Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

Summary

Qui, abbiamo dettaglio le tecniche sperimentali utilizzate per valutare le forze di protrusione che podosomes si applicano su una pellicola compatibile, dalla preparazione del film per l'analisi automatizzata delle immagini topografiche.

Abstract

In numerosi contesti biologici, cellule animali hanno bisogno di interagire fisicamente con il loro ambiente attraverso lo sviluppo di forze meccaniche. Tra questi, le forze di trazione sono stati ben caratterizzate, ma c'è una mancanza di tecniche che permettono la misurazione delle forze protrusione esercitata dalle cellule ortogonalmente al loro substrato. Abbiamo progettato un setup sperimentale per misurare le forze di protrusione esercitate dalle cellule aderenti il loro substrato. Cellule piastrate su un foglio di Formvar compatibile con questo substrato di deformazione e la topografia risultante è mappata per microscopia a forza atomica (AFM) su scala nanometrica. I valori di forza vengono quindi estratti da un'analisi del profilo deformazione basato sulla geometria delle strutture cellulari protrusive. Quindi, le forze esercitate dalle singole unità sporgente di una cellula vivente possono essere misurate nel tempo. Questa tecnica consentirà lo studio della generazione di forza e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione. Qui, descriviamo la sua applicazione per misurare le forze protrusive generate da podosomes formata dai macrofagi umani.

Introduction

Cellule animali interagiscono fisicamente con la matrice e le altre cellule che costituiscono il loro ambiente¹. Ciò è necessario per loro di migrare, interiorizzare corpi, acquisire informazioni esterne o differenziare. In tali processi, la cella deve generare forze meccaniche e, come numerosi studi hanno dimostrato negli ultimi anni, la capacità di una cellula di generare forze e sonda ambiente influenza il comportamento biologico, dirigendo per esempio proliferazione o differenziazione^2,3. A sua volta, la misurazione delle forze cellulare è un aiuto importante per studiare la regolaz....

Protocol

1. preparazione di griglie rivestite con Formvar

1. Pulire le griglie di microscopia elettronica con acetone puro e farle asciugare su carta da filtro. Quindi pulire un vetrino da microscopio con etanolo puro, pulire con una carta per lenti e rimuovere la polvere con un soffietto.
2. Posto un vetrino pulito etanolo verticalmente nell'imbuto di un dispositivo di fusione pellicola contenente una soluzione di Formvar nella parte inferiore. Coprire la parte superiore dell'imbuto.
3. Con la lampadina atomizzatore pompa 100 mL di soluzione di Formvar (0,5%, dicloruro di etilene) fino a quando il livello raggiunge due terzi della diapositiva.
4. M....

Results

Il protocollo di cui sopra viene descritto come preparare la messa a punto sperimentale di quantificare le forze di protrusione applicate dal macrofago podosomes su un substrato di Formvar. Questa operazione viene eseguita mediante AFM ed è illustrata nella Figura 1.

Quando si analizza un'immagine topografica di rigonfiamenti sotto podosomes utilizzando il software di elaborazione dati JPK, un polin.......

Discussion

Proprietà del materiale

La scelta del materiale per la membrana deformabile, nel nostro caso Formvar, deve soddisfare alcuni requisiti. Il materiale deve essere trasparente alla luce visibile e presentano fluorescenza auto limitato per consentire osservazioni in campo chiaro e microscopia a fluorescenza. La rugosità del film sottile deve essere ben di sotto di 10 nm per evitare qualsiasi effetto topografica su adesione delle cellule e per consentire la chiara osservazione dell.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Griglie in nichel da 200 mesh Microscopia	elettronica Sciences	G200-Ni
Carta da filtro	Sigma-Aldrich	1001-055
Vetrini per microscopio	Fisher Scientific	10235612
Adesivi bianchi 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Dispositivo di colata di film con valvola in uscita	Microscopia elettronica Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Etanolo	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0,5% soluzione in dicloruro di etilene	Microscopia elettronica Sciences	15820
12 mm vetrini coprioggetti	VWR	631-0666
Microscopio invertito	Microscopio a forza atomica Carl Zeiss	Axiovert 200
	JPK Instruments	NanoWizard III
Porta campioni a temperatura controllata	JPK Instruments	BioCell
Cantilever in nitruro di silicio con una costante nominale della molla di 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Nastro biadesivo	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Piastre Petri con fondo in vetro da 35 mm	WPI	FD35-100