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Articolo metodologico

Un protocollo per acquisire il Tenocyte degenerativa dagli esseri umani

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DOI:

10.3791/57634

⸱

9 giugno 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Uso in vitro di tenociti degenerativa è essenziale quando indagare l'efficacia del trattamento novello su tendinopathy. Tuttavia, molti studi di ricerca utilizzano solo il modello animale o un sano tenocyte. Vi proponiamo il seguente protocollo per isolare tenociti degenerativa umana durante la chirurgia.

Abstract

Tendinopatie, una condizione dolorosa che si sviluppa in risposta alla degenerazione del tendine, sono in aumento nei paesi industrializzati a causa della crescente attività fisica e maggiore aspettativa di vita. Nonostante la sua prevalenza aumentante, la patogenesi di fondo rimane ancora poco chiara, e il trattamento è generalmente sintomatico. Recentemente, numerose opzioni terapeutiche, tra cui fattori di crescita, cellule staminali e terapia genica, sono state studiate nella speranza di migliorare la potenza di guarigione del tendine degenerante. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo su modelli animali o tenociti umano sano. Nonostante alcuni studi utilizzando tenociti patologiche, al meglio della nostra conoscenza non c'è attualmente nessun protocollo che descrive come ottenere umano tenociti degenerativa. Lo scopo di questo studio è di descrivere un protocollo standard per l'acquisizione di tenociti degenerativa umana. Inizialmente, il tessuto del tendine è stato raccolto da un paziente con epicondilite laterale durante la chirurgia. Quindi i campioni di biopsia sono stati prelevati il tendine di brevis radialis dei carpi dell'estensore corrispondenti ai cambiamenti strutturali osservati al momento della chirurgia. Tutti i tendini raccolti è sembrato essere opaco, grigio, friabile ed edematosa, che li ha resi visivamente distinta da quelle sane. Tenociti erano coltivati e utilizzati per esperimenti. Nel frattempo, la metà dei tessuti raccolti sono stata analizzata istologicamente ed è stato indicato che condividevano le stesse caratteristiche chiave della tendinopatia (displasia angiofibroblastic o iperplasia). Un'analisi secondaria di immunocitochimica ha confermato che le cellule coltivate erano tenociti con la maggior parte delle cellule che hanno le macchie positive per le proteine mohawk e tenomodulin. Le qualità della natura degenerativa di tenociti sono stati quindi determinate confrontando le cellule con il controllo sano mediante un'analisi di proliferazione o qRT-PCR. Il tenocyte degenerativa visualizzato un più alto tasso di proliferazione e simili modelli di espressione genica di tendinopathy corrispondenti rapporti precedenti. Nel complesso, questo nuovo protocollo potrebbe fornire uno strumento utile per gli studi futuri di tendinopatia.

Introduzione

Tendinopatia è una condizione muscolo-scheletrica degenerativa cronica che si sviluppa in varie parti del corpo. Recentemente, il numero di casi di tendinopathy è aumentato notevolmente nel mondo sviluppato a causa della crescente partecipazione in attività sportive e una maggiore aspettativa di vita1,2. La causa della tendinopatia è considerata multifattoriale e queste cause comprendono ischemia, lesioni di radicali liberi dell'ossigeno, uno squilibrio tra innervazione vasocostrittore e vasodilatatore, micro-strappi interni ed i cambiamenti neuro-regolamento3 ,4,5,6,7,8. Maggior parte dei trattamenti per tendinopatia solo alleviare i suoi sintomi. Inoltre, trattamenti senza rigenerazione tissutale richiedono molto tempo per la riabilitazione ed ottenere una risposta limitata da tendini feriti, che impone una sfida clinica per i medici9.

L'incompetenza di opzioni correnti di trattamento insieme alla mancanza di capacità di tendine degenerante di Self-Heal ha piombo ricercatori ad interessarsi di esplorare strategie di trattamento alternativo. Recentemente, nuovi studi segnalati molti risultati promettenti per migliorare l'efficacia curativa dei tendini tendinopatie utilizzando fattori di crescita, basata sulle cellule staminali terapia e gene terapia10,11,12.

Attraverso una revisione della letteratura, abbiamo trovato che gli studi coinvolti possono essere diviso in due categorie basate sulla loro materiali di analisi: modelli animali come un topo, un topo o un coniglio; e modelli umani. Per quanto riguarda il modello animale, attualmente ci sono due tecniche popolari per generare tendinopathy: induzione chimica di lesioni o meccanico sovraccaricare il modello. Tuttavia, ogni modello animale è stato limitato nel riprodurre le tendinopatie umana complessa patologia13,14.

Maggior parte delle carte utilizzando campioni umani sono stati analizzati istologicamente o eseguita l' in vitro esperimento basato su un tenocyte umano sano anziché un degenerativa tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. solo poche carte segnalato che hanno usato un umano tenocyte degenerativa, ma non ha descritto in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere il tenocyte degenerativa dal umano22,23. In questo contesto, si deve sottolineare che risultati di successo dal modello animale o il tessuto sano/tenocyte non possono necessariamente prevedere efficacia umana o dosaggio efficace perché la degenerazione del tendine è un processo complicato e la patogenesi è ancora non pienamente compreso.

Collettivamente, è necessario descrivere il protocollo standard per ottenere il tenocyte degenerativa dal tessuto umano senza causare effetti negativi al donatore. Questo articolo descrive un protocollo su come acquisire l'umana tenocyte degenerativa. Per convalidare il protocollo, i tessuti raccolti sono stati analizzati istologicamente. Quindi, le cellule in coltura è stata confermata come la tenocyte degenerativa mediante immunocitochimica (ICC), una reazione a catena della polimerasi di tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e un'analisi di attuabilità.

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Protocollo

Il protocollo è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki e il protocollo è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale CHA Bundang Medical Center.

1. degenerative dei tendini tessuto raccolto dal paziente

  1. Diagnosticare l'epicondilite laterale prendendo una storia medica e utilizzando i risultati di esame fisico: tenerezza sopra l'origine tendinous vicino epicondyle laterale; dolore evocato dall'estensione resistita dell'articolazione del polso.
  2. Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: oltre 18 anni di età; una storia di epicondilite laterale per un minimo di sei mesi; recalcitranti per trattamento conservativo; almeno tre mesi sono passati da iniezione di corticosteroidi, plasma ricco di piastrine o tossina botulinica
  3. Escludere i seguenti: le donne incinte; pazienti con una storia di malattia cervicale della spina dorsale, gomito artrite, malattia reumatologica, chirurgia intorno a gomito e la sindrome da intrappolamento del nervo; pazienti che rifiutano di donare del tessuto.
  4. Tecnica chirurgica
    Nota: Vedere Figura 124.
    1. Dopo l'anestesia generale da isoflurane e l'intubazione endotracheale, metti il braccio sul tavolo e applicare un laccio emostatico. Quindi applicare betadine agente sull'intero braccio e drappo con un foglio di chirurgico asettico.
    2. Esporre il gomito laterale attraverso un'incisione di 3 – 5 cm con n ° 15 lama bisturi chirurgico anteromedial solo al epicondyle laterale e prossimale al livello dell'articolazione.
    3. Visivamente identificare il longus di radialis dei carpi dell'estensore (ECRL) e l'interfaccia di aponeurosi dell'estensore e fare una scissione Incisione 2 – 3 mm in profondità tra l'aponeurosi ECRL e dell'estensore con una lama di bisturi chirurgico Nr. 15 presso l'interfaccia identificata.
    4. Estrarre il ECRL anteriormente, che porterà l'origine di brevis (ECRB) patologica extensor carpi radialis longus sotto nella vista diretta.
    5. Identificare visivamente il tessuto patologico degenerativo dal suo caratteristico colore grigiastro opaco e tessuto solitamente edematoso e friabile.
    6. Dopo l'identificazione, attentamente resecare tutto il tessuto degenerativo acutamente utilizzando mini-lame e bisturi chirurgico n ° 15.
    7. Incorporare il tessuto resecato (circa 1 cm3) in tampone fosfato salino (PBS) immediatamente e rimuovere tutto il tessuto circostante ad eccezione del tessuto del tendine attentamente in circa 10 mL di PBS appena possibile.
    8. Nei casi con exostosis ossuto al epicondyle laterale, rimuovere exostosis utilizzando una Pinza ossivora ed lisciare con una raspa. Rendere più fori (diametro 1,6 mm, circa 6 – 8 fori) nel condilo anterolateral per migliorare il rifornimento vascolare. Questo è facoltativo.
    9. Chiudere la ferita a strati con materiale di sutura non assorbibile.
  5. Controllo sano tenocyte
    1. Ottenere sano tenociti dal restante tendine del tendine auto-tendine del ginocchio o auto-rotula durante la ricostruzione del legamento crociato anteriore e usarlo come il controllo per l' esperimento seguente25.
      Nota: Il numero di campioni utilizzati in questo studio era tre in ogni gruppo.

2. istologia

  1. Circa la metà del tessuto raccolto conservare in formalina 10% neutra tamponata in una cappa chimica o equivalente.
  2. Incorporare il tessuto in un blocco di paraffina (4 – 5 mL) e la sezione e nelle sezioni di 4 – 5 µm coronalmente.
  3. Macchia di sezioni da controllo e degenerative dei tendini con macchia ematossilina ed eosina (H & E) e la macchia blu di Alcian a pH 2.5. Eseguire H & E che macchia in una macchina automatizzata macchia come segue.
    1. Deparaffinizzare utilizzando xilene (3 volte, 5 min, rispettivamente).
    2. Idrato da alcoli Graduate all'acqua (100% alcool, 4 min; 100% alcool, 3 min; 95% alcool, 2 min; alcool al 70%, 1 min; acqua, 2 min).
    3. Macchia in ematossilina per 5 min, lavare bene in acqua per 2 min.
    4. Differenziare in alcool acido 1% (1% HCl in 70% di alcool) per 3 s. lavare bene in acqua per 3 min.
    5. Neutralizzare HCl mediante immersione in un 0,5% ammoniaca per 10 s, seguita da un lavaggio ad acqua 3 min.
    6. Macchia in Eosion per 5 min.
    7. Disidratare attraverso alcoli (80% di alcool, 30 s; 95% di alcol, 1 min; 100% alcool 1 min, 100% alcool 2 min).
    8. Chiaro in xilene (3 volte, 2 min, 2 min e 3 min, rispettivamente).
    9. Montare con un vetrino.
  4. Eseguire immunohistochemitry (IHC) utilizzando il kit di Bond polimero affinare rilevamento secondo le istruzioni del produttore con modifiche minori.
    1. Dopo Sparaffinatura utilizzando xilene, eseguire una procedura di ricupero dell'antigene utilizzando la soluzione di smascheramento dell'epitopo di Bond per 30 min a 100 ° C. Soluzione per lo smascheramento Bond contiene un tampone citrato basato e tensioattivo (1 L, pH 5.9-6.1).
    2. Placare la perossidasi endogene incubando il tessuto con acqua ossigenata per 5 min.
    3. Incubare le sezioni per 15 minuti ad una temperatura ambiente (21-22 ° C) con gli anticorpi primari contro il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) o mohawk (1: 200).
    4. Eseguire anticorpo secondario tagging con un sistema di biotina-libero polimerici rafano perossidasi-linker anticorpo coniugato.
      1. Uso secondario coniglio anti mouse IgG nel siero animale 10% (v/v) in soluzione 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one saline/0.09% tamponata a localizzare gli anticorpi del mouse.
      2. Utilizzare anti-coniglio polimero poli-HRP-IgG (< 25 µ g/mL) che contiene il siero animale 10% (v/v) in saline/0.09% tamponata per la localizzazione di anticorpi di coniglio.
      3. Utilizzare 3, 3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride idrato in una soluzione di stabilizzatore per visualizzare il complesso via un precipitato marrone.
      4. Colorante di contrasto con < 0,1% ematossilina (blu) per visualizzare i nuclei cellulari.
  5. Osservare i vetrini colorati con H & E, Alcian blu macchie e IHC per VEGF, tenomodulin e mohawk sotto il microscopio chiaro e ottenere immagini microscopiche rappresentativi di ogni diapositiva sotto campo uno ad alta potenza (400 X).

3. Tenocyte cultura

  1. Preparazione tessuto
    1. Preparare il campione di tendine rimuovendo tutto il tessuto circostante accuratamente con micro-forbici e pinze.
    2. Lavate con PBS e sminuzzare in piccoli pezzi (circa 1 mm3 o meno).
    3. Digerire tessuto per 1 h a 30 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM) completate con collagenasi II 30 mg/mL a 37 ° C.
    4. Passare le cellule attraverso un colino di cella di 100 µm.
    5. Disattivare collagenosi II aggiungendo 1 mL di siero bovino fetale (FBS).
    6. Centrifugare a 196 x g per 5 min.
  2. Coltura cellulare
    1. 3 x 105 celle di semi in un piatto di 100 mm e cultura con DMEM completati con 10% FBS e 1% soluzione antibiotico antimicotico a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 1 settimana.
    2. Cambiare il terreno di coltura ogni tre giorni fino a quando si verifica la confluenza di 80%. Della coltura sia buona salute di controllo e campioni degenerativa delle cellule fino al passaggio 4 e utilizzare per l'esperimento.

4. immunocitochimica (ICC)

  1. Trasferire 200 µ l di cellule in coltura (2 x 105 cellule) otto pozzetti di una diapositiva di camera e crescere le cellule alla confluenza con l'aggiunta di mezzi freschi per 1 giorni.
  2. Lavare le cellule con PBS e difficoltà con 500 µ l di formaldeide al 4% per pozzetto.
  3. Incubare i vetrini con 0,5% Triton X-100 in PBS per 10 min per permeabilizzazione delle membrane.
  4. Blocco in PBS con 1% di albumina di siero bovino e 0.05% TWEEN-20 per mohawk e tenomodulin, rispettivamente.
  5. Incubare per una notte al buio con anticorpo monoclonale di topo anti-mohawk (diluizione 1: 100) e l'anticorpo di capra anti-tenomodulin (diluizione 1: 100) a 4 ° C.
  6. Incubare gli anticorpi secondari (Alexa 555-anti capra (1: 200) per tenomodulin; Alexa 488 anti-murine (1: 200) per mohawk) al buio per 1 h a temperatura ambiente.
  7. Montare con 0,5 µ l di un mezzo di montaggio di fluorescenza.
  8. Analizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza (400 X).

5. proliferazione Assay

  1. Viabilità di cella di misura utilizzando tetrazolium solubile in acqua (WST) -1.
    1. Semi di cellule sia sane e degenerante in 96 pozzetti ad una densità di 2 x 103 cellule per pozzetto per 24, 72 e 120 ore.
    2. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 µ l di soluzione di WST-1 al 10% ad ogni pozzetto.
    3. Incubare le piastre per 3 h a 37 ° C in 5% CO2.
    4. Misurare la densità ottica a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Prendere letture almeno tre volte a tutti i punti di tempo per ogni campione.
  2. Quantità di DNA cellulare misura usando l'analisi di BrdU.
    1. Seme sia sani e degenerativa delle cellule in 96 pozzetti ad una densità di 2 x 103 cellule per pozzetto per 24, 72 e 120 ore.
    2. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 µ l di soluzione di BrdU 10% ad ogni pozzetto.
    3. Incubare le piastre per 3 h a 37 ° C in 5% CO2.
    4. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di fissaggio/denaturare (60 – 70% di etanolo, 0,1 – 0,5% idrossido di sodio) e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
    5. Aggiungere 100 µ l/pozzetto preparato 1 x soluzione di anticorpo di rilevazione e tenere la piastra a temperatura ambiente per 1 h.
    6. Soluzione di rimuovere e lavare tre volte con tampone di lavaggio 1X.
    7. Aggiungere 100 µ l/pozzetto preparato soluzione anticorpo secondario coniugato HRP 1x e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
    8. Rimuovere la piastra di soluzione e lavare tre volte con tampone di lavaggio 1X.
    9. Aggiungere 100 µ l di substrato TMB al 50%.
    10. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    11. Aggiungere 100 µ l di soluzione bloccante.
    12. Misurare la densità ottica a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
      Nota: Letture di prendere almeno tre volte a tutti tempo punti per ciascun campione.

6. elaborazione statistica

  1. Raccogliere e analizzare i dati utilizzando SPSS.
  2. Raffigurano dati da media ± errore standard della media.
  3. Test di Mann Whitney U uso.
  4. Considerare le differenze statisticamente significative quando il valore di p è minore di 0,05 (p < 0,05).

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Risultati

Le analisi istologiche hanno rivelato che il tessuto raccolto da epicondilite laterale ha avuto le caratteristiche di un tendine di tendinopathic. Sezione H & E di tendinopatia degenerativa del tendine ha rivelato un bundle di collagene disorganizzato con una perdita di polarità e strutture di fibra parallela dritto, fortemente pranzo fine. Segni istologici indicativi di degenerazione come più alto cellularity e nuclei ingrandetti senza la forma tipica dell'alberino erano comuni nei c...

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Discussione

Una serie di studi precedenti hanno riferito come creare modelli animali tendinopathic cronica, utilizzando diverse procedure quali collagenosi o kartogenin iniezione, tapis roulant in esecuzione e più26,27. Anche se numerosi studi hanno mostrato promettenti effetti terapeutici sulla base di questi modelli animali, esperimenti utilizzando il tenocyte degenerativa umana sarebbero stato fondamentali nel campo della tendinopatia al fine di riprodurre l'efficacia del...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Corea Health Technology R & D Project attraverso la Corea salute industria Development Institute (KHIDI), che è stato finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI16C1559).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BisturiKisanbioKS-Q0306-15No. 15
Mini-lamaCastoro374769
Dulbecco's modificato Eagle's medium (DMEM)Gibco11995065
PBSGibco14190250
siero fetale bovino (FBS)Gibco16000044
50 mM acido ascorbico-2-fosfatoSigma-AldrichA5960
Soluzione antibiotico-antimicoticaGibco15240062
4% formaldeideBio-soluzioneBP031
Triton X-100 Sigma-AldrichX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa cruz biotechnologysc-515878
Tenomodulin (N-14)Santa cruz biotechnologysc-49325
Mezzo di montaggio a fluorescenzaDAKOS3023
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
BrdU Kit di Saggio di Proliferazione CellulareTecnologia di Segnalazione Cellulare#6813
Reagente TRIzolInvitrogen15596018
Kit di sintesi iScript cDNA Bio-Rad170-8891
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
GAPDHThermo Fisher ScientificHs02786624_g1
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher Scientific
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBThermo Fisher Scientific Hs99999903_m1
Filtri cellulari (100 &; micro; m) Corning352360
Piatto di coltura da 100 mmThermo Fisher Scientific8188207
Vetrino da camera a 8 pozzettiThermo Fisher Scientific154534
96 pozzetti Chiaro Fondo piatto Polistirene Trattato TC MicropiastreCorning3596
Nikon Eclipse 50i Microscopio Nikon
VERSA max Molecular Devices
CFX96 Sistema di rilevamento PCR in tempo realeBio-Rad
Soluzione di formalina, tampone neutro, 10%Paraffine Sigma-AldrichHT501128
Leica Biosystems 3801340
EtanoloJUNSEI CHEMICAL90303-2185
EmatossilinaDAKOCS70030-2
EosinDAKOCS70130-2
Blu alcianoDAKOAR16011-2
Acido citricoSigma-Aldrich251275
XileneJUNSEI CHEMICAL25165-0430
Perossidasi endogene DAKOS200380-2
Balsamo del CanadaJUNSEI CHEMICAL23255-1210
Lama per microtomoFEATHERA35
Vetro scorrevoleSUPERIOR1000612
Vetro di coperturaMarienfeld-Superior101050
VEGFSanta cruz biotechnologysc-7269
SPSS SoftwareIBMVer. 18.0
Centrifuga multiusoLABOGENE1248R
Hs00243225_m1Lettore di micropiastre

Riferimenti

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