valutazione della disfunzione severa di LV e shock cardiogeno in un infarto miocardico acuto in corso e non possono mostrare direttamente i dati sulla pressione di LV. L'apparato di Langendorff utilizzando cuore isolato in un'analisi ex vivo fornisce informazioni circa il sottostante pathomechanisms della presto-fase I / R ferita10. Questo metodo è limitato a causa della sua incapacità di riprodurre in vivo meccanismi adattativi come la regolazione del sistema nervoso autonomo o regolazione ormonale e l'omeostasi acido-base. Non esiste attualmente un metodo disponibile per una fenotipizzazione funzionale completa di shock cardiogeno e disfunzione ventricolare sinistra durante un'esibizione continua del miocardio mi / lesioni R.
Un approccio sincronizzato con combinazione di cateterizzazione di pressione-volume (PV) e l'occlusione transitoria chirurgico principale arteria coronaria di sinistra (LCA) potrebbe essere utile ma tecnicamente impegnativo. Emodinamica stabile extracardiache durante il I / lesioni R sono essenziali per ottenere risultati validi poiché instabile anestesia o perdite di sangue potrebbero influenzare pesantemente i risultati. Un romanzo si avvicinano per emodinamica fenotipizzazione di I / R lesioni tramite LV PV cateterizzazione e transitori LCA OCCLUSIONE potrebbe portare nuove intuizioni su LV disfunzione nell'infarto miocardico acuto e shock cardiogeno e servire come un metodo per analisi future su cardioprotezione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e rispetto di tutte le normative pertinenti ("Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per sperimentale e altri fini scientifici (direttiva 2010/63/UE) e la cura degli animali è stato conformità alle linee guida istituzionali. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con topi C57BL/6JRj maschio all'età di 6 mesi.
1. preparazione
- Preparare un microscopio chirurgico e un rilievo di riscaldamento, nonché una sonda rettale per monitorare la temperatura corporea. Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici.
- Preparare 2 pezzi di 10 cm filo di seta 5-0 per la legatura del vaso, 5 cm di filo in polipropilene 6-0 e tubo in silicone di 2 mm per legatura della LCA.
- Preparare la cuvetta di calibrazione del catetere PV di pre-riscaldamento a 37 ° C e preparare un 100 µ l Hamilton siringa riempita con 15% di cloruro di sodio (NaCl) in H2O per la calibrazione di Salina.
- Catetere a posto il PV (3 cm, 1,4 F) a 37 ° C pre-riscaldata 0,9% NaCl in H2O (salino) almeno 30 minuti prima della misurazione. Collegare il catetere al dispositivo di acquisizione dati e collegare il dispositivo ad un convertitore analogico/digitale. Collegare entrambi i dispositivi a un computer.
- Installare il software. Eseguire la taratura pressione guidata e conduttanza come richiesto dal software-guida del flusso di lavoro8.
2. anestesia e Analgesia
- Anestetizzare il mouse utilizzando ketamina 100 mg/kg di peso corporeo e xilazina cloridrato 10 mg/kg di peso corporeo tramite l'iniezione intraperitoneale. All'inizio dei / chirurgia R, amministrare 0,05 mg/kg corpo peso buprenorfina per via intraperitoneale per mantenere l'analgesia.
- Dopo 10 min, eseguire un'intubazione endotracheale utilizzando un catetere di 20 G per via endovenosa (iv) e ventilare il mouse con 40% di ossigeno (O2) e 2% (v) isoflurano. Impostare i parametri di ventilazione appropriata (ad es., 220 µ l di colpo, 150/min per un mouse C57BL/6JRj 25-30 g).
- Monitorare continuamente il corpo temperatura tramite sonda rettale. Fissare la piastra riscaldata del mouse con la testa rivolta verso lo sperimentatore. Temperatura corporea normale mouse è 36.5-38 ° C. Mantenere la temperatura corporea all'interno di 1 grado di regolazione della temperatura della piastra riscaldata.
3. cateterizzazione ventricolare sinistra
- Disinfettare il petto e collo con tre scrub alternati di betadine e 70% di alcol. Attendere il disinfettante della pelle a secco. Rimuovere i peli del petto utilizzando un sistema di rasatura animale.
- Eseguire un'incisione mediana longitudinale di 10 mm 5 mm sotto il labbro inferiore verso lo sterno utilizzando piccole forbici chirurgiche.
- Sezionare la parte destra e sinistra della ghiandola sottomandibolare tramite preparazione smussato utilizzando una pinza. Separare il tessuto muscolare e grasso nella regione paratracheal giusto per esporre la carotide comune destra. Mobilitare e separare la nave per una lunghezza totale di 5-10 mm dal tessuto connettivo tramite un'attenta preparazione smussato sottobordo della nave con un forcipe curvo.
Nota: Evitare la manipolazione meccanica del nervo vago o del corpo carotico a tutto il tempo come questo può causare bradicardia e ipotensione severa. - Passare i due fili di seta preparati sotto la nave. Legare il vaso distale con un nodo stretto e posizionare un nodo sciolto sulla regione prossimale esposta che ancora permette il passaggio del catetere.
- Fissare i fili del nodo cranico (stretto) a fianco della testa dei topi di applicare una leggera tensione sul vaso come questo faciliterà l'introduzione del catetere. Posizionare una pinza vascolare emostato sul vaso prossimale prossimale del nodo sciolto a reversibilmente bloccare il flusso sanguigno.
- Eseguire un'incisione a forma di Cuneo 1 mm prossimale al nodo cranico per aprire il recipiente con micro-forbici.
Nota: Una piccola goccia di sangue indicherà la corretta esecuzione di questo passaggio. - Inserire il catetere con attenzione per 10 mm. iniziare la registrazione dei dati del catetere.
Nota: Stretching l'incisione con un forcipe può rendere questo processo più facile. - Estrarre la pinza vascolare. Aggiungere 1-2 gocce di soluzione fisiologica per l'incisione per facilitare il movimento del catetere. Continuare a introdurre il catetere per circa un altro 10 mm. Dopo aver superato il nodo prossimale con la punta del sensore, fissare il nodo con attenzione appena sufficiente a prevenire sangue reflusso a fianco le parti più sottili del catetere senza alterare il movimento del catetere.
Nota: La dimensione del sensore all'estremità del catetere impedisce il reflusso di sangue durante l'estrazione il clamp vascolari. - Delicatamente continuare a inserire il catetere fino a quando la pressione analisi mostra il profilo di pressione arteriosa, che indica che il catetere è posizionato nell'aorta (Figura 3A).
Nota: Il catetere raggiungendo la valvola aortica indicherà di resistenza alla luce e movimento sincronizzato di impulso del catetere. - Quando si verifica la resistenza cercando di avanzare attraverso la valvola aortica, tirare il catetere indietro 5 mm e avanzare nuovamente fino a cateterizzazione LV sarà indicata in un cambiamento nell'analisi del fotovoltaico come pressione diastolica raggiunge 0 - 20 mmHg (Figura 3B). Notare le variazioni di volume monitoraggio per confermare ulteriormente ventricolare sinistra posizionamento della punta del sensore (Figura 3). Affrancare il nodo prossimale più stretto per impedire il movimento del catetere.
4. ischemia/riperfusione chirurgia
- Eseguire incisione cutanea dallo sterno caudale verso il axilla di sinistra per una lunghezza totale di 15 mm. procedere con smussato preparazione degli strati due muscolari fino a quando le costole possono essere visualizzate.
- Aprire il torace tramite incisione tra la terza e la quarta costola sinistra. Utilizzare ganci chirurgici per ottenere accesso al pericardio. Resecare il pericardio sopra il cuore. Prima di continuare con la legatura di LCA, attendere 30 s senza toccare l'animale per registrare i dati di PV per analisi valida.
- Localizzare il LCA emergenti sotto l'auricola sinistra e scendendo sul lato sinistro del cuore verso l'apice. Utilizzare una sutura in polipropilene 6-0 per circondare l'arteria con un ciclo di 2 mm sotto l'auricola sinistra. Inserire un tubo di silicone sotto l'anello e inserire un nodo stretto sopra.
Nota: Ingrigire distale miocardio serve come controllo positivo per LCA OCCLUSIONE6. Io / R chirurgia dovrebbe essere eseguita entro 5 min indipendentemente dal ricercatore operativo. - Tagliare la sutura a 1 mm di lunghezza. Sbloccare i ganci chirurgici e chiudere manualmente gli strati di muscolo sopra l'incisione. Aspettare 45 min registrando continuamente dati PV.
- Dopo 45 min, riaprire l'incisione e rimuovere il tubo di silicone per indurre la riperfusione. Registrare i dati per un altro 20 min.
Nota: Un cambiamento di un colore rosso che vede prima di ischemia indica successo riperfusione.
5. taratura
Nota: La calibrazione del sistema fotovoltaico catetere è costituito di 4 passaggi obbligatori, due dei quali devono essere eseguite dopo la misurazione. Calibrazione deve essere ripetuto dopo ogni esperimento per garantire risultati validi.
- Eseguire la taratura di pressione e conduttanza prima dell'esperimento come descritto nel passo 1,5.
- Eseguire la calibrazione salina quando il catetere è ancora posizionato nel ventricolo sinistro dopo l'esperimento stesso è finito. Localizzare la vena giugulare di destra laterale dell'arteria carotica nell'area preparata. Iniettare 10 µ l 25% NaCl in H2O tramite un Hamilton siringa durante la registrazione dei dati.
- Calcolare la calibrazione utilizzando il software di acquisizione mettendo in evidenza la fase ascendente in curva di volume (Figura 5). Ripetere questo processo per un totale di 3 volte. Evitare la perdita di sangue dopo l'estrazione della siringa utilizzando una pinza vascolare per comprimere rapidamente la puntura.
- Eseguire la calibrazione del volume per calibrare l'acquisizione di dati di volume dall'analisi dei volumi standardizzati. Ottenere circa 500 µ l di sangue di topo da cardiaca puntura con una siringa da 1 mL leggermente eparinizzata (ad es., 5 µ l 200 eparina IE). Tirare indietro il catetere PV 10-15 mm per evitare di danneggiare il catetere.
- Riempire il sangue ottenuto nella cuvetta calibrazione pre-riscaldata 37 ° C (Figura 5A). Evitare le bolle come potrebbe interferire con i risultati. Aggiungere la punta del catetere in ogni bene e registrare i dati. Ottenere una curva standard di analisi guidata (figura 5B). Ripetere il processo per un totale di 3 volte.
- Eutanasia, topi da dissanguamento o dislocazione cervicale mentre sufficiente isoflurano anestesia viene mantenuta in ogni momento.
6. analisi dei dati
- Dopo aver completato la procedura di calibrazione, eseguire analisi di dati guidata. Pertanto, evidenziare la sezione appropriata (almeno dieci cicli) all'interno della sezione di analisi del Flusso di lavoro PV ed eseguire analisi di base. Escludere i cicli con deviazioni a causa di ventilazione o manipolazione se necessario (Figura 3D).
- Eseguire analisi di base di PV prima del passaggio della valvola aortica (solo la pressione arteriosa), immediatamente prima e dopo l'occlusione LCA. Procedere per lo svolgimento di analisi di base di PV e in intervalli di 5 minuti durante l'ischemia e dopo riperfusione. Alla fine dell'esperimento, è possibile eseguire analisi dei dati di pressione dopo la retrazione del catetere dal ventricolo sinistro (pressione arteriosa).
- Analizzare almeno 10 cicli consecutivi per evitare l'errore di campionamento. Quando verificano forti interferenze di ottenuti valori con la ventilazione, transitoria interruzione della ventilazione per un massimo di 5 s può essere considerato.
- Utilizzare i seguenti parametri che vengono calcolati nell' Analisi di base (Figura 3D) per caratterizzare la funzione di LV:
- Volume sistolico (µ l)
- Frazione di eiezione: volume corsa / fine-diastolica volume (%)
- Gittata cardiaca: volume corsa * frequenza cardiaca (µ l/min)
- Indice cardiaco: portata cardiaca / superficie (µL/(min*cm²) del corpo
- Corsa di lavoro: zona interna della curva di PV (mmHg * µ l)
- Pressione massima (Pmax); Pressione media (Pmedia)
- dP/dt massimo (mmHg/s) come un parametro di funzione sistolica del ventricolo
- min dP/dt (mmHg/s) come parametro per la conformità di LV
- Costante di tempo di rilassamento isovolumetrico: Tau (ms)
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Dopo cateterizzazione LV, reversibile LCA legatura è stata realizzata per 45 min seguita da 10 min di riperfusione. Dati di PV è stati registrati a tutte le volte (Figura 1).
Corretto posizionamento del catetere PV è stato confermato ottenendo il grafico caratteristico di LV PV (Figura 2A). Posizionamento del catetere di LV hanno mostrato la gamma di pressione ventricol...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Monitoraggio FV di emodinamica LV nell'infarto miocardico acuto serve come un nuovo metodo per la valutazione in tempo reale in vivo di shock cardiogeno e l'alterata funzione di LV in ho / lesioni R. Cateterizzazione PV può fornire un ampio spettro di parametri per quanto riguarda la funzione sistolica e diastolica di LV. Oltre ai parametri volumetrici di LV in genere ottenuti tramite ecocardiografia o MRI (camera volumi, EF, gittata sistolica e gittata cardiaca), analisi del fotovoltaico produce un profilo più ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: altro Kröner-Fresenius-Stiftung (Tienush Rassaf); Hans und Gertie Fischer Stiftung (Tienush Rassaf), concedere dalla facoltà di medicina, Università di Duisburg-Essen, Germania (Tienush Rassaf, Lars Michel); Ernst-und Berta Grimmke-Stiftung (Christos Rammos).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Betaisodona Loesung | Mundipharma | 4162-1606/89x30mm | Povidon-Iod |
| Cuvetta di calibrazione | Millar instruments | 910-1049 | Cuvetta di calibrazione |
| Contura tagliacapelli professionale | Wella | HS-60 | Sistema di rasatura per piccoli animali |
| Eclipse Needle 27G | BD | REF 305770 | 27G ago |
| Pinze | FST | 11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10 | Pinze chirurgiche |
| Pinze Aesculap Braun | BN731R, BD 311R | Pinze chirurgiche | |
| Foris FS2434 | Eizo | 0FTD2033 | Monitor |
| Hamilton Siringa 100 &; l ago | Hamilton | 80621 | 100µ l siringa con ago |
| Tavolo OP riscaldato per piccoli animali | Harvard Apparatus | 15001 | Tavolo OP riscaldato |
| Eparina-Natrium 25000 | Ratiopharm | N68542.04 | Eparina |
| Ketamin 10% 100 mg/ml | bela-pharm | FS1670041 | Ketamin |
| Labchart Pro 8 + Pro moduli | AD Instruments | MLS260/8 | Software di analisi dati PV |
| LAS EZ | Leica | LAS EZ | Software della fotocamera per microscopio |
| Leica IC80 HD | Leica | IC80 HD | Fotocamera per microscopio |
| Leica M80 | Microscopio Leica | M80 | |
| Trasduttore per catetere a micropunta | Millar | Catetere fotovoltaico | SPR-839 |
| Apparecchio MiniVent | Harvard | 845 | strumenti di ventilazione |
| MPVS Ultra | Millar | acquisizione dati per catetere fotovoltaico | PL3508B48/M |
| Octenisept | Schü lke | 20000832-A | disinfettante |
| Plastipak 1ml | PD | REF 303172 | siringa da 1 ml |
| PowerLab 8/35 | AD Instruments | PL3508 | convertitore analogico/digitale |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XNEH7814. P31 | sutura in polipropilene |
| FST | 18200-20 | retrazione del sito chirurgico | |
| Seraflex 5-0 | Sutura di seta | Naila | IC108000 |
| Piccole e micro-forbici | FST Essen | 14059-11, 15007-08, 14064-11 | Forbici chirurgiche |
| Piccolo tubo in silicone | Reichelt Tubo Chemietechnik | per occlusione LCA | |
| Sodio Cloruro | Sigma-Aldrich | S7653 | Cloruro di sodio |
| testo 108 | testo | 5631080 | termometro rettale |
| Computer desktop Thinkcentre | Computer PC0EJS2V Lenovo | ||
| Vasofix Safety 20G | Braun | 4269110S-01 | catetere per intubazione |
| Windows 10 | Microsoft | KW9-00240 | Sistema operativo |
| Xylazin 2% | Ceva | 6324464.00.00 | Xilazina cloridrato |
Riferimenti
- Sanchis-Gomar, F., Perez-Quilis, C., Leischik, R., Lucia, A. Epidemiology of coronary heart disease and acute coronary syndrome. Annals of Translational Medicine. 4 (13), 256(2016).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- McNamara, R. L., et al. Predicting in-hospital mortality in patients with acute myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 68 (6), 626-635 (2016).
- Kurian, G. A., Rajagopal, R., Vedantham, S., Rajesh, M. The Role of Oxidative Stress in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury and Remodeling: Revisited. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , (2016).
- Turer, A. T., Hill, J. A. Pathogenesis of myocardial ischemia-reperfusion injury and rationale for therapy. American Journal of Cardiology. 106 (3), 360-368 (2010).
- Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of Biological Methods. 3 (4), (2016).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac catheterization in mice to measure the pressure volume relationship: Investigating the Bowditch effect. Journal of Visualized Experiments. (100), e52618(2015).
- Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: Impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
- Task Force on the management of ST-segment elevation acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology (ESC). ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation. European Heart Journal. 33 (20), 2569-2619 (2012).
- Shigemitsu, O., et al. Acute myocardial infarction due to left main coronary artery occlusion. Therapeutic strategy. Japanese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 50 (4), 146-151 (2002).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
