Articolo metodologico
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.
Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per la medicina rigenerativa e una piattaforma per lo studio di processi di sviluppo umani. Diretto graduale differenziazione che ricapitola i processi inerenti allo sviluppo è uno dei principali modi per generare cellule pancreatiche compreso pancreas/duodeno homeobox proteina 1+ (PDX1+) cellule progenitrici del pancreas. Protocolli convenzionali avviano la differenziazione con piccole colonie poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneita ', che potrebbero ostacolare la differenziazione per PDX1+ cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule. Il protocollo consiste di quattro passi e avvia la differenziazione di singole cellule dissociate di semina. L'induzione di SOX17+ cellule endoderma definitivo è stata seguita dall'espressione di marcatori di tubo due intestino primitivo, HNF1β e HNF4α ed eventuale differenziazione in PDX1+ cellule. Il presente protocollo fornisce la gestione facile e può migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare in modo inefficiente in endodermici lignaggi o PDX1+ cellule.
Il pancreas è costituito principalmente da cellule esocrine ed endocrine, e sua disfunzione o sovraccarico provoca diverse malattie, come la pancreatite, diabete e cancro del pancreas. Per delucidare il pathogeny di fibrocalcolosa, è necessario analizzare il processo di sviluppo e la funzione delle cellule pancreatiche. Inoltre, per stabilire la terapia di supplementazione di cellule/tessuti è necessaria una fornitura di cellulari stabili con qualità robusta. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per questi scopi, e il protocollo di differenziazione verso le cellule del pancreas è stato intensam....
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Gli esperimenti usando hPSCs sono stati approvati dal comitato etico del dipartimento di medicina e Graduate School of Medicine, Università di Kyoto.
1. preparazione dei materiali
Nota: Preparare tutti i terreni e reagenti per colture cellulari in ambiente sterile. Caldo a base di coltura a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso. Medio per differenziazione viene utilizzata all'interno di 6 h a RT. dettagli dei reagenti elencati nella Tabella materiali.
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Moltiplicazione delle hiPSCs (585A129,30) sono condensati e formano un monostrato omogeneo (Figura 1B) che è adatto per differenziazione. HiPSCs indifferenziato (stadio 0) sono dissociate e ri-seminato come singole cellule a densità bassa delle cellule (1-1.5 x 105 cellule/cm2). Entro 1 h, le cellule sono attaccate alla piastra e iniziano a mostrare la protrusione. Il giorno 1, le cellule sono moltiplicate e ben.......
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La generazione di PDX1+ cellule è composto da più passaggi; Pertanto, è fondamentale per il trattamento di cellule al momento opportuno. Tra i passaggi, l'efficienza di induzione dell'endoderma definitivo colpisce in gran parte l'efficienza finale induzione, possibilmente da interferenze provenienti da altre cellule lignaggio contaminanti (cioè, mesoderma ed ectoderma), che possono proliferare e/o secernono fattori che compromettere la differenziazione specifica. Se la proporzione di SOX17+ cellule .......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) attraverso Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) al T.T. e sovvenzione per assegnisti di ricerca pagine JSP (Javaserver KAKENHI Grant numero 17J07622) di A.K. e l'Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED) attraverso la sua ricerca concedere "Core Center for iPS Cell ricerca, centro di ricerca rete per realizzazione di medicina rigenerativa" per K.O. Gli autori ringraziano il Dr. Peter Karagiannis per leggere il manoscritto.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| acido 3-cheto-N-amminoetil-N′-amminocaproyldiidrocinnamoilciclopamina | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetraidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoico | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Provette da centrifuga sterili sterili coniche | in polipropilene Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anticorpo anti-CDX2 [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, &volte; 1/1000 diluizione |
| B-27 Integratore (50 &volte;) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Integratore senza siero |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | Per citometria a flusso | |
| Congelatore biomedico | SANYO | MDF-U538 | Per -30 ° C per la conservazione |
| dei vetrini per il conteggio delle cellule per il contatore di cellule TC10/TC20, a doppia camera | BIO-RAD | 1450011 | Vetrino per il conteggio |
| PIASTRA MULTIPOZZETTO PER COLTURA CELLULARE, 6 POZZETTI, PS, TRASPARENTE | Greiner bio-one | 657165 | Per la coltura di differenziazione/piastra a 6 pozzetti |
| Centrifuga | TOMY | AX-310 | Per la coltura cellulare |
| Centrifuga | TOMY | MX-305 | Per RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| PANCA PULITA | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Banco pulito |
| Corning CellBIND Piastra a 6 pozzetti | Corning | 3335 | Per colture senza alimentatore di hPSC/piastra a 6 pozzetti |
| Corning Matrigel Matrice della membrana basale Fattore di crescita ridotto | Corning | 354230 | Matrice della membrana basale |
| Corning Synthemax II-SC Substrato | Corning | 3535 | Per colture senza alimentatore di hPSC/materiale sintetico di superficie per hPSC |
| Criostato | Leica | Leica CM1510 S | Per l'immunocolorazione di aggregati. |
| Kit Cytofix/Cytoperm | Becton Dickinson | 554714 | tampone Perm/Wash è Permeabilizzazione/Tampone di lavaggio. Il tampone Cytofix/Cytoperm è un tampone di fissazione e permeabilizzazione. |
| Dako pen | Dako | S2002 | Per l'immunocolorazione di aggregati |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | Per RT-qPCR |
| Asino anti-IgG di capra (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Anticorpo secondario, &volte; 1/500 diluizione Asino |
| anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Anticorpo secondario, &volte; diluizione 1/500 |
| Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Anticorpo secondario, & volte; diluizione 1/500 |
| Siero d'asino | Merck Millipore | S30 | Siero d'asino |
| D-PBS(-) senza Ca o Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Per colture senza alimentatore di hPSC/terreno di mantenimento hPSC |
| Provetta in polistirene a fondo tondo Falcon da 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scatto | Corning | 352235 | Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL con filtro a celle |
| Puntale filtrante, 1.000 &; L | Watoson | 124-1000S | Utilizzare insieme alle pipette Puntale |
| con filtro, 20 &; L | Watoson | 124-P20S | Utilizzare insieme a pipette Puntale |
| con filtro, 200 &; micro; L | Watoson | 124-P200S | Utilizzare insieme alle pipette |
| Microscopio a fluorescenza | Keyence | BZ-X700 | Per l'immunocolorazione |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubatore | Thermo Fisher Scientific | 370A | |
| incubatore HNF-1β Anticorpo (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, &volte; 1/200 diluizione |
| HNF-4&alfa; Anticorpo (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, &volte; 1/200 diluizione |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Per la colorazione del nucleo, &volte; 1/200 diluizione |
| Pancreas umano RNA totale | Ambion | AM7954 | Per RT-qPCR |
| Umano PDX-1/IPF1 Anticorpo | R& D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, IgG di capra, &volte; 1/200 diluizione |
| Anticorpo umano SOX17 | R& D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, &volte; diluizione 1/200 |
| Zinco MEM migliorato Opzione media | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | |
| Camera di incubazione | Cosmo Bio | 10DO | Per l'immunocolorazione degli aggregati Guanti da |
| esplorazione in lattice | Adachi | ||
| MAS rivestito vetrino | scorrevole Matsunami Glass | 83-1881 | Per immunocolorazione degli aggregati |
| MicroAmp Piastra di reazione veloce a 96 pozzetti | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 | RT-qPCR | |
| Olympus | CKX41N-31PHP | Per la coltura cellulare | |
| Microtubo | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonale Anti-&alfa;-Fetoproteina | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, &volte; diluizione 1/200 |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | per RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Oligo su misura | Per RT-qPCR di sequenza è "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT |
| Paraformaldeide, polvere | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fissativo, diluito in DPBS |
| Frigorifero farmaceutico | SANYO | MPR-514 | per 4 ° C stoccaggio |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipetta | |
| Umana Ricombinante KGF/FGF-7 | R& D Systems | 251-KG | KGF |
| Noggin umana ricombinante | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Activina umana/topo/ratto ricombinante A | & D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μ L) | TOYOBO | TRT-101 | Per RT-qPCR |
| Set di DNasi senza RNasi (50) | QIAGEN | 79254 | Per RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | Per RT-qPCR |
| RPMI 1640 con L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Pellicola sigillante per Real Time | Takara | NJ500 | Per RT-qPCR |
| Pipette sierologiche 10 mL | Costar/Corning | 4488 | Per la coltura cellulare |
| Pipette sierologiche 25 mL | Costar/Corning | 4489 | Per la coltura cellulare |
| Pipette sierologiche 5 mL | Costar/Corning | 4487 | Per la coltura cellulare |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Segnalazione cellulare | 3579S | Anti-SOX2, &volte; 1/200 diluizione |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientifico | per RT-qPCR | |
| Saccarosio | Nacalai tesque | 30406-25 | Per immunocolorazione di aggregati |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B | per RT-qPCR |
| TC20 Contatore di cellule automatizzato | BIO-RAD | 1450101J1 | Contatore di cellule automatico |
| Tissue-Tek OCT composto 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | Per l'immunocolorazione di aggregati |
| Tissue-Tek Cryomold Stampi/Adattatori Sakura | Finetechnical | 4566 | Per l'immunocolorazione di aggregati |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Congelatore ultrafreddo | SANYO | MDF-U33V | Per -80 ° C che conserva |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Diluire con DPBS per preparare 0,5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | per RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
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